Luận án Đánh giá hiệu quả của kỹ thuật chuyển gen RNAi để tạo dòng lan Dendrobium có khả năng kháng virus khảm vàng (Cymbidium mosaic virus)

f1 origin
T7/M13F
orf2-4+CP_CyMV
T3/M13R
pUC origin
Ampcillin
 39 
- Các trình tự mồi dùng cho khuếch đại gen 
Mụ đí Tên m i Trình tự m i 
Sản 
phẩm 
(bp) 
Khuếch đại 
gen CP của 
virus 
CyMV 
F-CCP 5’- GGGATCCATGGGAGAGTCCACTCCAAC - 3’ 
672 
R-CCP 5’- GGAATTCTTATTCAGTAGGGGGTCCAGGC - 3’ 
Kiểm tra 
gen trong 
vector 
pJet1.2 
F-pJET1.2 5’- CGACTCACTATAGGGAGAGCGGC - 3’ 
807 
R-pJET1.2 5 - AAGAACATCGATTTTCCATGGCAG - 3’ 
Khuếch đại 
đoạn gen từ 
vector 
pBSK 
Fi-CORF2-4 5’- CACCGCGGCCAATATAAAGA - 3’ 
500 
Ri-CCP 5’- AGTCGACGGCATCGAAGAAG -3’ 
Khuếch đại 
đoạn gen 
CP 
F-CCP1 5’- CACCTGTCCGCCGCGCCTCTCTT - 3’ 
450 
R-CCP1 5’- TCCGGCTAAGCATATTATGC - 3’ 
Kiểm tra 
gen trong 
vector 
pENTR 
F-M13 5’-GTAAAACGACGGCCAG-3’ 
780/820 
R-M13 5’-CAGGAAACAGCTATGAC-3’ 
Phát hiện 
virus 
CyMV 
F-C 5’-GTCTCTGGAACATCTGCAAAGC-3’ 
257 
R-C 5’-CCGCATCTTACGGAGGTAGC-3’ 
Kiểm 
chứng PCR 
phát hiện 
gen 
Primer #1 5’- AGTTCGAGCCTGATTATCCC-3’ 
297 
Primer #2 5’- GCATGCCGCCAGCGTTCATC-3’ 
2.1.2. Nội dung nghiên cứu 
Nghiên cứu được thực hiện trên cây lan Dendrobium Sonia trưởng thành và 
virus CyMV gây bệnh trên hoa lan, bao gồm 5 nội dung chính: 
Nội dung 1: 
Nghiên cứu xây dựng quy trình chuyển gen vào PLBs lan Dendrobium Sonia 
qua trung gian vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens. 
 40 
Nội dung 2: 
Nghiên cứu phân lập, xác định trình tự gen CP của virus CyMV ở Việt Nam. 
Nội dung 3: 
Nghiên cứu thiết kế vector chuyển gen RNAi mang phân đoạn gen CP và 
gen ORF2-4+CP của virus CyMV. 
Nội dung 4: 
Nghiên cứu tạo cây lan chuyển gen mang cấu trúc RNAi của gen CP và gen 
ORF2-4+CP. 
Nội dung 5: 
Đánh giá khả năng kháng virus CyMV của cây lan chuyển gen bằng phương 
pháp lây nhiễm virus nhân tạo trong điều kiện in vitro. 
2.2. P ươ p áp ê ứu 
2.2.1. Xây dựng quy trình chuyển gen vào lan Dendrobium Sonia 
2.2.1.1. Xá đị á đ u kiện thích hợp để tạo PLBs phục vụ cho chuyển gen 
* Xác định nồng độ chất khử trùng và thời gian khử trùng thích hợp để 
tạo mẫu cấy in vitro 
Giả hành (thân) có mang chồi ngủ của các cây lan trồng ngoài vườn được sử 
dụng cho việc khử trùng. Tiến hành rửa sạch giả hành dưới vòi nước và gỡ bỏ lớp 
vỏ bao quanh chồi ngủ. Cắt giả hành thành từng đoạn ngắn có mang chồi ngủ ở giữa, 
cho vào bình (erlen) và lắc mẫu với xà phòng trong 5 phút. Sau khi rửa sạch xà 
phòng bằng nước cất, lắc mẫu với cồn 70% trong 30 giây. Tiếp theo, tiến hành khử 
trùng mẫu với dung dịch Ca(OCl)2 ở các nồng độ 15, 20, 25 và 30%, trong 20 phút. 
