Luận án Nghiên cứu bệnh nhiễm độc tố Botulin của vi khuẩn Clostridium botulinum trên vịt tại một số tỉnh đồng bằng sông Cửu Long

à thay lông. Trong 3 
vụ đẻ đó vụ đẻ thứ hai thường đẻ nhiều trứng nhất, trứng có chất lượng tốt; tỷ 
lệ đẻ đạt 90 – 95%, có khi 100%. 
Người chăn vịt có kinh nghiệm thường đi theo đàn vịt bằng chiếc thuyền 
con, chiếc thuyền này có thể vác lên vai một cách nhẹ nhàng, do đó mà có thể 
theo đàn vịt qua sông, hồ được. Người chăn vịt phải biết là vịt kiếm được 
 48 
nhiều mồi hay ít mồi ngoài đồng để rồi cho vịt ăn thêm nhiều hay ít khi vịt về 
chuồng. Ví dụ: Khi thấy vịt mò mải miết, đó là đồng nhiều mồi, ngược lại khi 
thấy vịt chạy nhiều, đó là đồng ít mồi Hoặc là vịt ăn no đủ thì đẻ nhiều, 
ngược lại vịt đẻ ít là thiếu ăn; phải chú ý đến số lượng và chất lượng thức ăn 
cần bổ sung cho vịt hàng ngày. 
Tuyệt đối tránh không làm cho vịt sợ hãi. Lùa vịt đẻ từ ruộng này sang 
ruộng khác phải nhẹ nhàng, từ từ để cho vịt đi một cách tự nhiên. Vịt đang đẻ 
cần chú ý đừng để chúng phải leo dốc có thể bị đẻ non hoặc ngừng đẻ. Trong 
khi đi chăn vịt, đi hết diện tích này đến diện tích khác (phải qua nhiều sông 
ngòi, ao, hồ, đầm, kênh), nếu người chăn nuôi không có kinh nghiệm để vịt 
sa vào một nơi không có mồi (nước phèn mặn) thì sẽ làm giảm đẻ. 
Vịt mái đẻ không thích những nơi ồn ào, không ưa những nơi đất đầy 
bùn, đất quá khô, quá dốc. Vịt không thích sự có mặt của những người lạ và 
nhất là chó, vì nếu bị chó rượt đuổi thì ngày hôm sau đó sản lượng trứng sẽ bị 
giảm ngay. Đặc điểm của vịt, nhất là vịt mái đẻ, có “phản ứng stress” rất nhạy 
bén, nên những gì làm cho vịt hoảng sợ, hoặc làm thay đổi điều kiện sống, đều 
có ảnh hưởng xấu đến tỷ lệ đẻ ngay 
Ban đêm nếu người chăn nuôi ra thăm nơi nhốt vịt thì phải hết sức cẩn 
thận, đêm nào cũng chỉ nên làm đúng những cử chỉ thật cần thiết để cho vịt 
quen. Bóng người lạ, tiếng động lạ đều làm cho vịt kêu “thất thanh” làm cho 
vịt nhảy loạn xạ, chất đống lên nhau ở một góc chuồng, chúng có thể bị 
thương hoặc đè lên nhau mà chết, một số lớn vịt ngày hôm sau sẽ ngừng đẻ. 
Có nơi người ta thắp một ngọn đèn để giữa chuồng và chi riêng người chăn vụ 
được đi vào khi nhặt trứng, không cho người lạ vào. Buổi trưa phải cho vịt ở 
chỗ mát để nghỉ ngơi, nhất là ở bên hồ nước trong sạch, có bóng cây mát (Bùi 
Xuân Mến, 2014). 
 49 
Chương 3: NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 
3.1 Phương tiện nghiên cứu 
3.1.1 Thời gian và địa điểm nghiên cứu 
Nghiên cứu được tiến hành từ tháng 10 năm 2013 đến tháng 10 năm 2017 
3.1.2 Địa điểm nghiên cứu 
3.1.2.1 Địa điểm thu thập mẫu 
Mẫu được thu thập tại 3 tỉnh và 1 thành phố của vùng Đồng bằng sông 
Cửu Long (ĐBSCL) bao gồm tỉnh An Giang, Hậu Giang, Kiên Giang và thành 
phố Cần Thơ. 
