Luận án Nghiên cứu chọn tạo giống lúa kháng rầy nâu với sự trợ giúp của chỉ thị phân tử

ác 
tương đối khá. 
Dòng IS1.2, IS2.3 và RS là các dòng lúa đã được qui tụ hai gen kháng 
rầy nâu Bph3 và BphZ(t) từ giống lúa IR72, Rathu Heenati và GC9. Giống 
lúa IR72 và giống lúa Rathu Heenati mang gen Bph3, dòng lúa GC9 mang 
gen BphZ(t), hai gen này đều đã được xác định là kháng với quần thể rầy nâu 
56 
ở ĐBSH và ĐBSCL. Các giống lúa OM1490, IR73689-76-2, Babawee kháng 
với quần thể rầy nâu ở ĐBSCL được xác định là mang gen Bph10, Bph15, 
bph4 và một gen mới. Các gen này đã được định vị trên NST của lúa. Các 
chỉ thị liên kết với các gen được xác định là các chỉ thị SSR, STS và RFLP. 
Các chỉ thị RM586; RM588; RM589; RM190 liên kết gen Bph3 trên NST số 
6. Các chỉ thị RM3524; RM1388; RM3367; RM3735; RM5757; RM6997 liên 
kết gen BphZ(t) trên NST4. 
Trong nghiên cứu này, gen BphZ(t) là một gen đã được đánh giá là 
kháng rầy hiệu quả trong những nghiên cứu trước của phòng Sinh học Phân tử 
viện Di truyền Nông nghiệp và đã được lập bản đồ trên NST của lúa. Gen này 
đã được quy tụ vào dòng lúa IS1.2, IS2.3 và RS từ dòng lúa GC9 (có nguồn 
gốc từ dòng lúa Swanalata của IRRI). Các chỉ thị liên kết gen kháng BphZ(t) 
được thể hiện trên bản đồ gen. 
Trong các cặp mồi SSR sử dụng phân tích gen BphZ(t) các cá thể của 
các dòng BC, cặp mồi RM5757 là cho đa hình tốt. Tuy nhiên, cặp mồi này 
nằm khá xa gen kháng nên chúng tôi phân tích thêm cặp mồi RM3367 và cặp 
mồi RM1388 nằm về 2 phía của gen BphZ(t). Trên hình 2.2 minh họa thí 
nghiệm sử dụng cặp mồi RM5757 để phân tích sự có mặt của gen kháng trong 
các cá thể BC1F1 của tổ hợp lai giữa dòng lúa KDĐB và IS1.2. Đã chọn lọc 
được những cá thể mang chỉ thị liên kết gen kháng rầy BphZ(t). Trong khi 
phân tích, chúng tôi đã phát hiện có một số dòng của tổ hợp lai SL12/IS1.2 
lúc đầu có mang chỉ thị liên kết RM5757. Nhưng sau vài thế hệ lai trở lại, 
phân tích bằng chỉ thị này cho kết quả âm tính với RM5757, nhưng vẫn mang 
băng của chỉ thị liên kết gần hơn là RM3367. 
 Các cá thể mang gen kháng rầy BphZ(t) được tiếp tục phân tích bằng 
các chỉ thị liên kết gen Bph3 để xác định các dòng mang CTPT liên kết với cả 
2 gen kháng rầy nâu. 
Phân tích di truyền gen kháng rầy nâu ở 2 dòng IS1.2, IS2.3, mang 2 
gen Bph3 và BphZ(t), có 2 gen trội kháng rầy nâu nằm trên 2 nhiễm sắc thể 
57 
khác nhau. Trên cơ sở bản đồ gen Bph3 trên NST số 6 và BphZ(t) trên NST số 
4, tiến hành lựa chọn các chỉ thị phân tử liên kết gen kháng rầy nâu. 
