Luận án Nghiên cứu chế tạo vắc xin tái tổ hợp phòng bệnh do xoắn khuẩn Leptospira interrogans gây ra luận án tiến sĩ sinh học Hà Nội

 5 ml gel Ni-sepharose vào cột XK 16/20, rửa gel với 2 lần thể tích nƣớc 
cất diH2O. Gắn Ni
2+
 lên giá thể bằng cách cho 5 lần thể tích đệm NiSO4 50mM chảy 
qua. Cân bằng cột gel với 5 lần thể tích đệm phosphate 0,02M có bổ sung Imidazol 
5mM. Dịch chiết protein đƣợc cho lên cột với tốc độ 0,4 ml/phút. Sau đó, rửa các 
protein không gắn cột bằng đệm phosphate 0,02M có bổ sung Imidazol 60mM. Thu 
phần protein đƣợc gắn trên cột bằng đệm phosphate 0,02M có bổ sung Imidazol 
500mM. 
2.2.2. Các kĩ thuật sử dụng gây miễn dịch cho thỏ tạo kháng thể đặc hiệu kháng 
protein tái tổ hợp rLipL21 
Kháng thể đơn dòng đƣợc ứng dụng trong nhiều kĩ thuật khác nhau phục vụ 
cho chẩn đoán và điều trị. Để tạo kháng thể đơn dòng đặc hiệu với một kháng 
nguyên biết trƣớc có thể sử dụng các phƣơng pháp: (1) Gây miễn dịch trên động vật, 
(2) Tái tổ hợp DNA, (3) Sàng lọc từ các thƣ viện kháng thể (Phage dislay, Aptamer) 
43 
[107, 108]. Trong nghiên cứu này chúng tôi tạo kháng thể bằng phƣơng pháp gây 
miễn dịch trên thỏ. 
2.2.2.1. Chuẩn bị dung dịch tiêm để gây miễn dịch 
Dung dịch dùng để gây miễn dịch với mục đích kích thích cơ thể động vật thí 
nghiệm tạo kháng thể có khả năng kháng đặc hiệu với kháng nguyên biết trƣớc. Do 
đó, dung dịch gây miễn dịch cần phải có các yếu tố: (1) Tính lạ so với cơ thể, (2) Có 
thể tồn tại trong cơ thể động vật đủ lâu để gây xuất hiện các đáp ứng của hệ miễn 
dịch, (3) Không độc, không gây chết động vật thí nghiệm [109]. 
Để đảm bảo các tiêu chí (1) và (2) trong dung dịch gây mẫn cảm, ngoài 
kháng nguyên để gây đáp ứng miễn dịch luôn cần đƣợc phối hợp với một tá dƣợc có 
tác dụng giúp cho kháng nguyên có thể tồn tại trong cơ thể động vật đủ lâu để các 
hệ thống đáp ứng miễn dịch có thể nhận biết đƣợc. Tá dƣợc thƣờng đƣợc sử dụng 
hiện nay đó là dung dịch Freund’Adjuvant (Sigma, USA). Đây là một dung dịch 
nhũ hoá trong dầu khoáng gồm hai loại đó là Freund’Adjuvant hoàn toàn 
(Freund’Adjuvant complete) và Freund’Adjuvant không hoàn toàn 
(Freund’Adjuvant incomplete). Cấu tạo Freund’Adjuvant hoàn toàn gồm dung dịch 
nhũ hoá trong dầu khoáng và một loại vi khuẩn bất hoạt đông khô (thƣờng là vi 
khuẩn lao), còn Freund’Adjuvant không hoàn toàn thiếu các thành phần vi khuẩn 
đông khô, chỉ có nƣớc và nhũ tƣơng dầu. Freund’Adjuvant là một dung dịch nhũ 
hóa dầu, còn rLipL21 bản chất là protein hoàn tan trong nƣớc cất vì vậy rất khó hoà 
tan hoàn toàn cùng nhau. Nếu hai chất này không đƣợc hòa trộn hoàn toàn với nhau, 
khi tiêm cho động vật thí nghiệm rLipL21 sẽ nhanh chóng bị phân tán và đào thải 
không tồn tại đủ lâu để có thể gây đƣợc đáp ứng miễn dịch. Vì vậy kĩ thuật hòa tan 
và trộn đều kháng nguyên với tá dƣợc là khâu hết sức quan trọng đảm bảo thành 
công của thí nghiệm. 