3.1.2.2 Phân tích mẫu và nuôi chuột thí nghiệm 
Nuôi cấy, phân lập vi khuẩn và thử độc tố trên chuột tại phòng thí 
nghiệm Thú y chuyên ngành 3, Bộ môn Thú Y, Khoa Nông nghiệp, Trường 
Đại học Cần Thơ 
3.1.2.3 Thí nghiệm trên thực địa 
Thử nghiệm độc tố của vi khuẩn C. botulinum trên vịt đẻ được thực hiện 
tại Công ty TNHH Một thành viên chăn nuôi Vemedim, xã Thới Thạnh, huyện 
Thới Lai, Thành phố Cần Thơ. 
3.2 Trang thiết bị dụng cụ và hóa chất 
Dụng cụ và thiết bị 
- Ống đong, ống hút, lame, kính hiển vi, kẹp, dao, kéo, que cấy, găng tay, 
đèn cồn, giấy lau kính, tăm bông vô trùng, túi nilong, thùng đá, bình yếm khí, 
túi dùng để tạo môi trường yếm khí (Anaerocult C), ống nghiệm Vial, 
micropipet, eppendorf, lồng nuôi chuột, chuồng nuôi vịt và dụng cụ chăn nuôi 
chuyên biệt cần thiết trong chăn nuôi động vật thí nghiệm. 
- Tủ ấm, tủ ấm CO2, tủ sấy, tủ lạnh, autoclave, water bath, 
Hóa chất và môi trường 
- Cồn 96o, cồn 70o, nước cất, dầu cedar, Crystal violet, Lugol, Safranine, 
Bromocresole purple, Gelatin Phosphat Buffer (Merck, Đức). 
- Kháng sinh: sử dụng các loại kháng sinh amikacin, ampicillin, 
amoxicillin, ceftiofur, cephalexin, doxycycline, florfenicol, fosfomycin, 
marbofloxacin, norfloxacin (Oxoid, Anh). 
- Ống chuẩn Mac Farland 0, 5 và 3 (Biorad) 
 50 
- Môi trường 
Môi trường NB: Nutrient broth (Merck, Đức) 
Môi trường TSA: Tryptis Soy Agar (Merck, Đức) 
Môi trường CMM: Cooked Meat Media (Oxoid, Anh) 
Môi trường EYA: Egg Yorlk Agar (Merck, Đức) 
Môi trường Thioglycollate (MERCK, Đức). 
Môi trường SFP Agar Base (Difco, Mỹ). 
Môi trường MHA: Mueller Hinton Agar (Merck, Đức) 
Các loại đường: Lactose, glucose, maltose, saccarose (Merck, Đức) 
Bộ phản ứng sinh hóa API 20A (Biorad) 
Máu cừu (công ty Nam Khoa- TP HCM) 
Môi trường TPGY broth: 5% Trypticase, 0.5% Pepton, 0.4% Glucose, 
2% Yeast extract, 0.1% Sodium thioglycolate 
Môi trường CMM (Cooked Meat Medium) (Oxoid, Anh) 
Kháng độc tố dạng lỏng (antitoxins) type C, D, E (10UI/ml) (Statens 
Serum Institut, Đan Mạch) 
3.3 Nội dung nghiên cứu 
3.3.1 Nội dung 1: Tình hình bệnh botulism trên vịt chạy đồng (VCĐ) ở 
Đồng bằng sông Cửu Long. 
3.3.1.1 Mục tiêu 
Đánh giá tần suất lưu hành bệnh botulism trên đàn vịt chạy đồng của 
Đồng bằng sông Cửu Long. 