Cuối cùng, rửa lại mẫu bằng nước cất vô trùng (3 lần) trước khi cấy vào môi trường 
nuôi cấy. Sau khi khử trùng, cắt bỏ những phần mô chết ở hai đầu mẫu cấy và cấy 
vào môi trường MS [57]. Thí nghiệm được bố trí hoàn toàn ngẫu nhiên, lập lại 3 lần, 
với số mẫu là 10 đoạn thân cho mỗi nghiệm thức. Theo dõi tỷ mẫu cấy sống vô 
trùng sau 2 tuần nuôi cấy. 
 41 
* Xác định môi trường thích hợp để tạo PLBs từ mô cấy in vitro 
Đoạn thân ở vị trí giữa hai chồi ngủ của cây lan in vitro (cao 3-5 cm) được cô 
lập và cắt thành những lát mỏng (0,5 mm) theo hướng vuông góc với chiều dài đoạn 
thân. Các lát cắt mỏng sau đó được đặt nuôi cấy trên môi trường MS có bổ sung 
chất điều hòa sinh trưởng BA ở các nồng độ từ 0,1 - 0,3 mg/l kết hợp lần lượt với 
NAA ở các nồng độ từ 0,5 – 5 mg/l. Thí nghiệm được bố trí hoàn toàn ngẫu nhiên, 
lập lại 3 lần, với số mẫu là 5 lát cắt cho mỗi nghiệm thức. Theo dõi tỷ lệ mẫu cảm 
ứng với môi trường và sự xuất hiện PLBs trên các môi trường theo thời gian nuôi 
cấy. 
* Xác định môi trường thích hợp cho sự tăng sinh và phát triển PLBs 
Các PLBs (đường kính khoảng 1mm) được nuôi cấy trên môi trường MS có 
bổ sung BA ở các nồng độ 0,1; 0,3 và 0,5 mg/l kết hợp lần lượt với NAA ở nồng độ 
1 mg/l. Thí nghiệm được bố trí hoàn toàn ngẫu nhiên, lập lại 3 lần, với số mẫu là 5 
PLBs cho mỗi nghiệm thức. Theo dõi sự thay đổi số lượng và trọng lượng của 
PLBs theo thời gian nuôi cấy. 
2.2.1.2. Xá định n độ chất cảm ứng acetosyringone (AS), thờ a đ ng 
nuôi cấy và chủng vi khuẩn thích hợp cho việc chuyển gen vào PLBs 
* Chuẩn bị vi khuẩn cho chuyển gen 
Vi khuẩn được tăng sinh qua đêm trong 3 ml môi trường LB có bổ sung 
50mg/l kháng sinh kanamycin và 50mg/l rifamycin, ở 28°C, tốc độ lắc lắc 200 
vòng/ phút. Sau đó, hút 1 ml dịch tăng sinh chuyển vào 29 ml môi trường LB có bổ 
sung kháng sinh như trên và tiếp tục tăng sinh qua đêm ở cùng điều kiện và tốc độ 
lắc. Mẫu vi khuẩn sau khi tăng sinh, sẽ được kiểm tra OD để đảm bảo giá trị OD 
nằm trong khoảng từ 0,6 - 1, sau đó tiến hành ly tâm thu sinh khối vi khuẩn ở tốc độ 
8.000 vòng/ phút trong 15 phút. Sinh khối vi khuẩn thu được sau khi ly tâm được 
pha loãng với môi trường MS lỏng (cùng thể tích tăng sinh) có bổ sung chất cảm 
ứng AS ở các nồng độ 0, 50, 100, 200 và 300 M. 
