Luận án Đánh giá sự thay đổi tăng sinh và cấu trúc khung xương tế bào gốc trung mô cuống rốn người trong điều kiện vi trọng lực mô phỏng

 thu 
hoạch được giữ lạnh ở 4ºC và được bổ sung 250 µl dung dịch BL + TG Buffer, hút 
lên xuống đều để ly giải tế bào. Sau đó, 85 µl Isopropanol 100% được cho vào ống 
tế bào, trộn đều trong 5 giây. Dịch tế bào sau khi ly giải được cho vào cột 
Minicolumn có chứa màng lọc và ly tâm với tốc độ 11.000 vòng/phút trong 30 giây 
ở 20ºC. Dịch thải ra qua ống thu được loại bỏ. RNA bám trên màng lọc của cột 
Minicolumn được rửa với 500 µl dung dịch RNA Wash Solution bằng cách ly tâm 
với tốc độ 11.000 vòng/phút trong 30 giây. Cột Minicolumn chứa mẫu RNA được ủ 
với 30 µl DNase I incubation mix trong 15 phút ở 20ºC, sau đó được rửa với 200 µl 
Column Wash Solution và ly tâm với tốc độ 11.000 vòng/phút trong 15 giây. Cột 
chứa mẫu được bổ sung 500 µl RNA Wash Solution và ly tâm với tốc độ 11.000 
vòng/phút trong 30 giây, dịch thải qua ống được loại bỏ. Cột Minicolumn được 
chuyển sang ống thu mới, được bổ sung 300 µl RNA Wash Solution vào cột và ly 
tâm với tốc độ 11.000 vòng/phút trong 2 phút. Cột Minicolumn tiếp tục được 
41 
chuyển sang ống eppendorf sạch và được bổ sung 50 µl nước cất Nuclease-Free 
Water, ly tâm với tốc độ 11.000 vòng/phút trong 1 phút để thu RNA. Các mẫu RNA 
thu được được trữ trong Nitơ lỏng trước khi tiến hành chạy Realtime qRT-PCR. 
Biểu hiện mức độ phiên mã của các gene liên quan đến chu kì tế bào được 
đánh giá bằng phương pháp Realtime qRT-PCR. Các gene được đánh giá bao gồm 
CDK2, CDK6, Cyclin A. Gene GAPDH được sử dụng để làm đối chứng. Phản ứng 
Realtime qRT-PCR được chạy bằng máy Real-Time PCR System (Thermo 
Scientific, Mỹ), sử dụng kit 2x qPCR SyGreen 1-Step Go Hi-ROX kit (PB25.32.03, 
PCRBiosystem, Anh). Mỗi phản ứng có tổng thể tích là 20 μl bao gồm 1 μl RNA 
mẫu, 2 μl mồi xuôi và ngược, 10 μl 2X Mix Hi-ROX, 1 μl RTAsevà 6 μl dH2O. 
Chu trình nhiệt của phản ứng như trong Bảng 2.4. Các cặp mồi đặc trưng cho các 
gene khảo sát được thể hiện trong Bảng 2.5. Giá trị Ct của mẫu được tính bằng 
phương pháp 2−ΔΔCt [111]. 
Phương pháp 2-∆∆Ct (Livak) (Real-time PCR Applications Guide – Biorads) 
được áp dụng để đánh giá mức độ biểu hiện tương đối sự biểu hiện gene [111]. 
Phương pháp này giả định rằng cả gene đích và gene tham chiếu được khuếch đại 
với hiệu quả gần 100% và trong phạm vi 5% của mỗi gene. Để xác định sự khác 
biệt tương đối trong mức độ biểu hiện của gene đích ở các mẫu khác nhau, phương 
pháp 2
-∆∆Ct
 được thực hiện theo các bước sau: 
- Chuẩn hóa giá trị CT của gene mục tiêu với gene tham khảo cho cả mẫu thí 
nghiệm và mẫu hiệu chỉnh: 
∆CT(mẫu) = CT(mục tiêu, mẫu)
- CT(tham chiếu, mẫu) 
∆CT(chuẩn) = CT(mục tiêu, chuẩn)
- CT(tham chiếu, chuẩn) 
- Chuẩn hóa giá trị ∆CT của mẫu thí nghiệm với ∆CT của mẫu chuẩn 
∆∆CT = ∆CT(mẫu) - ∆CT(chuẩn) 
- Cuối cùng, tỉ lệ biểu hiện được tính theo công thức: 
Tỉ lệ biểu hiện = 2-∆∆Ct 
Kết quả thu được là sự tăng (hay giảm) theo tỷ lệ của gene đích trong mẫu thí 
nghiệm tương quan với mẫu chuẩn và được chuẩn hóa theo sự biểu hiện của gene 
tham chiếu. Chuẩn hóa sự biểu hiện của gene đích theo gene tham chiếu bù đắp cho 
những khác biệt về lượng tế bào mẫu. Trong nghiên cứu này, gene GAPDH được sử 
42 
dụng làm gene tham chiếu để đánh giá mức độ biểu hiện của các gene CDK2, 
CDK6, Cyclin A. 