3.3.1.2 Đối tượng nghiên cứu 
Vịt chạy đồng mắc bệnh botuism được nuôi dưỡng tại Đồng bằng sông 
Cửu Long. Đối tượng nghiên cứu có đặc điểm sau: 
Vịt bệnh botulism được chia theo mục đích nuôi bao gồm vịt thịt và vịt 
đẻ. Vịt thịt được nuôi thả đồng từ 4 – 12 tuần tuổi, đến tuần thứ 12, người dân 
bắt đầu tuyển chọn những con vịt mái đủ tiêu chuẩn để tiếp tục nuôi dưỡng 
kéo dài trong nhiều năm theo hướng khai thác trứng, những con vịt còn lại thì 
được bán thịt. Như vậy, vịt đẻ sẽ bắt đầu tính tuổi sau 24 tuần tuổi (240 – 255 
ngày) vịt sẽ rớt trứng đầu tiên. 
 51 
3.3.1.3 Phương pháp nghiên cứu 
a. Tình hình chăn nuôi VCĐ ở ĐBSCL 
 Điều tra hồi cứu tình hình chăn nuôi vịt chạy đồng tại Phòng thống kê 
của Chi cục Thú y ở 4 địa điểm thu thập mẫu. Tại đây, nhóm nghiên cứu sẽ 
thu thập thông tin về điều kiện tự nhiên cũng như tổng đàn VCĐ của từng tỉnh, 
ghi nhận những thuận lợi và bất lợi về điều kiện tự nhiên trong chăn nuôi vịt 
theo phương thức chạy đồng từ năm 2012 – 2014. 
b. Tình hình bệnh botulism trên vịt chạy đồng (VCĐ) ở Đồng bằng 
sông Cửu Long 
- Điều tra cắt ngang và tiến cứu về tình hình bệnh botilism trên VCĐ tại 4 
địa điểm thu thập mẫu. 
- Cỡ mẫu nghiên cứu: Phân bố mẫu mỗi tỉnh cần khảo sát được trình bày 
trong Bảng 3.1. 
Bảng 3.1 Phân bố mẫu khảo sát tại 4 địa điểm lấy mẫu 
Địa điểm Vịt thịt (con) Vịt đẻ (con) 
Tỉnh An Giang 20.000 25.800 
Thành phố Cần Thơ 19.000 28.700 
Tỉnh Hậu Giang 18.000 25.350 
Tỉnh Kiên Giang 22.000 31.200 
Tổng 79.000 108.505 
Xác định tình hình bệnh botulism trên vi khuẩn C. botulinum trên vịt 
chạy đồng ở ĐBSCL được tiến hành theo các bước sau 
Bước 1: Điều tra 
Trong quá trình điều tra và thu mẫu trên từng địa bàn luôn hợp tác với 
thú y địa phương để biết tình hình đàn VCĐ ở địa bàn quản lý, hỏi chủ nuôi về 
tình hình sức khỏe của đàn vịt đồng thời quan sát trạng thái thần kinh cũng 
như quá trình vận động của vịt. Nếu đàn vịt có xuất hiện các triệu chứng của 
bệnh botulism như xù lông, giảm ăn, yếu chân, liệt mềm cổ, liệt mí mắt, liệt 
cánh, liệt chân thì tiến hành lập phiếu điều tra (Phụ lục 1), đồng thời thương 
lượng mua mẫu vịt bệnh để nghiên cứu. 
Bước 2: Lấy mẫu 
Mẫu bệnh phẩm được lấy trên vịt bệnh còn sống hoặc vừa chết. (1) Trên 
vịt bệnh còn sống, lấy khoảng 5-10 ml máu từ tỉnh mạch cổ, trữ trong ống 
 52 
nghiệm vô trùng và bảo quản ở nhiệt độ từ 4-6oC trong vòng 8 giờ, chắt lấy 
huyết thanh và trữ huyết thanh ở -80oC; Sau đó, mổ khảo sát bệnh tích đại thể 
của nội quan, thu bệnh phẩm là chất chứa trong ống tiêu hóa bằng cách khóa 
kín đoạn hầu và đoạn giáp với hậu môn bằng kẹp nhựa, cắt lấy ống tiêu hóa, 
giữ trong túi vô trùng, bảo quản lạnh và phân tích tại phòng thí nghiệm. (2) 
trường hợp vịt vừa chết thì tiến hành mổ kháo sát và lấy mẫu giống như trên. 