 42 
* Chuẩn bị PLBs và thực hiện đồng nuôi cấy 
 Tiến hành tách riêng từng PLBs từ các cụm PLBs có nguồn gốc từ lát cắt 
mỏng thân của cây lan in vitro. Việc tách các PLBs được thực hiện trong môi 
trường MS lỏng. PLBs sau khi tách được ngâm trong môi trường MS có bổ sung 
chất cảm ứng AS ở các nồng độ 0, 50, 100, 200 và 300 M trong 15 phút ở 25oC. 
Sau đó, PLBs được chuyển sang ủ tiếp tục trong môi trường MS có bổ sung AS ở 
các nồng độ tương tự nhưng có bổ sung thêm vi khuẩn (đã thực hiện trong phần 
chuẩn bị vi khuẩn) trong 30 phút ở cùng nhiệt độ. Sau khi ủ, PLBs được làm khô 
nhẹ bằng cách đặt trên giấy thấm và chuyển sang đồng nuôi cấy trên môi trường MS 
rắn có bổ sung AS ở các nồng độ tương tự như môi trường ủ trong 1, 2, 3, 4 và 5 
ngày. Các đĩa Petri đồng nuôi cấy được đặt nuôi trong tối ở nhiệt độ 25 2oC, ẩm 
độ 55 5%. Thí nghiệm được bố trí hoàn toàn ngẫu nhiên, lặp lại 3 lần, với số mẫu 
là 10 PLBs cho mỗi nghiệm thức, và được thực hiện đồng thời với 3 chủng vi khuẩn 
A. tumefaciens khác nhau: C58, EHA105 và LBA4404. Đánh giá hiệu quả chuyển 
gen thông qua tỷ lệ mẫu dương tính GUS, được tính theo công thức: (số mẫu có 
biểu hiện gen GUS/số mẫu xử lý chuyển gen)*100%. 
* Đánh giá hiệu quả chuyển gen thông qua nhuộm GUS 
Sau khi đồng nuôi cấy, PLBs được nhuộm GUS với quy trình được cải tiến 
theo Jeffeson và cs, 1978 [40]. Theo đó, PLBs được chuyển vào các tube (1,5 ml) 
có chứa thuốc nhuộm GUS, ủ ở nhiệt độ 37oC trong 72 giờ. Sau đó, loại bỏ thuốc 
nhuộm, ngâm mẫu với ethanol 70% cho đến khi diệp lục mất hoàn toàn (ít nhất sau 
4 giờ). Cuối cùng, đánh giá sự biểu hiện màu của PLBs và chụp ảnh dưới kính hiển 
vi soi nổi (Olympus). 
2.2.1.3. Xá đị đ u kiện thích hợp để loại vi khuẩn và sàng l c PLBs chuyển gen 
* Xác định nồng độ cefotaxime thích hợp để loại vi khuẩn từ PLBs 
Sau khi đồng nuôi cấy với vi khuẩn (chủng LBA4404) 3 ngày, PLBs được 
rửa 3 lần với nước cất vô trùng và rửa tiếp 1 lần với môi trường MS lỏng có bổ sung 
cefotaxime nồng độ 0, 300, 500 và 700 mg/l. Sau khi rửa, làm khô nhẹ bề mặt PLBs 
bằng giấy thấm và đặt nuôi cấy trên môi trường MS rắn có bổ sung cefotaxime ở 
 43 
các nồng độ tương tự như môi trường lỏng. Thí nghiệm được bố trí hoàn toàn ngẫu 
nhiên, lặp lại 3 lần với số mẫu là 10 PLBs cho mỗi nghiệm thức. Theo dõi và ghi 
nhận tỷ lệ mẫu sống và sạch khuẩn ở các môi trường theo thời gian. Xác định nồng 
độ cefotaxime thích hợp cho việc loại vi khuẩn sau khi thực hiện đồng nuôi cấy. 