Bảng 2.4. Chu trình nhiệt của phản ứng Realtime qRT-PCR cho các gene điều hòa 
chu kì tế bào 
Bảng 2.5. Trình tự mồi các gene điều hòa chu kì tế bào 
Đánh giá biểu hiện mức dịch mã các gene điều hòa chu kỳ tế bào: 
Trong nội dung nghiên cứu này, mức độ biểu hiện của các protein liên quan 
đến chu kì tế bào bao gồm Cyclin A1+A2, CDK4, CDK6 được đánh giá bằng 
Phản ứng Nhiệt độ Thời gian 
Chuyển hóa RNA thành DNA 45ºC 15 phút 
Tách mạch 95ºC 2 phút 
40 chu kì 
95ºC 10 giây 
62°C 15 giây 
71 chu kì 60°C 30 giây 
Trữ mẫu 4°C 30 phút 
Gene Trình tự mồi 
Tài liệu tham 
khảo 
CDK2 
F: 5’-CCAGGAGTTACTTCTATGCCTGA-3’ 
R: 5’-TTCATCCAGGGGAGGTACAAC-3’ 
[112] 
CDK6 
F: 5’-TCTTCATTCACACCGAGTAGTGC-3’ 
R: 5’-TGAGGTTAGAGCCATCTGGAAA-3’ 
[112] 
Cyclin A 
F: 5’-GCCATTAGTTTACCTGGACCCAGA-3’ 
R: 5’-CACTGACATGGAAGACAGGAACCT-3’ 
[113] 
GAPDH 
F: 5’-CATGAGAAGTATGACAACAGCCT-3’ 
R: 5’-AGTCCTTTCCACGATACCAAAGT-3’ 
[114] 
43 
phương pháp Western Blot. Protein GAPDH được sử dụng làm đối chứng. Các 
bước thực hiện bao gồm: ly giải protein, điện di SDS-PAGE, chuyển màng PVDF, 
khóa màng, ủ kháng thể sơ cấp, ủ kháng thể thứ cấp, hiện phim. 
hucMSC sau khi thu hoạch được ly giải bằng Optiblot LDS Sample Buffer 
(ab119196, Abcam, Mỹ) ở bể ổn nhiệt 70°C trong 10 phút. Protein thu được từ các 
mẫu được chuyển với lượng bằng nhau vào các giếng của gel Precast Gel SDS-
PAGE 4-12% (ab139596, Abcam, Mỹ) và được điện di trong Optiblot SDS Run 
Buffer (ab119197, Abcam, Mỹ) trong 2 giờ ở 50 V. Bể điện di được giữ lạnh bằng 
đá gel để tránh sự thoái hóa protein. Protein đã được phân tách trong Precast Gel 
SDS-PAGE được chuyển lên màng PVDF (ab133411, Abcam, Mỹ), được kẹp bởi 
một lớp giấy lọc Extra Thick Blot Paper (1703966, Bio-Rad, Mỹ) và một lớp bọt 
biển ở mỗi bên và đặt cố định vào cassette (Hình 2.6). Cassette này được đặt vào bể 
điện di chứa buffer TBST sao cho mặt gel nằm ở phía cực âm (cathode) và màng 
PVDF nằm phía cực dương (anode)và được điện di trong 2 giờ ở 50 V. 