Mỗi đàn vịt lấy từ 1-5 bệnh phẩm. 
Hình 3.1 Vịt bị liệt mềm cổ 
3.3.1.4 Chỉ tiêu theo dõi 
+ Tỷ lệ bệnh botulism trên VCĐ ở ĐBSCL. 
+ Tần suất xuất hiện triệu chứng lâm sàng của bệnh botulism. 
+ Tần suất xuất hiện bệnh tích của bệnh botulism. 
3.3.2 Nội dung 2 
Phân lập vi khuẩn C. botulinum và xác định độc tố botulin trên VCĐ 
mắc bệnh botulism 
3.3.2.1 Mục tiêu: Xác định sự hiện diện vi khuẩn C. botulinum và xác 
định type độc lực của botulin trên VCĐ. 
3.3.2.2 Đối tượng nghiên cứu 
Huyết thanh và bệnh phẩm của VCĐ bệnh botulism ở nội dung 1. 
 53 
3.3.2.3 Phương pháp tiến hành 
a. Phân lập vi khuẩn C. botulinum trên bệnh phẩm của vịt bệnh theo 
MiiaLindstrom and Hannu Korkeala (2006) và qui trình có cải tiến 
Phân lập vi khuẩn C. botulinum trên bệnh phẩm của vịt bệnh theo 
Lindstrom and Korkeala (2006) và qui trình có cải tiến được trình bày trong 
Hình 3.2. 
Hình 3.2 Sơ đồ qui trình nuôi cấy, phân lập vi khuẩn Clostridium botulinum 
 (Lindstrom and Korkeala, 2006) và qui trình có cải tiến 
Bệnh phẩm ruột, gan, được lấy vô trùng và cấy trực tiếp trên thạch máu 
và thạch SFP, sau đó đem ủ trong tủ ấm kỵ khí ở 37oC trong 24 giờ. Trên môi 
trường thạch máu, khuẩn lạc của vi khuẩn C. botulinum không tròn đều, khô, 
Chọn khuẩn lạc điển hình 
Mẫu 
(chất chứa trong ruột, gan) 
Cấy trực tiếp lên môi trường 
thạch máu và SFP 
Nhuộm Gram 
(trực khuẩn, Gr+, 
có nha bào, thuần) 
Cấy thuần 
(các khuẩn lạc 
đồng nhất) 
Kiểm tra đặc tính sinh hóa bằng 
API 20A 
Xác định vk Clostridium botulinum và 
giữ giống trong CMM/ thioglycolate 
Ủ yếm khí ở 370C/24h 
Ủ yếm khí ở 370C/24-48h 
Ủ yếm khí ở 370C/24h 
 54 
dẹt hoặc hình dạng không ổn định. Trên môi trường SFP khuẩn lạc C. 
botulinum có màu đen, nhỏ, tròn đều, chọn khuẩn lạc điển hình nêu trên 
nhuộm Gram để xem hình dạng, cách bắt màu, dạng nha bào, độ thuần nhất 
của vi khuẩn. Sau đó, kiểm tra đặc tính sinh hóa của vi khuẩn bằng bộ sinh 
hóa API 20A. Phân lập vi khuẩn C. botulinum trên bệnh phẩm của vịt bệnh 
theo Lindstrom and Korkeala (2006) và qui trình có cải tiến được trình bày 
trong Hình 3.3. 