- Bản đồ phân tử chi tiết cho gen kháng rầy Bph3, bao gồm 7 chỉ thị phân 
tử SSR liên kết chặt với gen kháng và nằm ở 2 phía của gen. Gen kháng sẽ 
được sử dụng trong quy trình chọn giống lúa kháng rầy nâu với sự trợ giúp 
của chỉ thị phân tử . 
Trong nghiên cứu này, gen BphZ(t) đã được đánh giá là gen kháng rầy 
nâu hiệu quả trong những nghiên cứu khoa học trước đây của phòng sinh học 
phân tử Viện di truyền nông nghiệp và đã được lập bản đồ trên nhiễm sắc thể 
số 4 của lúa. Gen này đã được quy tụ vào dòng lúa IS1.2 và IS2.3 và IS từ 
dòng lúa GC9 (có nguồn gốc từ Swanalata) 
Hình 2.1. Bản đồ phân tử chi tiết gen kháng rầy nâu Bph3 
Bản đồ liên kết gen Bph3 trên nhiễm sắc thể số 6 bao gồm 7 chỉ thị SSR. 
(Jarin và cs, 2007a; 2010) [84], [86] 
58 
- Bản đồ phân tử chi tiết cho gen kháng rầy BphZ(t), bao gồm 15 chỉ thị 
phân tử SSR liên kết chặt với gen kháng và nằm ở 2 phía của gen. Gen kháng 
sẽ được sử dụng trong quy trình chọn giống lúa kháng rầy nâu với sự trợ giúp 
của chỉ thị phân tử . 
Kết quả thử nghiệm mức độ kháng nhiễm của các dòng lúa nhận gen 
(recipient) và cho gen (donor) đối với quần thể rầy nâu ở ®ồng bằng Sông 
Hồng (ĐBSH) và ®ồng bằng sông Cửu Long (ĐBSCL) trình bày ở bảng 1.4 
Hình 2.2. Bản đồ phân tử chi tiết gen kháng rầy nâu BphZ(t) 
 Nhiễm sắc thể số 4 ë lóa Bản đồ liên kết gen BphZ(t) 
BphZ(t) 
59 
Bên trái: Nhiễm sắc thể số 4 ë lóa 
Bên phải: Bản đồ liên kết gen BphZ(t) bao gồm 15 chỉ thị SSR. (khoảng cách: 
cM) (Lưu Thị Ngọc Huyền và cs,2003; 2010) [20], [24] 
2.1.2.2. Giống nhận gen (recipient) 
* Các dòng nhận gen phải thoả mãn các điều kiện sau: 
- Nhiễm rầy nâu 
- Có năng suất cao và các đặc tính nông sinh học khác phù hợp với 
vùng sinh thái ở nơi canh tác 
* Giống lúa IR64 
(Nguồn :  
 - Nguồn gốc: Giống lúa IR64 (còn gọi là OM 89) là giống nhập nội và 
tuyển chọn từ Viện lúa Quốc tế IRRI, được lai tạo từ tổ hợp lai giữa IR 5657-
33/IR 2061-465; là giống tương đối phổ biến ở Việt Nam, mang 1 gen kháng 
Bph1 cùng với các QTL kháng rầy nâu. Tuy nhiên đã bị nhiễm rầy nâu ở mức 
độ nhẹ. Được công nhận giống chính thức theo Quyết định số 402 QĐ/BNN-
KHCN, ngày 27 tháng 11 năm 1986 của Bộ Nông Nghiệp & PTNT. 
 - Đặc tính: 
+ Thời gian sinh trưởng 105 – 115 ngày trong điều kiện gieo mạ cấy và 
95 – 100 ngày khi sạ thẳng. 
+ Chiều cao cây: 95-105cm. Dạng hình đẹp, cứng cây, chịu phân. Khả 
năng chống đổ trung bình. Chịu phèn khá. 
+ Nhiễm rầy nâu (cấp 5-7) rất kháng đạo ôn (cấp 1), hơi kháng bạc lá 
(cấp 3-5), nhiễm khô vằn (cấp 5-7). 