* Xác định nồng độ hygromycin thích hợp để sàng lọc PLBs chuyển gen 
Các PLBs được nuôi cấy trên môi trường MS rắn có bổ sung 0,3 mg/l BA, 1 
mg/l NAA và hygromycin ở các nồng độ 0, 5, 7, 10 và 15 mg/l. Thí nghiệm được 
bố trí hoàn toàn ngẫu nhiên, lặp lại 3 lần, với số mẫu là 10 PLBs cho mỗi nghiệm 
thức. Theo dõi và ghi nhận tỷ lệ PLBs chết theo thời gian để xác định nồng độ 
hygromycin thích hợp (giết chết hoàn toàn PLBs không chuyển gen) cho việc sàng 
lọc PLBs chuyển gen. 
* Xác định nồng độ kanamycin thích hợp để sàng lọc PLBs chuyển gen 
Các PLBs được nuôi cấy trên môi trường MS rắn có bổ sung 0,3 mg/l BA, 1 
mg/l NAA và kanamycin ở các nồng độ 0, 100, 200, 300, 400, 500 và 700 mg/l. Thí 
nghiệm được bố trí hoàn toàn ngẫu nhiên, lặp lại 3 lần với số mẫu là 10 PLBs cho 
mỗi nghiệm thức. Theo dõi và ghi nhận tỷ lệ PLBs chết theo thời gian để xác định 
nồng độ kanamycin thích hợp (giết chết hoàn toàn PLBs không chuyển gen) cho 
việc sàng lọc PLBs chuyển gen. 
2.2.2. Phân lập và xá định trình tự gen CP của virus CyMV 
2.2.2.1. Thu thập mẫu lan nhiễm virus 
Quan sát và chọn các cây lan có biểu hiện các triệu chứng nhiễm virus 
CyMV (khảm vàng lá, hoại tử lá, khảm màu hoa và hoại tử hoa, ), dùng kéo cắt 
các lá có biểu hiện triệu chứng, cho vào bao nilon có lót giấy giữ ẩm và chuyển về 
phòng thí nghiệm. Tại phòng thí nghiệm, lá sẽ được được rửa với nước sạch, làm 
khô bề mặt bằng giấy thấm ẩm, sau đó đặt vào hộp nhựa chuyên dùng (Lock & lock) 
và bảo quản trong tủ lạnh âm sâu (-80oC) (Sanyo). Việc thu mẫu được tiến hành tại 
các vườn lan ở một số tỉnh của Việt Nam như Thành phố Hồ Chí Minh, Đà Lạt, Hà 
Nội, Bắc Giang và Thái Nguyên; mỗi tỉnh thu mẫu từ 2-3 địa điểm khác nhau, với 
số lượng mẫu tối thiểu là 3 mẫu/địa điểm. 
 44 
2.2.2.2. Phân lập gen CP 
* Ly trích RNA virus từ mẫu lá 
Các mẫu lá sau khi thu nhận từ vườn lan được sử dụng cho việc ly trích RNA 
virus. Quy trình ly trích được tiến hành theo phương pháp sucrose (Berendzen và cs, 
2005) [22], theo đó, mẫu lá (1 x 1cm) đuợc cho vào tube có chứa sẵn 100µl dung 
dịch sucrose. Nghiền mẫu bằng chày ở nhiệt độ phòng, sau đó bổ sung thêm 100 µl 
dung dịch sucrose. Ðun mẫu ở 100oC trong 10 phút, sau khi đun, đặt vào đá 5 phút. 
Ly tâm ở tốc độ 13.000 vòng/ phút trong 3 phút, sau khi ly tâm, loại bỏ cặn, hút lấy 
dịch nổi. Dịch trích được bảo quản ở nhiệt độ -20oC để dùng cho phản ứng RT-PCR. 