Hình 3.3 Khuẩn lạc của vi khuẩn 
C. botulinum trên thạch máu 
Hình 3.4 Khuẩn lạc của vi khuẩn 
C. botulinum trên môi trường SFP 
Hình 3.5 Hình ảnh nha bào của vi khuẩn C. botulinum dưới KHV (X 100) 
 55 
b. Kiểm tra đặc tính sinh hóa bằng bộ API 20A (theo hướng dẫn của 
nhà sản xuất) 
Chuẩn bị canh khuẩn 
 C. botulinum được nuôi cấy trên môi trường thạch máu và ủ yếm khí 
trong 18 – 24 giờ. 
 Khuẩn lạc C. botulinum được cho vào dung dịch NaCl 9‰ và so độ 
đục với ống McFarland 3 để tạo thành huyễn dịch vi khuẩn. 
Chuẩn bị test kit API 20A 
 Cho 5 ml nước cất vô trùng vào các giếng tổ ong (honeycomb) của 
khay để tạo độ ẩm không khí. 
 Ghi số bệnh phẩm trên khay; đặt thanh API 20A vào khay nước. 
 Cho huyễn dịch vi khuẩn vào các giếng, tránh tạo thành bọt khí và 
nghiêng thanh nhẹ nhàng về phía trước. 
- Với test GEL, phủ đầy cả ống và phần hình chén. 
- Với test IND, chỉ phủ đầy giếng với môi trường API 20A và làm đầy 
phần hình chén với dầu khoáng để ngăn cản sự bốc hơi. 
 Ủ thanh API 20A trong trong tủ ấm CO2 ở 36oC ± 2oC trong 24 giờ, sau 
đó đọc kết quả. Kết quả được thể hiện trên Bảng 3.2. 
Bảng 3.2 Đặc tính sinh hóa của vi khuẩn C. botulinum trong bộ API 20A 
Hình 3.6 Đặc tính sinh hóa theo API 20A của vi khuẩn C. botulinum 
 56 
c. Xác định độc tố botulin của vi khuẩn C. botulinum 
Xác định độc tố botulin của vi khuẩn C. botulinum trong huyết thanh của 
VCĐ bệnh botulism theo quy trình của Cook et al. (1998), được trình bày 
trong Hình 3.7. 
- Chuẩn bị huyết thanh: Huyết thanh được rả đông, lọc qua màng lọc 
0,45µm và thu dịch lọc vô trùng. 
- Chuẩn bị động vật thí nghiệm: chuột SPF có nguồn gốc từ viện 
Pasteur thành phố Hồ Chí Minh, tiếp tục nuôi 3 ngày để thích nghi với môi 
trường sống trước khi tiến hành thí nghiệm. 
- Bố trí thí nghiệm 
- Chuột được chia làm 3 lô thí nghiệm bao gồm I, lI và đối chứng, mỗi 
chuồng nuôi 2 con được phân biệt bằng cách dùng bút lông đánh dấu trên 
lưng, trên nắp chuồng đều có đánh code mẫu và 2 con chuột cùng chuồng 
được tiêm vào xoang bụng mẫu huyết thanh của 1 con vịt đã lấy mẫu ở trên. 
Thí nghiệm I: Tiêm huyết thanh qua lọc, nhưng không xử lý nhiệt. 
Thí nghiệm II: Tiêm huyết thanh qua lọc, qua xử lý nhiệt 100oC trong 
vòng 10 phút để bất hoạt độc tố (nếu có). 
Thí nghiệm III: Tiêm nước muối sinh lý 0,9%. Bố trí thí nghiệm được 
trình bày trong Bảng 3.3. 
Bảng 3.3 Sơ đồ bố trí thí nghiệm 
Thí nghiệm Số lượng (con) Liều (ml/con) 
Thí nghiệm I 400 0,5 
Thí nghiệm II 400 0,5 
Đối chứng 20 0,5 
Dịch lọc huyết thanh được kiểm tra không có sự hiện diện của vi khuẩn 
bằng cách cáy trên môi trường thạch máu và môi trường SFP, ủ trong điều 
kiện hiếu khí và kỵ khí ở 37oC trong 24 giờ. Mẫu huyết thanh được sử dụng 
trong thí nghiệm phải đảm bảo vô trùng. 