Sự hòa trộn này đƣợc thực hiện trong điều kiện vô khuẩn bằng khuấy từ 
trong thời gian từ 2 đến 3 giờ. Dung dịch từ dạng ban đầu là 2 lớp dịch phân tách 
nhau của rLipL21 nổi trên dịch Freund’Adjuvant trong suốt. Sau khuấy từ dần 
chuyển thành thể huyễn dịch sệt và trắng đục nhƣ sữa. 
Dung dịch tiêm gồm 4 loại: 
44 
Dung dịch 1 gồm: 2ml rLipL21 nồng độ 500 µg + 2ml Freund’Adjuvant 
hoàn toàn, đã đƣợc khuấy thành huyễn dịch. 
Dung dịch 2 gồm: 2ml rLipL21 nồng độ 500 µg + 2ml Freund’Adjuvant 
không hoàn toàn, đã đƣợc khuấy thành huyền dịch. 
Dung dịch 3 gồm: 2ml NaCl 9‰ + 2ml Freund’Adjuvant hoàn toàn, đã đƣợc 
khuấy thành huyễn dịch. 
Dung dịch 4 gồm: 2ml NaCl 9‰ + 2ml Freund’Adjuvant không hoàn toàn, 
đã đƣợc khuấy thành huyễn dịch. 
2.2.2.2. Gây miễn dịch tạo kháng thể kháng kháng nguyên tái tổ hợp rLipL21 [110, 
111] 
Các thỏ trong nghiên cứu đƣợc chia thành 2 nhóm, mỗi nhóm gồm 3 thỏ: 
Nhóm 1: là 3 thỏ đƣợc gây miễn dịch với polEPCA-2. Dung dịch tiêm cho 
nhóm thỏ này là polEPCA-2.22, 2.19 + Freund’Adjuvant (gồm 2 loại: Dung dịch 1 
và 2). 
Nhóm 2: là 3 thỏ làm đối chứng, dung dịch tiêm cho nhóm này là NaCl 9‰ + 
Freund’Adjuvan (gồm 2 loại dung dịch 3 và 4). 
Đƣờng tiêm gây miễn dịch là tiêm vào cơ đùi và tiêm vào xoang phúc mạc: 
 Đƣờng tiêm vào cơ đùi đƣợc sử dụng khi gây miễn dịch cho thỏ ở các mũi 
tiêm 1, 2 và 3. 
Kĩ thuật tiêm: thỏ đƣợc cố định nằm ngửa trên bàn mổ. Bộc lộ phần mặt trong cơ 
đùi của chân sau. Cắt sạch lông vùng tiêm. Sát trùng vùng tiêm bằng cồn 700. Nâng 
nhẹ vùng cơ đùi, dùng kim đƣờng kính lớn (≥ 2mm) đƣa nhẹ nhàng vào giữa khối 
cơ, giữ nguyên vị trí kim rút nhẹ pít tông để đảm bảo không tiêm vào mạch máu, từ 
từ bơm huyễn dịch vào giữa cơ đùi. Rút kim và sát trùng lại vùng tiêm. 
 Đƣờng tiêm vào xoang phúc mạc đƣợc sử dụng khi gây miễn dịch cho thỏ ở 
mũi tiêm 4. 
Kĩ thuật tiêm: thỏ đƣợc cố định nằm ngửa trên bàn mổ. Cắt sạch lông vùng bụng. 