* Thực hiện phản ứng RT-PCR 
Sau khi ly trích RNA, thực hiện phản ứng RT-PCR (sử dụng máy PCR 
thermo cyler - Takara) để khuếch đại gen CP với cặp mồi F-CCP và R-CCP. Phản 
ứng được thực hiện với thể tích 25 μl, bao gồm 0,5 µl icrispt revers transcriptase 
(Biorad), 2,5 μl pfu polymerase buffer (10X), 0,5 μl pfu polymerase (2,5U ), 0,75 μl 
MgCl2 (50 mM), 0.5 µl dNTP (25 mM), 18,25 μl H2O, 0,5 μl mỗi loại mồi xuôi và 
mồi ngược (10µM), và 1 μl RNA (ly trích từ lá lan – mẫu), hay 1 μl H2O (đối chứng 
âm). Chương trình nhiệt được thiết lập với 1 chu kỳ 50oC/ 10 phút (tổng hợp 
cDNA), 1 chu kỳ 95oC/ 5 phút; 35 chu kỳ 95oC/ 15 giây, 53oC/ 30 giây, 72oC/ 1 
phút, và 1 chu kỳ kéo dài cuối cùng 72oC/ 15 phút. Kết quả phản ứng được phân 
tích bằng điện di trên gel agarose 1,5%, nhuộm với ethidium bromide (1ng/ μl) 15 
phút, và cuối cùng quan sát sự xuất hiện của các băng DNA trên gel bằng máy 
Geldoc (Biorad). 
2.2.2.3. Nhân dòng gen CP 
* Tạo vector tái tổ hợp 
Đoạn gen CP của CyMV sau khi được phân lập bằng phản ứng RT-PCR 
được gắn vào vector nhân dòng pJET1.2 bằng bộ kit CloneJETTM PCR Cloning Kit 
(Fermentas). Phản ứng gắn được thực hiện với thể tích 20 µl, chứa 10 µl reaction 
buffer (2X), 2 µl sản phẩm PCR, 1 µl pJET 1.2 blunt cloning vector (50 ng/ µl), 19 
 45 
µl H2O, và 1 µl T4 ligase. Sau khi cho đầy đủ các thành phần phản ứng, vortex 
nhanh, ly tâm 3-5 giây và sau cùng ủ ở nhiệt độ phòng trong 15 phút. 
* Biến nạp vector tái tổ hợp vào tế bào E.coli DH5α 
Vector sau khi đã được gắn gen CP được sử dụng để biến nạp vào chủng vi 
khuẩn nhân dòng E.coli DH5α. Quy trình biến nạp được thực hiện bằng cách cho 5 
µl plasmid vào tube (1,5 ml) chứa sẵn 100 µl tế bào E.coli DH5α khả nạp và ủ trong 
đá lạnh 30 phút; tiếp theo tiến hành xử lý sốc nhiệt ở 42oC trong 90 giây, sau đó ủ 
lại vào đá lạnh trong 1-2 phút. Sau cùng, cho toàn bộ dung dịch chứa tế bào đã được 
biến nạp vào môi trường LB lỏng (250 µl) và nuôi cấy trong 2 giờ. 
* Sàng lọc dòng tế bào có mang vector tái tổ hợp 
Dịch tế bào sau khi nuôi cấy (100 µl) được cấy trải trên đĩa petri chứa môi 
trường LB bổ sung 50 µg/ml ampicillin, nuôi cấy qua đêm ở 37oC. Các dòng tế bào 
vi khuẩn mọc được trên môi trường chứa kháng sinh sẽ được sử dụng cho việc kiểm 
tra đoạn gen nhân dòng. 