Hình 2.6. Phương pháp chuyển màng PVDF 
44 
Màng PVDF sau đó được khóa màng qua đêm ở 4ºC trong Blocking Buffer 
(ab126587, Abcam, Mỹ). Màng PVDF này tiếp tục được ủ với kháng thể sơ cấp 
trong Blocking Buffer qua đêm ở 4ºC. Các kháng thể được sử dụng bao gồm: Anti-
Cyclin A1 + Cyclin A2 antibody (ab185619, Abcam, Mỹ), Anti-CDK4 antibody 
(ab137675, Abcam, Mỹ)và Anti-CDK6 antibody (ab124821, Abcam, Mỹ) được pha 
loãng với tỉ lệ 1:5000; kháng thể Anti-GAPDH antibody (ab181602, Abcam, Mỹ) 
cho protein GAPDH được pha loãng với tỉ lệ 1:5000. Sau khi ủ qua kháng thể sơ 
cấp, màng PVDF được rửa 3 lần, mỗi lần 10 phút với dung dịch TBST. Màng này 
sau đó được ủ với kháng thể thứ cấp Goat Anti-Rabbit IgG (HRP) (ab6721, Abcam, 
Mỹ) trong Blocking Buffer ở nhiệt độ phòng trong 1 giờ. 
Các vạch protein được hiển thị bằng ECL Western Blotting Substrate Kit 
(ab65623, Abcam, Mỹ). Màng PVDF được cố định trên cassette. Dung dịch A và B 
được trộn đều với tỉ lệ 1:1 và nhỏ trực tiếp lên màng PVDF với thể tích 0,125 
ml/cm
2
 diện tích màng. Màng được ủ trong 1 phút ở nhiệt độ phòng. Dung dịch hiển 
thị ECL được hút bỏ trước khi tiến hành quá trình hiện phim. 
Kết quả Western Blot trong nghiên cứu này được hiển thị bằng phương pháp 
hiện phim sử dụng kit AUTOMATIC X-RAY (873498, Fujifilm, Nhật Bản). Quá 
trình hiện phim được thao tác trong phòng tối. Tấm phim CL-XPosure Film (34090, 
Thermo Scientific, Mỹ) được đặt lên màng PVDF và ủ trong 1 phút. Sau đó, phim 
được nhúng vào dung dịch Develope trong 15 giây và chuyển qua dung dịch Fixing 
trong 15 giây. Cuối cùng, phim được rửa bằng nước cất trong 30 giây. Các vạch 
protein phát huỳnh quang trên màng PVDF được hiển thị âm bản trên phim. Phần 
mềm ImageJ (National Institutes of Health, Bethesda, Mỹ) được dùng để đo cường 
độ của các vạch protein trong kết quả hiện phim [115]. 
2.2.5. Đánh giá quá trình apoptosis 
2.2.5.1. Thu hoạch tế bào 
Quá trình thu hoạch tế bào được thực hiện như ở Mục 2.2.4.2. Đánh giá chu 
kỳ tế bào, phần Thu hoạch tế bào. 
2.2.5.2. Đánh giá tỉ lệ apoptosis 
45 
Tế bào hucMSC sau khi thu hoạch được xử lý với FITC Annexin V 
Apoptosis Detection Kit I (BD Biosciences, Mỹ) để đánh giá tỉ lệ apoptosis. 
Eppendorf chứa tế bào được ủ với dung dịch chứa 100 ml Binding Buffer 1X, 5 μl 
PI và 5 μl FITC trong 25 phút ở nhiệt độ phòng, tránh ánh sáng. Sau đó, mẫu tế bào 
được bổ sung thêm 400 μl Binding Buffer 1X và được phân tích bởi hệ thống máy 
BD Accuri C6 flow cytomete (BD Biosciences, Mỹ). Những tế bào đang trong quá 
trình apoptosis sẽ được thể hiện bằng tỉ lệ các tế bào dương tính với Annexin- V-
FITC và các tế bào dương tính với PI. 
2.2.5.3. Đánh giá biểu hiện mức phiên mã các gene liên quan đến apoptosis 
Biểu hiện mức độ phiên mã của các gene liên quan đến apoptosis được đánh 
giá bằng phương pháp Realtime qRT-PCR. Các gene được đánh giá bao gồm Bax 
và Bcl-2. Gene GAPDH được sử dụng để làm đối chứng. Quá trình thực hiện thí 
nghiệm tương tự như ở Mục 2.2.4.2. Đánh giá chu kỳ tế bào, phần Đánh giá biểu 
hiện mức phiên mã các gene điều hòa chu kỳ tế bào. Chu trình nhiệt của phản ứng 
như trong Bảng 2.6. Các cặp mồi đặc trưng cho các gene khảo sát được thể hiện 
trong Bảng 2.7. Giá trị Ct của mẫu được tính bằng phương pháp 2
−ΔΔCt
 [111]. 