 57 
Cách đọc kết quả 
Nếu chuột thí nghiệm I xuất hiện các triệu chứng liệt chân, liệt mí mắt, 
xù lông, thở bụng hoặc chết, đồng thời chuột ở thí nghiệm II và III khỏe mạnh 
và không biểu hiện bệnh lý thì kết luận trong mẫu huyết thanh có độc tố 
botulin. 
d. Định type độc tố botulin 
Huyết thanh được xác định có mang độc tố ở thí nghiệm trên được chọn 
ra để định type độc tố. Mỗi mẫu huyết thanh qua lọc được chia ra làm 3 phần 
bằng nhau, thử lần lượt với 3 loại kháng độc tố type C, D và E theo tỷ lệ 1:1, 
mỗi loại hỗn hợp huyết thanh và kháng độc tố tiêm cho 2 con chuột. Kháng 
độc tố chuẩn được pha với nước sinh lý theo tỷ lệ 1/100 trước khi tiến hành thí 
nghiệm. Bố trí chuột thí nghiệm định type độc tố botulin được trình bày trong 
Bảng 3.4. 
Bảng 3.4 Bố trí thí nghiệm Định type độc tố botulin 
Số mẫu TN type C 
(con) 
TN type D 
(con) 
TN type E 
(con) 
TN đối chứng 
(con) 
Liều tiêm/con 
(ml) 
1 2 2 2 2 1 
TN: Thí nghiệm 
TN type C: Tiêm huyết thanh + kháng độc tố type C; TN type D: Tiêm huyết thanh + kháng độc tố 
type D; TN type E: Tiêm huyết thanh + kháng độc tố type E; Để yên hỗn hợp trên ở nhiệt độ phòng 
30-60 phút (CDC, 1998; TN đối chứng (không có kháng độc tố): Tiêm nước muối sinh lý 0,9%. 
Cách đọc kết quả 
Sau 7 ngày nếu chuột ở thí nghiệm nào còn khỏe mạnh bình thường thì 
kết luận huyết thanh đã mang type độc tố tương ứng; nghĩa là độc tố trong 
huyết thanh đã bị trung hòa bởi kháng độc tố tương ứng thêm vào. 
Chuột ở thí nghiệm đối chứng: luôn luôn khỏe mạnh và không có biểu 
hiện khác thường. Phương pháp xác định type độc tố botulin trong huyết thanh 
vịt theo CDC (1998) được trình bày trong Hình 3.7. 
 58 
Hình 3.7 Kháng độc tố chuẩn 
Phân lập vi khuẩn C. botulinum và xác định độc tố botulin trên huyết 
thanh VCĐ mắc bệnh botulism được tóm tắt trong Hình 3.8. 
 59 
Hình 3.8 Sơ đồ xác định type độc tố botulin trong huyết thanh vịt 
(CDC, 1998) 
Huyết thanh + KĐT type C 
Huyết thanh + KĐT type E 
Huyết thanh + KĐT type D 
Độc tố botulin trong dịch bệnh phẩm bị 
phá hủy bởi nhiệt 
Chuột chết hoặc biểu hiện bất thường 
Chuột bình thường 
Mổ khám, ghi nhận triệu chứng bất 
thường và kiểm tra độ vô trùng của dịch 
qua lọc. 
Dương tính (hay mẫu huyết thanh của vịt 
có chứa độc tố) 
Những mẫu huyết thanh dương tính ở thí nghiệm 1, lọc qua màng lọc 
0,45 µm, chia làm 3 phần bằng nhau để thử nghiệm với kháng độc tố. 