* Kiểm tra hiệu quả nhân dòng 
Khuẩn lạc của các dòng tế bào mọc được trên môi trường kháng sinh được 
sử dụng để tiến hành phản ứng PCR kiểm tra đoạn gen được gắn vào plasmid. Phản 
ứng PCR được thực hiện với cặp mồi của đoạn gen (mồi nhân dòng) và cặp mồi của 
vector (pJET1.2: mồi xuôi: 5’-CGACTCACTATAGGGAGAGCGGC-3’, mồi 
ngược 5’-AAGAACATCGATTTTCCATGGCAG-3’). Thành phần phản ứng (25 μl) 
bao gồm 0,5 μl taq polymerase (2,5U) 2,5 μl taq polymerase buffer (10X), 0,75 μl 
MgCl2 (50 mM), 0,5 µl dNTP (25 mM), 18,75 μl H2O, 0,5 μl mỗi loại mồi xuôi và 
mồi ngược (10 μM), và 1 μl mẫu DNA plasmid. Chương trình nhiệt được thiết lập 
với 1 chu kỳ 95oC/ 5 phút; 35 chu kỳ 95oC/ 15 giây, 53oC/ 30 giây, 72oC/ 1 phút và 
1 chu kỳ kéo dài cuối cùng 72oC/ 15 phút. Kết quả phản ứng được phân tích bằng 
điện di trên gel agarose 1,5% (tương tự mục 2.2.2.2). 
 46 
Ngoài ra, plasmid thu nhận từ vi khuẩn (sử dụng bộ kit DNA-SpinTM Plasmid 
DNA Purification, Intron) còn được cắt với enzyme cắt hạn chế BamHI và EcoRI 
cho mục đích kiểm tra. Phản ứng cắt được thực hiện với thể tích 10 l, bao gồm 1 
l buffer, 0,5 l enzyme BamHI, 0,5 l enzyme EcoRI, 3 l DNA plasmid và 5 l 
H2O. Hỗn hợp phản ứng được ủ ở 37
o
C trong 2 giờ trước khi điện di và kiểm tra sản 
phẩm cắt trên gel agarose 1,5%. 
2.2.2.4. Giải trình tự gen CP và phân tích sự ươ đ ng của các trình tự 
Dòng vi khuẩn mang gen mục tiêu được tăng sinh qua đêm trong môi trường 
LB lỏng; ly tâm (4.000 vòng, 7 phút ) thu sinh khối vi khuẩn và tiến hành tách 
plasmid bằng bộ kit DNA-SpinTM Plasmid DNA Purification Kit (Intron). Plasmid 
thu được từ dòng vi khuẩn nêu trên được giải trình tự (Công ty Macrogen - Hàn 
Quốc) để kiểm tra trình tự của đoạn gen đã được nhân dòng. Kết quả giải trình tự 
được so sánh với các trình tự đã được công bố trên ngân hàng gen NCBI. Các trình 
tự thu được cũng được phân tích để đánh giá mức độ tương đồng giữa các chủng 
virus phân lập ở các khu vực khác nhau bằng chương trình BLAST. 
2.2.3. T ế kế e ể e N b ế ạp A. tumefaciens 
2.2.3.1. Tạo vector pENTRTM/D-TOPO® có gắn gen CP hoặc ORF2-4+CP 
 Thực hiện phản ứng PCR với cặp mồi Fi-CORF2-4/ Ri-CCP hoặc F-CCP1/ 
R-CCP1 để khuếch đại đoạn gen ORF+CP và CP từ các vector mang gen tương ứng. 
Thành phần phản ứng PCR và chu trình nhiệt được thực hiện tương tự như phần 
kiểm tra hiệu quả nhân dòng (thuộc mục 3.2.2.3), với nhiệt độ bắt cặp mồi là 55oC. 
Sản phẩm PCR được làm sạch với bộ kit QIA quick Gel Extraction (Qiagen) và nối 
vào vector tách dòng bằng bộ kit pENTRTM Directional TOPO® Cloning 
(Invitrogen). Phản ứng nối được thực hiện với thể tích 6 µl, chứa 0,5 µl sản phẩm 
PCR, 1 µl dung dịch muối, 1 µl vector TOPO và 3,5 µl H2O. Hỗn hợp phản ứng 
được ủ 15 phút ở 22oC. Sản phẩm phản ứng được biến nạp vào tế bào khả nạp E. 
coli One Shot TOP10 và cấy trải trên môi trường LB bổ sung 50 mg/l kanamycin. 