Bảng 2.6. Chu trình nhiệt của phản ứng Realtime qRT-PCR cho các gene liên quan 
đến apoptosis 
Bảng 2.7. Trình tự mồi các gene liên quan đến sự apoptosis 
Phản ứng Nhiệt độ Thời gian 
Chuyển hóa RNA thành DNA 45ºC 15 phút 
Tách mạch 95ºC 2 phút 
40 chu kì 
95ºC 10 giây 
52,2°C 15 giây 
71 chu kì 60°C 15 giây 
Trữ mẫu 4°C 30 phút 
Gene Trình tự mồi Tài liệu 
46 
2.2.6. Đánh giá sự thay đổi hình thái nhân và tế bào chất 
2.2.6.1. Thu hoạch và cố định tế bào 
Sau thử nghiệm vi trọng lực, các đĩa 96 giếng chứa tế bào hucMSC được rút 
bỏ môi trường và rửa 3 lần với PBS. Mỗi giếng tế bào được rửa 3 lần với 100 µl 
PBS (PBS-10XA, Capricorn Scientific, Đức). 50 µl 4% Paraformaldehyde 
Phosphate Buffer Solution (09154-85, Nacalai Tesque, Nhật Bản) được cho vào 
mỗi giếng tế bào và ủ trong 15 phút. Mỗi giếng tế bào được rửa 3 lần với PBS (100 
µl/lần). Sau đó, 50 µl Triton 0,1% (X100, Sigma-Aldrich, Mỹ) được bổ sung vào 
mỗi giếng và ủ trong 1 giờ. 
2.2.6.2. Đánh giá sự thay đổi hình thái nhân 
Nhân tế bào được nhuộm bằng Hoechst 33342 (14533, Sigma-Aldrich, Mỹ) 
với thể tích 30 µl/giếng trong 15 phút. Quá trình nhuộm huỳnh quang được thực 
hiện ở nhiệt độ phòng và tránh ánh sáng. Tế bào sau đó được rửa lại 3 lần với PBS 
và quan sát dưới hệ thống kính hiển vi huỳnh quang Cytell (GE Healthcare, Mỹ). 
Ứng dụng Cell Cycle App được sử dụng để đánh giá hình thái nhân, bao gồm diện 
tích, cường độ và giá trị hình dạng nhân (nuclear shape value) [116]. 
2.2.6.3. Đánh giá sự thay đổi hình thái tế bào chất 
Phần mềm ImageJ (National Institutes of Health, Bethesda, Mỹ) được dùng 
để đánh giá diện tích tế bào. Ảnh chụp tế bào từ hệ thống Cytell được chuyển đổi 
sang dạng 8-bit và thiết lập các thông số theo một ngưỡng chung để loại bỏ độ sáng 
nền trước khi tính toán [116]. 
tham khảo 
Bax 
F: 5’-CCAGGAGTTACTTCTATGCCTGA-3’ 
R: 5’-TTCATCCAGGGGAGGTACAAC-3’ 
[112] 
Bcl-2 
F: 5’-TCTTCATTCACACCGAGTAGTGC-3’ 
R: 5’-TGAGGTTAGAGCCATCTGGAAA-3’ 
[112] 
GAPDH 
F: 5’-CATGAGAAGTATGACAACAGCCT-3’ 
R: 5’-AGTCCTTTCCACGATACCAAAGT-3’ 
[114] 
47 
Những thay đổi về mặt hình thái của hucMSC trong điều kiện vi trọng lực 
mô phỏng cũng được đánh giá bằng phương pháp flow cytometry thông qua kết quả 
đo chỉ số FSC (Forward Scatter). Khi dòng tế bào đi qua nguồn laser trong máy 
flow cytometer, chúng sẽ tán xạ lại ánh sáng. Sự tán xạ này được đo bằng hai cảm 
biến quang học. Một cảm biến đo sự phân tán dọc theo đường đi của tia laser và cho 
ra chỉ số FSC. Chỉ số này được tính toán bằng cách chuyển đổi cường độ ánh sáng 
phát ra thành tín hiệu điện. Phép đo FSC cho phép phân biệt các tế bào theo kích 
thước do cường độ FSC tỷ lệ với đường kính của tế bào. Trong nghiên cứu này, các 
tế bào hucMSC được nhuộm với PI và đo chỉ số FSC bằng hệ thống BD Accuri C6 
flow cytomete (BD Biosciences, Mỹ). Giá trị FSC từ nhóm đối chứng và nhóm 
SMG được so sánh với nhau để đánh giá sự khác biệt về kích thước tế bào ở hai 
nhóm thí nghiệm. 