Tiêm xoang bụng cho 2 con 
chuột (1ml/con) 
Tiêm xoang bụng cho 2 con 
chuột (1ml/con) 
Tiêm xoang bụng cho 2 con 
chuột (1ml/con) 
Chuột bình thường 
Chuột bình thường 
Chuột bình thường 
Bệnh phẩm có chứa độc tố 
C. botulinum type C 
Bệnh phẩm có chứa độc tố 
 C. botulinum type D 
Bệnh phẩm có chứa độc tố 
C. botulinum type E 
Mẫu huyết thanh của vịt (liệt và mềm cổ) 
Lọc (màng lọc 0,45 µm), chia làm 2 phần bằng nhau 
9(qua lưới lọc 
Dịch bệnh phẩm 
Lô I dịch bệnh phẩm tiêm vào xoang bụng 
của chuột bạch 0,5 ml/con 
(2 con/ mẫu) 
Lô II dịch bệnh phẩm tiêm vào xoang 
bụng của chuột bạch 0,5 ml/con 
(2 con/ mẫu) 
Xử lý nhiệt 1000C/10 phút Không xử lý nhiệt 
Giai 
đoạn 
2 
Giai 
đoạn 
1 
 60 
3.3.2.4 Chỉ tiêu theo dỏi 
- Tỷ lệ hiện diện vi khuẩn trong bệnh phẩm. 
- Tỷ lệ huyết thanh có độc tố. 
- Tỷ lệ lưu hành của các type độc tố. 
- Tần suất xuất hiện các triệu chứng lâm sàng đặc trưng trên chuột bị 
nhiểm độc tố botulin. 
- Tần suất xuất hiện bệnh tích đại thể trên chuột bị nhiểm độc tố botulin 
3.3.3 Nội dung 3 
Xác định các các yếu tố nguy cơ gây bệnh botulism trên VCĐ ở ĐBSCL. 
3.3.3.1 Mục tiêu 
Đánh giá sự lưu hành của vi khuẩn C. botulinum trên môi trường chăn 
nuôi VCĐ ở ĐBSCL 
3.3.3.2 Đối tượng nghiên cứu: môi trường chăn nuôi: đất, nước, cua, ốc 
3.3.3.3 Phương pháp thực hiện 
a. Thu thập mẫu 
Song song với việc lấy mẫu VCĐ bệnh botulism thì mẫu ở môi trường 
nuôi có đàn vịt bệnh cũng được thu thập bao gồm đất, nước, cua, ốc. Cỡ mẫu 
được phân bố trong bảng 3.5 
Bảng 3.5 Phân bố mẫu trên môi trường nuôi 
Địa điểm Bùn đất (mẫu) Nước (mẫu) Cua (mẫu) Ốc (mẫu) Tổng 
An Giang 159 159 63 106 645 
Cần Thơ 141 141 42 94 563 
Hậu Giang 144 144 50 96 582 
Kiên Giang 156 156 61 104 646 
Tổng cộng 600 600 216 400 2.436 
Mẫu đất và nước, số lượng mẫu cần lấy là 3 mẫu. Đất ngập nước lấy mẫu 
ở độ sâu 5 – 10cm. Mỗi mẫu có khối lượng khoảng 25 – 30g. Mẫu nước lấy 
khoảng 50 – 100ml bằng lọ vô trùng. 
 61 
Mẫu cua, ốc: lấy 2 – 3 mẫu cua, ốc. Trữ lọ vô trùng, chọn những cua, ốc 
mới chết hoặc cua nhỏ, ốc nhỏ còn sống (vịt có thể nuốt được). Tất cả mẫu 
được bảo quản lạnh (Franciosa et al., 1996). 
b. Phân lập vi khuẩn C. botulinum từ đất, nước, cua, ốc 
Phương pháp thực hiện được tiến hành như mô tả phân lập vi khuẩn 
C. botulinum ở mục 3.3.2.3 và được trình bày tóm tắt theo sơ đồ trong Hình 3.9. 
Hình 3.9 Sơ đồ qui trình nuôi cấy, phân lập vi khuẩn Clostridium botulinum trên môi 
trường nuôi (Lindstrom and Korkeala (2006) và qui trình có cải tiến) 
3.3.3.4 Chỉ tiêu theo dõi 
- Tỷ lệ hiện diện vi khuẩn trong mẫu đất và nước ruộng. 