Quy trình biến nạp và sàng lọc dòng tế bào có mang vector được thực hiện tương tự 
như phần nhân dòng gen CP (mục 2.2.2.3). 
 47 
 Các dòng vi khuẩn có mang vector tái tổ hợp được kiểm tra gen mục tiêu 
bằng phương pháp PCR khuẩn lạc với với cặp mồi của vector (M13, nhiệt độ bắt 
cặp mồi 45oC). Phản ứng PCR khuẩn lạc được thực hiện tương tự như phần nhân 
dòng gen CP (mục 2.2.2.3). 
 Plasmid thu nhận từ vi khuẩn cũng được cắt với enzyme cắt hạn chế SalI 
(trên gen) và NotI (trên vector) (Phụ lục 5) cho mục đích kiểm tra. Phản ứng cắt 
được thực hiện với thể tích 10 l, bao gồm 1 l buffer, 0,5 l enzyme SalI, 0,5 l 
enzyme NotI, 3 l DNA plasmid và 5 l H2O. Hỗn hợp phản ứng được ủ ở 37
o
C 
trong 2 giờ trước khi điện di và kiểm tra sản phẩm cắt trên gel agarose 1,5%. 
2.2.3.2. Thiết kế vector chuyển gen RNAi mang đ ạn gen CP và ORF2-4+CP 
bằng hệ th ng Gateway 
 Kỹ thuật Gateway là một phương pháp nhân dòng phổ biến, hữu ích cho 
những đặc tính tái tổ hợp đặc hiệu vị trí của vi khuẩn lambda để cung cấp một cách 
hiệu quả, nhanh và nhạy cho việc gắn trình tự DNA vào hệ thống vector. Vector 
pK7GWIWG2(II) là vector chuyển gen mang cấu trúc đặc biệt, có hai vùng chứa 
cấu trúc attR1-ccdB-attR2 ngược chiều, được nối với nhau bởi một đoạn intron. Vì 
vậy, sản phẩm của phản ứng LR là một plasmid pK7GWIWG2(II)-gen với hai vị trí 
tái tổ hợp mang đoạn gen có chiều sense-intron-antisense (hay gen-intron- antigen). 
Đoạn intron này có vai trò rất quan trọng trong việc tạo cấu trúc vòng (loop) để 
RNA mạch kép (gen-antigen) dễ hình thành. Đây chính là cấu trúc RNAi cần thiết 
kế, có vai trò kháng lại sự lây nhiễm của virus trong tế bào vật chủ khi nó được 
chuyển một cách ổn định vào bộ gen. 
 Sau khi đoạn gen cần quan tâm đã gắn vào vector pENTR (có hai điểm tái tổ 
hợp attL1 và attL2 ở hai đầu của vị trí đoạn gen được chèn vào). Tiến hành phản 
ứng tái tổ hợp (LR) giữa vector pENTR tái tổ hợp và vector pK7GWIWG2(II) (có 
mang các điểm tái tổ hợp attR1 và attR2) để chuyển đoạn gen quan tâm vào vector 
pK7GWIWG2(II). Sự tái tổ hợp xảy ra giữa các vị trí attL1 và attR1, cũng như 
attL2 và attR2 giúp chuyển đoạn gen quan tâm từ vector pENTR tái tổ hợp vào vị 
trí mong muốn trên vector pK7GWIWG2(II). Phản ứng tái tổ hợp được thực hiện 
 48 
với bộ kit Gateway® LR ClonaseTM II Enzyme mix (Invitrogen). Thành phần phản 
ứng bao gồm 1 µl vector pENTR tái tổ hợp (50-150 ng), 0,5 µl vector 
pK7GWIWG2(II) (150 ng/l), 2,5 µl H2O, và 2 µl enzym LR clonase
TM
. Hỗn hợp 
phản ứng được ủ ở 25oC trong 90 phút, sau đó bổ sung thêm 1 µl dung dịch 
proteinase K và ủ ở 37oC trong 10 phút để kết thúc phản ứng. 