2.2.7. Đánh giá sự thay đổi cấu trúc khung xương tế bào 
2.2.7.1. Thu hoạch tế bào 
Quá trình thu hoạch tế bào được thực hiện như ở Mục 2.2.4.2. Đánh giá chu 
kỳ tế bào, phần Thu hoạch tế bào. 
2.2.7.2. Đánh giá biểu hiện mức phiên mã các gene mã hóa vi ống, vi sợi 
Biểu hiện mức độ phiên mã của các gene mã hóa cho bộ khung xương tế bào 
được đánh giá bằng phương pháp Realtime qRT-PCR. Các gene được đánh giá bao 
gồm α-tubulin 3 và β-actin. Gene GAPDH được sử dụng để làm đối chứng. Quá 
trình thực hiện thí nghiệm tương tự như ở Mục 2.2.4.2. Đánh giá chu kỳ tế bào, 
phần Đánh giá biểu hiện mức phiên mã các gene điều hòa chu kỳ tế bào. Chu trình 
nhiệt của phản ứng như trong Bảng 2.8. Các cặp mồi đặc trưng cho các gene khảo 
sát được thể hiện trong Bảng 2.9. Giá trị Ct của mẫu được tính bằng phương pháp 
2
−ΔΔCt
 [111]. 
Bảng 2.8. Chu trình nhiệt của phản ứng Realtime qRT-PCR cho các gene mã hóa 
khung xương tế bào 
Phản ứng Nhiệt độ Thời gian 
Chuyển hóa RNA thành DNA 45ºC 15 phút 
48 
Bảng 2.9. Trình tự mồi các gene mã hóa khung xương tế bào 
2.2.7.3. Đánh giá biểu hiện mức dịch mã các gene mã hóa vi ống, vi sợi 
Trong nội dung nghiên cứu này, mức độ biểu hiện của các protein cấu trúc 
khung xương tế bào là α-tubulin và β-actin được đánh giá bằng phương pháp 
Western Blot. Protein GAPDH được sử dụng làm đối chứng. Các bước thực hiện thí 
nghiệm tương tự như ở Mục 2.2.4.2. Đánh giá chu kỳ tế bào, phần Đánh giá biểu 
hiện mức dịch mã các gene điều hòa chu kỳ tế bào. Các kháng thể được sử dụng bao 
gồm: 
- Kháng thể sơ cấp: Anti-beta Actin antibody (ab8226, Abcam, Mỹ) và Anti-
alpha Tubulin antibody (ab52866, Abcam, Mỹ) được pha loãng với tỉ lệ 
1:1000; Anti-GAPDH antibody (ab181602, Abcam, Mỹ) được pha loãng với 
tỉ lệ 1:5000. 
- Kháng thể thứ cấp: Goat Anti-Rabbit IgG (HRP) (ab6721, Abcam, Mỹ) và 
Goat Anti-Mouse IgG (HRP) (ab6789, Abcam, Mỹ) 
Tách mạch 95ºC 2 phút 
40 chu kì 
95ºC 10 giây 
60°C 15 giây 
71 chu kì 60°C 15 giây 
Trữ mẫu 4°C 30 phút 
Gene Trình tự mồi Tài liệu tham khảo 
α-tubulin 3 
F: 5’-CATTGAAAAGTTGTGGTCTGATCA-3’ 
R: 5’-GCTTGGGTCTGTAACAAAGCAT-3’ 
[117] 
β-actin 
F: 5’-GAGCACAGAGCCTCGCCTTT-3’ 
R: 5’-AGAGGCGTACAGGGATAGCA-3’ 
[118] 
GAPDH 
F: 5’-CATGAGAAGTATGACAACAGCCT-3’ 
R: 5’-AGTCCTTTCCACGATACCAAAGT-3’ 
[114] 
49 
2.2.7.4. Đánh giá sự tái cấu trúc bộ khung vi ống, vi sợi trong tế bào 
Nhuộm huỳnh quang vi ống: SiR-Tubulin Kit (CY-SC002, Cytoskeleton, 
Inc., Mỹ) được sử dụng để nhuộm vi ống. Dung dịch này là phức hợp của chất 
nhuộm huỳnh quang fluorophore silicon rhodamine (SiR) và chất liên kết với vi ống 
Docetaxel. Sir-tubulin cho phép thực hiện trên tế bào sống với độ đặc hiệu và độ 
tương phản với nền cao. Chuẩn bị 1mM dung dịch nhuộm Sir-Tubulin bằng cách 