Sát trùng vùng tiêm bằng cồn 700. Dùng tay nâng cao vùng da bụng giữa 2 đùi sau, 
dùng kim đƣờng kính lớn (≥ 2mmm) đƣa nhẹ nhàng qua da vào trong ổ bụng. Giữ 
nguyên vị trí kim rút nhẹ pít tông để đảm bảo không đâm vào ruột, từ từ bơm dung 
dịch vào ổ bụng. Rút kim và sát trùng lại vùng tiêm. 
45 
Thời gian tiêm lặp lại: Các thỏ thí nghiệm đƣợc gây miễn dịch theo phác đồ 
4 mũi tiêm. Mỗi mũi cách nhau 7 ngày. 
Mũi tiêm 1: 
Ba thỏ của nhóm gây miễn dịch đƣợc tiêm dung dịch 1 (gồm: 2ml rLipL21 
nồng độ 500 µg + 2ml Freund’Adjuvant hoàn toàn). 
Ba thỏ của nhóm đối chứng đƣợc tiêm dung dịch 3 (gồm: 2ml NaCl 9‰ + 
2ml Freund’Adjuvant hoàn toàn). 
Mũi tiêm 2 (sau mũi tiêm 1 thời gian 7 ngày): 
Ba thỏ của nhóm gây miễn dịch đƣợc tiêm dung dịch 2 ( gồm: 2ml rLipL21 
nồng độ 500 µg + 2ml Freund’Adjuvant không hoàn toàn). 
Ba thỏ của nhóm đối chứng đƣợc tiêm dung dịch 4 (gồm: 2ml NaCl 9‰ + 
2ml Freund’Adjuvant không hoàn toàn). 
Mũi tiêm 3 (sau mũi tiêm 2 thời gian 7 ngày): 
Dung dịch tiêm của cả 2 nhóm thỏ giống ở mũi tiêm 2 
Sau tiêm mũi 3 đƣợc 7 ngày, thỏ đƣợc lấy máu tai, định lƣợng kháng thể 
trong huyết thanh, nếu nồng độ kháng thể tốt mới tiếp tục tiêm mũi 4. 
Mũi tiêm 4 (sau mũi tiêm 3 thời gian 7 ngày): 
Ba thỏ của nhóm gây miễn dịch đƣợc tiêm vào ổ bụng 4ml dung dịch 
rLipL21 nồng độ 500 µg. 
Ba thỏ của nhóm đối chứng đƣợc tiêm vào ổ bụng 4ml dung dịch NaCl 9‰. 
Sau mũi tiêm 4 tại thời điểm 15 ngày tất cả các thỏ đƣợc lấy máu tai để định 
lƣợng kháng thể. Ở ngày thứ 20 sau mũi tiêm 4 huyết thanh đƣợc định lƣợng kháng 
thể lại, nếu thấy nồng độ kháng thể đã đạt đỉnh lập tức thu máu thỏ toàn bộ để tủa 
loại bỏ albumin và đông khô để bảo quản kháng huyết thanh ở -80oC (Bảng 2.6) 
46 
Bảng 2.6. Công thức chia nhóm và dung dịch tiêm mẫn cảm. 
Mũi 
tiêm 
Dung dịch tiêm gây miễn dịch Đƣờng 
tiêm Nhóm thí nghiệm Nhóm chứng 
Mũi 1 2ml rLipL21 + 2ml 
Freund’Adjuvant hoàn 
toàn 
2ml NaCl 9‰ + 2ml 
Freund’Adjuvant hoàn toàn 
Tiêm cơ 
đùi 
Mũi 2 2ml rLipL21 + 2ml 
Freund’Adjuvant không 
hoàn toàn 
2ml NaCl 9‰ + 2ml 
Freund’Adjuvant không 
hoàn toàn 
Tiêm cơ 
đùi 
Mũi 3 2ml rLipL21 + 2ml 
Freund’Adjuvant 
không hoàn toàn 
2ml NaCl 9‰ + 2ml 
Freund’Adjuvant không 
hoàn toàn 
Tiêm cơ 
đùi 
Lấy máu tĩnh mạch rìa tai thỏ, định lƣợng kháng thể trong huyết thanh 
Mũi 4 4ml rLipL21 4ml NaCl 9‰ Tiêm ổ 
bụng 
Quá trình gây miễn dịch đƣợc lặp lại 3 lần trên 3 lô thỏ độc lập. 