 Sản phẩm phản ứng được biến nạp vào tế bào khả nạp E. coli One Shot 
TOP10 và cấy trải trên môi trường LB bổ sung 100 mg/l spectinomycin. Các dòng 
vi khuẩn có mang vector tái tổ hợp được kiểm tra gen mục tiêu bằng phương pháp 
PCR khuẩn lạc với cặp mồi của đoạn gen (F-CCP1 và R-CCP1 cho trường hợp gen 
CP hay Fi CORF2-4 và Ri-CCP cho trường hợp gen ORF2-4+CP) và cắt với 
enzyme cắt hạn chế XbaI và HindIII (nằm trên vector) (Phụ lục 5). Quy trình biến 
nạp và sàng lọc dòng tế bào có mang vector, phản ứng PCR khuẩn lạc và phản ứng 
cắt bằng enzyme cắt hạn chế được thực hiện tương tự như phần tạo vector pENTR 
(mục 2.2.3.1). 
2.2.3.3. Tạo chủng A. tumefaciens mang vector chuyển gen RNAi 
pK7GWIWG2(II)/CP hoặc pK7GWIWG2(II)/ORF2-4+CP 
Vector (pK7GWIWG2(II)-CP hoặc pK7GWIWG2(II)-ORF2-4+CP được 
biến nạp vào tế bào khả nạp A. tumefaciens chủng C58 bằng phương pháp xung 
điện. Tế bào vi khuẩn sau khi biến nạp được sàng lọc trên môi trường chứa 50 mg/l 
ampicilin, 100 mg/l spectinomycin và 50 mg/l rifamycin. 
2.2.4. Tạ la ể e ma ấ ú N ủa e CP và ORF2-4+CP 
2.2.4.1. Nuôi cấ ă s k ẩn 
Vi khuẩn được tăng sinh qua đêm trong môi trường LB có bổ sung 50 mg/l 
ampicilin, 100 mg/l spectinomicin và 50 mg/l rifamycin. Sau đó, hút 1 ml dịch tăng 
sinh chuyển vào 29 ml môi trường LB có bổ sung kháng sinh như trên và tiếp tục 
tăng sinh qua đêm ở cùng điều kiện và tốc độ lắc. Các mẫu vi khuẩn sau khi tăng 
sinh được sử dụng cho thí nghiệm chuyển gen. 
 49 
2.2.4.2. Chuyển cấu trúc RNAi của đ ạn gen CP hoặc ORF2-4+CP vào PLBs 
qua trung gian vi khuẩn A. tumefaciens 
* Chuẩn bị vi khuẩn cho chuyển gen 
Mẫu vi khuẩn sau khi tăng sinh được kiểm tra OD để đảm bảo giá trị OD 
nằm trong khoảng từ 0,6 - 1, sau đó tiến hành ly tâm thu sinh khối ở tốc độ 8.000 
vòng/ phút trong 15 phút. Sinh khối vi khuẩn thu được sau khi ly tâm được pha 
loãng với môi trường MS lỏng (cùng thể tích tăng sinh) có bổ sung chất cảm ứng 
AS ở nồng độ 100 M. 
* Chuẩn bị PLBs và thực hiện đồng nuôi cấy 
Tiến hành tách riêng từng PLBs từ các cụm PLBs có nguồn gốc từ lát cắt 
mỏng thân của cây lan Dendrobium Sonia in vitro. Việc tách các PLBs được thực 
hiện trong môi trường MS lỏng. PLBs sau khi tách được ngâm trong môi trường 
MS + 100 M AS trong 15 phút, ở 25oC. Sau đó, PLBs được chuyển sang ủ tiếp tục 
trong môi trường MS +