- Tỷ lệ hiện diện vi khuẩn trong mẫu cua, ốc. 
Chọn khuẩn lạc điển hình 
Mẫu 
(Đất, nước, cua, ốc) 
Cấy trực tiếp lên môi trường 
thạch máu và SFP 
Nhuộm Gram 
(trực khuẩn, Gr+, 
có nha bào, thuần) 
Cấy thuần 
(các khuẩn lạc 
đồng nhất) 
Kiểm tra đặc tính sinh hóa bằng 
API 20A 
Xác định vk Clostridium botulinum và 
giữ giống trong CMM/ thioglycolate 
Ủ yếm khí ở 37oC/24h 
Ủ yếm khí ở 370C/24-48h 
Ủ yếm khí ở 370C/24h 
 62 
3.3.4 Nội dung 4 
Tính gây bệnh của vi khuẩn C. botulinum phân lập được trên vịt bệnh. 
3.3.4.1 Mục tiêu: Xác định khả năng gây bệnh của các chủng C. botulinum 
phân lập được 
3.3.4.2 Đối tượng nghiên cứu: Các chủng C. botulinum phân lập được. 
3.3.4.3 Phương pháp tiến hành 
a. Kiểm tra độ mẫn cảm kháng sinh của vi khuẩn C. botulinum 
Sử dụng phương pháp kháng sinh đồ dựa trên sự khuếch tán của kháng 
sinh trên thạch đĩa của Kirby-Bauer (Bauer et al., 1966). Đánh giá mức độ 
nhạy cảm kháng sinh dựa trên đường kính vòng vô khuẩn theo tiêu chuẩn theo 
Clinical and Laboratory Standards Institute (2019) của nhóm trực khuẩn 
đường ruột. 
- Phương pháp thực hiện kháng sinh đồ: Chuẩn bị canh trùng của vi 
khuẩn Clostridium botulinum thuần sao cho đạt nồng độ 108 CFU/ml (bằng 
cách so độ đục với ống chuẩn Mc Farland 0,5). Dùng que tăm bông vô trùng 
nhúng vào canh trùng, ép vào thành ống nghiệm cho bớt nước rồi ria đều khắp 
mặt thạch MHA. 
Bảng 3.6 Tiêu chuẩn đường kính vòng vô khuẩn của một số loại kháng sinh (CLSI, 2019) 
STT Loại kháng sinh 
Hàm lượng 
(μg) 
Đường kính vòng vô khuẩn (mm) 
Nhạy Mẫn cảm trung bình Kháng 
1 Amikacin 30 ≥ 17 15-16 ≤ 14 
2 Ampicillin 10 ≥ 17 14-16 ≤ 13 
3 Amoxicillin 25 ≥ 18 14-17 ≤ 13 
4 Ceftiofur 30 ≥ 21 18-20 ≤ 17 
5 Cephalexin 30 ≥ 18 15-17 ≤ 14 
6 Doxycycline 30 ≥13 10-12 ≤9 
7 Florfenicol 30 ≥19 15-18 ≤14 
8 Fosformycin 200 ≥16 13-15 ≤12 
9 Marbofloxacin 5 ≥18 16-17 ≤15 
10 Norfloxacin 10 ≥17 13-16 ≤12 
 63 
Dùng kẹp vô trùng đặt các đĩa kháng sinh đã chọn lên mặt thạch, các đĩa 
kháng sinh cách nhau 2,5-3,5cm và cách rìa đĩa thạch 2cm. Đĩa được ủ trong 
tủ ấm CO2 ở nhiệt độ 37oC, sau 24 giờ đọc kết quả. Đường kính vòng vô 
khuẩn của các kháng sinh thử nghiệm được đo và đối chiếu với bảng tiêu 
chu