2.2.2.3. Kỹ thuật phản ứng ngưng kết kháng nguyên - kháng thể 
Đây là một dạng chẩn đoán gián tiếp: dùng kháng nguyên mẫu (đã biết) để 
phát hiện kháng thể đặc hiệu trong các dịch của cơ thể, thƣờng là trong huyết thanh, 
nên còn gọi là phản ứng huyết thanh học. Mục đích: Nghiên cứu sự đáp ứng của cơ 
thể đối với kháng nguyên vi sinh vật; Đánh giá hiệu lực bảo vệ của vắc xin; Xác 
định hiệu giá đáp ứng miễn dịch bảo vệ [112, 113]. 
Phản ứng kết hợp giữa kháng nguyên tái tổ hợp (rLipL21) và kháng thể đặc 
hiệu thu đƣợc sau khi tiêm rLipL21 cho thỏ tạo thành phức hợp kháng nguyên - 
kháng thể dƣới dạng hạt ngƣng kết có thể quan sát đƣợc bằng mắt thƣờng (ngƣng 
kết định tính). Các bƣớc đƣợc thực hiện nhƣ sau: Máu thỏ sau khi lấy đƣợc cho vào 
ống falcon (loại 15 ml), không có chất chống đông, đặt nghiêng ống falcon trong 
khoảng từ 20 – 30 phút ở nhiệt độ phòng để hình thành cục máu đông, sau đó 
chuyển vào tủ lạnh 4oC trong 60 phút để thu đƣợc lƣợng huyết thanh nhiều nhất. Ly 
tâm ống falcon đựng máu với tốc độ 4000 - 5000 vòng/phút trong 10 phút ở 4oC. 
47 
Sau đó, dùng micropipette hoặc pipette nhựa vô trùng hút hết phần dịch huyết thanh 
(có màu vàng nhạt ở phía trên cục máu) cho vào ống Eppendorf 1,5 ml. Chuẩn bị 
phiến kính đã đƣợc lau sạch bằng cồn 70%, để khô phiến kính. Nhỏ vào mỗi ô 20µl 
mỗi loại kháng nguyên và kháng thể. Dùng que nhựa vô trùng ngoáy trộn đều hai 
dịch này với nhau, để im phiến kính ở nhiệt độ phòng, sau 5- 10 phút quan sát các 
hạt ngƣng kết. Nếu các hạt ngƣng kết xuất hiện ở nồng độ kháng nguyên và kháng 
thể tƣơng ứng thấp nhất nào thì kết luận đó chính là hiệu giá ngƣng kết giữa kháng 
nguyên và kháng thể đó. Điều kiện hình thành hạt ngƣng kết: Ngoài tính đặc hiệu 
giữa kháng nguyên và kháng thể, phải có thêm 2 điều kiện: (1) kháng nguyên và 
kháng thể đa giá (có nhiều vị trí kết hợp), (2) kháng nguyên và kháng thể có nồng 
độ tƣơng đƣơng. 