hòa tan toàn bộ Sir-Tubulin dạng bột trong ống kit với 50µL DMSO. Dung dịch này 
sau đó được bảo quản ở -20°C trước khi sử dụng. Tế bào gốc trung mô được nuôi 
trong đĩa 96 giếng với mật độ 103 tế bào/giếng. Quá trình nhuộm vi ống được tiến 
hành cùng lúc với thử nghiệm vi trọng lực. Dung dịch SiR-tubulin và verapamil 
được pha trong môi trường nuôi cấy với tỉ lệ 1:1:1000. Mỗi giếng tế bào được bổ 
sung 395 µl môi trường nuôi cấy chứa thuốc nhuộm sao cho nồng độ cuối cùng 
trong mỗi giếng là 50 nM. Các giếng nuôi tế bào sau đó được phủ bằng màng 
parafilm trước khi đậy nắp. Quá trình thử nghiệm vi trọng lực được tiến hành trong 
72 giờ. Sau 72 giờ, các đĩa nuôi được rút bỏ môi trường, rửa với PBS và được quan 
sát dưới hệ thống hiển vi huỳnh quang Cytell (GE Healthcare, Mỹ). 
Nhuộm huỳnh quang vi sợi và nhân: Tế bào hucMSC được nuôi trong đĩa 96 
giếng với mật độ 103 tế bào/giếng. Sau thử nghiệm vi trọng lực, đĩa tế bào được rút 
bỏ môi trường nuôi cấy. Mỗi giếng tế bào được rửa 3 lần với 100 µl PBS (PBS-
10XA, Capricorn Scientific, Đức). 50 µl 4% Paraformaldehyde Phosphate Buffer 
Solution (09154-85, Nacalai Tesque, Nhật Bản) được cho vào mỗi giếng tế bào và ủ 
trong 15 phút. Mỗi giếng tế bào được rửa 3 lần với PBS (100 µl/lần). Sau đó, 50 µl 
Triton 0.1% (X100, Sigma-Aldrich, Mỹ) được bổ sung vào mỗi giếng và ủ trong 1 
giờ. Vi sợi actin được nhuộm với Phalloidin CruzFluor™ 488 Conjugate (sc-
363791, Santa Cruz Biotechnology, Mỹ) với thể tích 30 µl/giếng trong 1 giờ. Tế 
bào sau đó được rửa 3 lần với PBS và tiếp tục nhuộm nhân. Nhân tế bào được 
nhuộm bằng Hoechst 33342 (14533, Sigma-Aldrich, Mỹ) với thể tích 30 µl/giếng 
trong 15 phút. Quá trình nhuộm huỳnh quang được thực hiện ở nhiệt độ phòng và 
tránh ánh sáng. Tế bào sau đó được rửa lại 3 lần với PBS và quan sát dưới hệ thống 
kính hiển vi huỳnh quang Cytell (GE Healthcare, Mỹ). 
Đánh giá mật độ vi sợi, vi ống: Mật độ các bó vi sợi, vi ống trong tế bào 
được đánh giá bằng cách đo cường độ phát huỳnh quang của protein trong các bó 
50 
sợi này. Ảnh chụp huỳnh quang của hucMSC sau khi nhuộm được phân tích bằng 
phần mềm ImageJ (National Institutes of Health, Bethesda, Mỹ). Hình ảnh được 
chuyển đổi sang dạng 8 bit và sử dụng một ngưỡng chung cho tất cả các hình để 
loại bỏ sự chênh lệch phông nền trước khi diện tích tế bào và cường độ phát huỳnh 
quang của vi ống và vi sợi actin được đo [116]. 
2.2.8. Phương pháp thống kê 
Phần mềm Sigma Plot (SYSTAT Software, Mỹ) được dùng để phân tích số 
liệu trong nghiên cứu. Phương pháp One-way ANOVA được sử dụng để đánh giá 
sự khác biệt giữa các nhóm thí nghiệm, trong đó p ≤ 0,05, p ≤ 0,01, p ≤ 0,001 được 
xem là các khác biệt có ý nghĩa thống kê. 