Nhỏ 1 giọt kháng nguyên tái tổ hợp (rLipL21) riêng biệt vào 2 giọt đó. Dùng que 
thủy tinh/ hoặc que gỗ vô trùng, trộn đều 2 giọt kháng nguyên - kháng thể. Sau 30”- 
1’ đọc kết quả 
(+): Phản ứng dƣơng tính (kháng nguyên và kháng thể đặc hiệu) 
(-): Phản ứng âm tính (kháng nguyên và kháng thể không đặc hiệu) 
(±): Phản ứng nghi ngờ (thực hiện lại phản ứng) 
2.2.2.4. Kỹ thuật phản ứng vi ngưng kết (Microscopic Agglutination Test: MAT) 
MAT là phƣơng pháp có thể áp dụng cho chẩn đoán huyết thanh học của 
bệnh Leptospirosis đối với cả ngƣời và động vật hiện nay. Khoảng 7 đến 10 ngày 
sau khi nhiễm bệnh, kháng thể có thể đƣợc phát hiện bởi phản ứng MAT. Đối với 
ngƣời và động vật, tiêu chuẩn để xác định các trƣờng hợp lâm sàng bệnh 
Leptospirosis bởi MAT là chuyển đổi huyết thanh giữa hai lần kiểm tra. Nếu huyết 
thanh đƣợc kiểm tra lần đầu khi xuất hiện các triệu chứng bệnh Leptospirosis rõ 
48 
ràng thì 3 đến 5 ngày sau kháng thể tăng rất cao, tuy nhiên thông thƣờng là 2 đến 3 
tuần vì không biết chính xác ngày bắt đầu bệnh [3]. Về nguyên lý, trộn huyết thanh 
của động vật nghi nhiễm bệnh với canh khuẩn Leptospira, nếu trong huyết thanh có 
kháng thể kháng Leptospira sẽ ngƣng kết thành cụm nhƣ hình sao, hình nhện hay 
cụm nhỏ (Tiêu chuẩn Việt Nam, 2011). 
2.2.2.5. Kĩ thuật Western Blot xác định kháng nguyên rLipL21 
Định lượng protein bằng phương pháp Bradford 
Xét nghiệm protein Bradford là một quy trình phân tích quang phổ nhanh để 
phân tích protein. Trong thử nghiệm này, tổng phản ứng dựa trên thành phần axit 
amin của các protein đƣợc đo. Nói cách khác, xét nghiệm protein Bradford là một 
xét nghiệm so màu, phụ thuộc vào sự thay đổi độ hấp thụ của thuốc nhuộm 
Coomassie màu xanh lam sáng G-250 tồn tại ở ba định dạng: cation (đỏ), anion 
(xanh lam) và trung tính (xanh lục). Trong điều kiện có tính axit, màu đỏ của thuốc 
nhuộm chuyển thành màu xanh lam, xác nhận sự liên kết của protein. Nếu không có 
protein, dung dịch có thể vẫn có màu nâu. Xét nghiệm protein Bradford khác với 
các xét nghiệm protein khác vì nó ít bị ảnh hƣởng bởi các hợp chất hóa học khác 
nhau có trong dung dịch protein. Các hợp chất này bao gồm natri, kali, glucose và 
sucrose, v.v. 
Chuẩn bị dung dịch Bradford: Hòa tan 100mg Coomassie Blue G250 trong 
50ml ethanol 95%. Sau đó cho thêm 100ml acid phosphoric 85% khuấy đều. Bổ 
sung thêm nƣớc cất cho đến một lít. Sau đó lọc bằng giấy lọc Whatman No1và trữ 
trong chai tối ở nhiệt độ phòng. Thuốc thử có thể sử dụng trong hai tuần nhƣng 
trong thời gian này thuốc thử có thể bị tủa nên khi sử dụng cần phải lọc lại. 
Chuẩn bị dung dịch protein chuẩn: Cân 3mg BSA, hòa tan trong 3ml nƣớc 
cất. Thu đƣợc dung dịch BSA mẹ có nồng độ 1mg/ml. Giữ ở -20oC. 
Xây dựng đƣờng chuẩn: Chuẩn bị dãy protein BSA chuẩn với nồng độ tăng 
dần từ 0, 30, 60, 120, 180, 240, 300 µg/ml. 
Bảng 2.7. Chuẩn bị các ống nghiệm và thêm vào các chất 
Ống nghiệm 1 2 3 4 5 6 7 
[BSA]( µl) 0 30 60 120 180 240 300 
V buffer (H2O cất) (µl) 1000 970 940 880 820 760 700 
49 
Lắc đều các ống. Lấy 100 µl dung dịch từ các ống nghiệm trên cho vào một dãy ống 
nghiệm đƣợc đánh số tƣơng tự. Cho vào mỗi ống 2 ml thuốc thử. Lắc đều ống bằng 
máy vortex. Tránh để có bọt. Sau 10 phút tiến hành đo OD. Định chuẩn máy quang 
phổ với dung dịch đệm (ống 1) ở bƣớc sóng 595nm. Chỉnh OD về giá trị 0. Tiến 
hành đo các ống còn lại. 
Ghi nhận kết quả: Tính giá trị trung bình 3 lần lặp lại thí nghiệm. 
Vẽ biểu đồ đƣờng chuẩn BSA thể hiện mối tƣơng quan tuyến tính giữa nồng độ 
protein (µg/ml) với độ hấp thụ (OD) ở bƣớc sóng 595nm. 
Tính nồng độ protein: 
Vẽ đƣờng tuyến tính giữa nồng độ protein (µg/ml) với mật độ quang OD595 
Dựa vào phƣơng trình đƣờng tuyến tính giữa nồng độ protein (µg/ml) với 
mật độ quang OD595 ở trên ta tính đƣợc hàm lƣợng protein P trong mẫu phân tích X. 
P = X*n 
Để tính toán hàm lƣợng protein trong 1g mẫu cân: 
Protein (mg/g) = P x V/m 
V = thể tích dung dịch trích ly, ml 
m = khối lƣợng mẫu, g 
Điện di protein trên gel polyacrylamide có SDS (SDS-PAGE) 
Dịch chiết chứa protein OmpL1 và LipL21 đƣợc thu trong đệm Phosphate 
0,02M có bổ sung Imidazol 500mM. 
15µl dịch chiết đƣợc bổ sung 5µl SBB. Sau đó, hỗn hợp đƣợc đem đi đun ở 
nhiệt 95oC trong 5 phút. Sau 5 phút, hỗn hợp đƣợc đặt ngay trên đá rồi li tâm 13.000 
vòng/phút, 24
oC, trong 5 phút. Thu lại dịch nổi để chạy điện di trên gel acrylamide 
theo phƣơng pháp của Laemmli. 
Gel acrylamide chạy điện di gồm 2 lớp: lớp gel tách 12,5% và lớp gel cô 5%, 
tỷ lệ thành phần nhƣ Bảng 2.5 trong phần Phƣơng pháp nghiên cứu. 
Mẫu đƣợc tra vào giếng. Điện di đƣợc thực hiện với đệm Tris-glycine pH 
8,8 chứa SDS 1% với điện thế ổn định 10 volt/cm gel cho tới khi vạch màu chỉ thị 
(bromophenol xanh) cách đáy bản gel 0,5 cm thì dừng lại. Bản gel điện di đƣợc 
nhuộm với dung dịch CBB 0,5% pha trong hỗn hợp methanol: axetic: nƣớc với tỉ lệ 
50 
thể tích là 3:1:6 khoảng 20 phút. Gel đƣợc tẩy bằng hỗn hợp đã dùng để pha CBB 
cho tới khi bản gel có nền sáng. 
Chuyển màng và phát hiện protein bằng chất phát huỳnh quang 
Chuyển protein gel lên màng lai: Để các protein có thể phát hiện đƣợc kháng 
thể thì protein phải đƣợc chuyển từ gel lên màng lai. Phƣơng pháp chính để chuyển 
các protein đƣợc gọi là phƣơng pháp thẩm tách điện là sử dụng một dòng điện để 
kéo các protein từ gel lên màng PVDF hoặc màng nitrocellulose. Các protein đƣợc 
chuyển lên màng mà vẫn duy trì sự sắp xếp nhƣ trên bản gel. Kết quả là protein sẽ 
đƣợc phơi ra trên lớp mỏng bề mặt để tiến hành xác định. 