51 
CHƯƠNG 3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 
3.1. Đánh giá các chỉ thị marker của tế bào gốc trung mô 
 Biểu hiện của các marker âm tính và dương tính cho tế bào gốc trung mô 
được thể hiện ở Hình 3.1. Kết quả phân tích flow cytometry cho thấy tế bào 
hucMSC được sử dụng trong nghiên cứu biểu hiện dương tính với các marker đặc 
trưng cho tế bào gốc trung mô là CD90, CD73 và CD105. (Hình 3.1B2-B4) và biểu 
hiện âm tính với các marker không đặc trưng cho dòng tế bào này trong PE hMSC 
Negative Cocktail, bao gồm CD34, CD11B, CD19, CD45và HLA-DR (Hình 3.1 
B1). Việc âm tính với các marker CD34, CD45, CD19 chứng tỏ quần thể tế bào 
hucMSC không nhiễm các tế bào tiền thân tạo máu, tế bào nội mô hay tế bào bạch 
cầu [119]. 
Hình 3.1. Đánh giá biểu hiện marker ở hucMSC. A1: Nhuộm với PE hMSC 
Negative Isotype Control Cocktail (mIgG1, κ PE; mIgG2a, κ PE). A2-A4: hMSC 
Positive Isotype Control Cocktail (mIgG1, κ FITC; mIgG1, κ APC; mIgG1, κ 
PerCP-Cy5.5). B1: hucMSC biểu hiện âm tính với PE hMSC Negative Cocktail 
(CD34 PE, CD11b PE, CD19 PE, CD45 PE, HLA-DR PE). B2-B4: hucMSC biểu 
hiện dương tính với các marker đặc trưng cho hMSC (CD90, CD73, CD105). 
Hơn nữa, sự âm tính với marker CD19 cho thấy tế bào B và tế bào tua 
(dendritic cells) không tồn tại trong quần thể tế bào hucMSC trên. Ngoài ra, sự âm 
tính với marker HAL-DR và CD11B chứng tỏ không tồn tại tế bào bạch cầu hay đại 
52 
thực bào trong quần thể tế bào hucMSC [120, 121]. Các kết quả phân tích trên 
chứng tỏ quần thể tế bào hucMSC sử dụng trong nghiên cứu vẫn giữ được các đặc 
tính của tế bào gốc trung mô. 
3.2. Đánh giá sự tăng sinh tế bào 
3.2.1. Sự thay đổi mật độ tế bào 
Mật độ quang của hucMSC trong hai nhóm thí nghiệm được tính toán và thể 
hiện ở Hình 3.2. Theo đó, mật độ quang trung bình ở nhóm thử nghiệm vi trọng lực 
(SMG) là 0,97 ± 0,05, thấp hơn đáng kể so với nhóm đối chứng là 1,09 ± 0,13 (p ≤ 
0,001). Điều này cho thấy mức độ tăng sinh của hucMSC giảm khi nuôi cấy trong 
môi trường vi trọng lực mô phỏng. 
Hình 3.2. Mật độ quang của hucMSC qua đánh giá bằng phương pháp WST-1. A: 
Biểu đồ mật độ quang. B: hucMSC trong điều kiện bình thường. C: hucMSC trong 
điều kiện vi trọng lực mô phỏng (SMG). ***: p ≤ 0,001. Thước đo: 111,82 μm 
Những ảnh hưởng của lực hấp dẫn đã được báo cáo trong nhiều nghiên cứu 
trước đây, bao gồm mô tả sự thay đổi về mặt hình thái hoặc xác định các đặc tính 
của tế bào [25, 28, 122, 123]. Một số dòng tế bào như tế bào mỡ, bạch cầu đơn 
nhân, nguyên bào xương người, tế bào gốc phôi chuột, tế bào gốc trung mô chuột đã 
được sử dụng làm mô hình cho các nghiên cứu vi trọng lực mô phỏng trong các 
nghiên cứu của Yuge và cộng sự năm 2003, Huang và cộng sự năm 2009, 
Kawahara và cộng sự năm 2009, Meloni và cộng sự năm 2011 [124-127]. 
53 
Sự sinh trưởng của tế bào được thể hiện qua quá trình tăng sinh, ở đó tế bào 
gia tăng về