Xử lý màng lai (Blocking): Do kháng thể và protein đích đều là protein, nên 
thƣờng thực hiện các bƣớc để ngăn chặn liên kết giữa màng và kháng thể đƣợc sử 
dụng để xác định protein mục tiêu. Việc ngăn chặn các liên kết không đặc hiệu bằng 
cách đặt màng vào dung dịch protein loãng albumin huyết tƣơng bò 3-5 % (BSA) 
hoặc sữa bột không béo trong Tris – Buffered saline (TBS). Protein trong dung dịch 
loãng sẽ gắn với màng ở tất cả các vị trí mà protein đích chƣa gắn vào. Do đó khi 
kháng thể đƣợc bổ sung vào, sẽ không còn chỗ bám trên màng ngoại trừ các vị trí 
liên kết đặc hiệu với protein đích. Điều này làm giảm nhiễu cơ bản trong sản phẩm 
cuối cùng của Western Blot, cho kết quả rõ ràng và ngoại trừ hiện tƣợng dƣơng tính 
giả. 
Quá trình lai và phát hiện vị trí lai: Để phát hiện các protein chuyên biệt, 
màng đƣợc dò protein quan tâm bằng kháng thể đã biến đổi có khả năng liên kết với 
enzyme thông báo, enzyme này khi kết hợp với một cơ chất tƣơng ứng sẽ thúc đẩy 
phản ứng hấp thụ quang và tạo màu. Quá trình này diễn ra gồm 2 bƣớc: (1) Màng 
lai đã cố định protein đƣợc lai với kháng thể sơ cấp. Kháng thể sơ cấp là một kháng 
thể đặc hiệu rLipL21 đƣợc tạo ra khi cho thỏ đƣợc tiêm protein tái tổ hợp rLipL21. 
(2) Sau khi rửa màng để loại bỏ kháng thể sơ cấp chƣa liên kết, màng tiếp tục gắn 
kháng thể thứ hai (kháng thể thứ cấp) có gắn enzyme (sử dụng horseradish 
peroxidase). Tiếp tục ủ màng lai trong một hỗn hợp phản ứng đặc hiệu với enzyme. 
Đặt 1 tấm phim nhạy cảm với tia X lên màng lai để phát hiện các điểm sáng phát ra 
do enzyme. Có thể sử dụng nhiều phƣơng pháp để phát hiện kháng thể thứ cấp: sử 
51 
dụng bức xạ hồng ngoại gần liên kết với kháng thể gắn chất huỳnh quang, sử dụng 
đánh dấu phóng xạ. 
2.2.3. Kỹ thuật sản xuất vắc xin tái tổ hợp rLipL21 
2.2.3.1. Kiểm tra tính sinh miễn dịch với hàm lượng protein tái tổ hợp rLipL21 khác 
nhau 
Để có cơ sở đánh giá chất lƣợng kháng nguyên tái tổ hợp (protein tái tổ hợp 
rLipL21) chúng ta phải định lƣợng hàm lƣợng protein có trong dung dịch mẫu theo 
nguyên tắc từ nồng độ thấp đến nồng độ cao. 
Dung dịch mẫu sẽ đƣợc chia làm các nồng độ từ 100 µg - 250 µg - 500 µg, sau 
đó tiêm cho thỏ (2 - 2,5kg/con) 2 mũi cách nhau 7 ngày. Mỗi nồng độ tiêm cho 04 
thỏ, đối chứng (-) là 02 thỏ không tiêm. Sau 14 - 21 ngày tiến hành lấy máu, chắt 
huyết thanh và kiểm tra hàm lƣợng kháng thể trong huyết thanh bằng phản ứng 
ngƣng kết kháng nguyên - kháng thể. 
Kiểm tra kết quả: kiểm tra qua phản ứng vi ngƣng kết (MAT) trên phiến kính 
với các chủng Leptospira đang nghiên cứu cùng huyết thanh ở nồng độ pha loãng 
1/50. Đọc kết quả sau 20-30 phút trên kính hiển vi nền đen. Nếu có 2 mẫu huyết 
thanh dƣơng tính, trong khi đối chứng âm tính thì protein ở nồng độ đó đạt yêu cầu 
về tính sinh miễn dịch và có thể sử dụng để chế tạo vắc xin. 
2.2.3.2. Kỹ thuật tạo vắc xin tái tổ hợp rLipL21 
Dung dịch mẫu chứa protein ở nồng độ (hàm lƣợng protein) tối ƣu. Cụ thể: 
không gây độc trên chuột lang non và thỏ non; đồng thời có tính sinh miễn dịch và 
có miễn dịch chéo giữa 5 chủng Lepto nghiên cứu. 
Chuẩn bị chất bổ trợ: Chất bổ trợ là nhũ dầu đạt tiêu chuẩn cơ sở, đảm bảo an toàn. 
Phối trộn và chia liều vắc xin: Tỷ lệ phối trộn: Nhũ dầu/ kháng nguyên = 1/1 
Chuẩn bị: 
Nhũ dầu gồm 3 thành phần đơn với tỷ lệ là Eolan: Span: Tween 80 = 9:6:4 
các chất đƣợc hấp vô trùng riêng biệt. Bơm Span vào cốc chứa Eolan và khuấy với 
tốc độ 3.500 vòng/phút trong thời gian 10 phút; tiếp tục bơm Tween 80 vào và duy 
trì tốc độ 3.500 vòng/phút trong thời gian 10 phút. Thu hoạch đƣợc nhũ dầu. Nhũ 
tạo sẽ đƣợc lọc vô trùng qua màng lọc 0,2 µm. 
52 
Protein chuẩn đã kiểm tra các chỉ tiêu (hàm lƣợng protein, độc lực, tính sinh 
miễn dịch) sẽ đƣợc kiểm tra vô trùng trên 4 loại môi trƣờng cơ bản, theo dõi trong 
thời gian 7 – 10 ngày. Nếu không có vi sinh vật nào phát triển là đạt và đƣa vào sản 
xuất vắc xin. 
Máy tạo nhũ: Prioneer tốc độ vòng tối đa 7.000 vòng/phút 
Chậu đá, cốc đong (hấp vô trùng 1210c/15’) 
Phối trộn: Cho nhũ đã vô trùng vào cốc đong, khuấy với tốc độ 5.000 vòng/phút 
trong thời gian 5 phút, bơm từ từ Protein chuẩn vào, vẫn duy trì tốc độ 5.000 
vòng/phút. Sau khi bơm hết lƣợng Protein vào thì duy trì tốc độ 5.000 vòng/phút 
trong thời gian 10 phút tiếp theo và thu hoạch đƣợc bán thành phẩm vắc xin. Lƣu ý: 
Trong cả quá trình phải để cốc đong thao tác (bình chứa) trong chậu đá để duy trì 
nhiệt độ. 
Thu hoạch: Bán thành phẩm đƣợc kiểm tra vô trùng và bảo quản ở nhiệt độ 2 - 80C. 
Sau khi có kết quả kiểm tra vô trùng đạt tiêu chuẩn thì tiến hành chia liều. 
Do đã xác định đƣợc hàm lƣợng protein là bao nhiêu thì sẽ có khả năng sinh 
miễn dịch nhƣ đã làm phía trên nên khi phối trộn ta phải tính toán để trong 1 liều 
tiêm sẽ có đủ hàm lƣợng protein cần thiết. 
2.2.3.3. Định liều tiêm vắc xin 
Căn cứ vào hàm lƣợng protein đã tính ở trên, ta tiến hành định liều tiêm là 1- 
2ml. Vấn đề quan trọng là trong liều tiêm có lƣợng kháng nguyên đủ để sinh miễn 
dịch trên động vật. Cụ thể: 
Tiến hành gây miễn dịch bằng cách tiêm dƣới da cho 4 thỏ mẫn cảm (2-2,5kg), 
mỗi liều vắc xin quy định (1ml hoặc 2ml) tiêm 2 thỏ. Tiêm lần một vào ngày 0 cho 
bản động vật. Sau 7 ngày thỏ đƣợc miễn dịch tiếp, mỗi con một liều vắc xin quy 
định lần 2 cho bản động v