 + Năng suất: Năng suất bình quân, vụ Hè Thu 4 – 5 tấn/ ha, vụ Đông 
Xuân 6,0 – 6,5 tấn/ha, nếu thâm canh tốt có thể đạt 7,0 – 8,0 tấn/ha. 
+ Hạt gạo dài, trắng, không bạc bụng, cơm dẻo, ngon. 
+ Chiều dài hạt trung bình: 7,19 mm. 
+ Hàm lượng amilose (%): 24,4. 
+ Khèi lượng 1000 hạt: 26 - 27 gram. 
+ Đây là giống thích hợp với vùng ĐBSCL, Đông Nam Bộ và miền 
Trung Tây Nguyên trong các năm qua. 
60 
 - Thời vụ gieo trồng và các đặc tính kỹ thuật 
+ Là giống gieo cấy ở trà đông xuân sớm, vụ hè thu ở Miền Nam, vụ 
xuân muộn hoặc vụ mùa sớm ở Miềm Bắc, vụ hè thu ở miền trung. 
+ Thích ứng rộng, có thể gieo cấy trên chân đất phù sa cổ có Glây hoá, 
đất phù sa phèn nhẹ, vàn, vàn trũng (đất chua, thiếu lân, nhiễm mặn nhẹ) có 
độ phì không cao. 
2.1.3. Các nguyên vật liệu phục vụ nghiên cứu 
2.1.3.1. Các chỉ thị phân tử SSR liên kết gen Bph3 và BphZ(t) . 
Bảng 2.1 và bảng 2.2 là danh sách và trình tự 4 chỉ thị xác định gen 
kháng gen Bph3 và 6 chỉ thị xác định gen kháng BphZ(t) 
Bảng 2.1. Danh sách các chỉ thị sử dụng trong chọn giống 
NST Gen liên kết Tên mồi 
6 Bph 3 RM588, RM190, RM586, RM589, 
4 BphZ(t) 
RM119, RM5757, RM6997, RM3524, RM 3367, 
RM1388, RM3735 
Bảng 2.2. Trình tự các mồi liên kết với gen kháng Bph3 và BphZ(t) 
TT 
Tên mồi 
Trình tự mồi 
Chiều 
dài đoạn 
nhân bội 
Nhiệt độ 
gắn mồi 
Những mồi liên kết gen Bph3 trên nhiễm sắc thể số 6 là: 
1 RM 588 GTTGCTCTGCCTCACTCTTG 
AACGAGCCAACGAAGCAG 
125 55 
2 RM 190 CTTTGTCTATCTCAAGACAC 
TTGCAGATGTTCCTGATG 
120 55 
3 RM586 ACCTCGCGTTATTAGGTACCCGA
GATACGCCAACGAGATACC 
271 55 
61 
4 RM589 CTATGTCTATTTCAAGACAG 
ATGCAGATGTTCCTGATC 
130 55 
Những mồi liên kết gen BphZ(t) trên nhiễm sắc thể số 4 là: 
1 RM 5757 CCTGAGACCATATGCTGCTG 
GAGGGAGCATCATTAGCTGG 
170 50 
2 RM 6997 CAACGCGGCAGTAAATTTGC 
GGCCTTGTCAGTCTACATGC 
154 50 
3 RM 3524 CGGAGCTGGTCTAGCCATC 
GTCTCCGTCTTCCTCACTCG 
126 55 
4 RM 3367 GGATCCATCCATCCACTGAC 
GGATATGTGCTGCTGTGTGC 
126 55 
5 RM 1388 TTCAATGAGGCAAAGGTAAG 
ATTGTAGCTTGGACTAGGGG 
236 55 
6 RM 3735 GCGACCGATCAGCTAGCTAG 
ATAACTCCTCCCTTGCTGCC 
138 50 
7 RM 119 CATCCCCCTGCTGCTGCTGCTG 
CGCCGGATGTGTGGGACTAGCG 
166 67 
(Nguồn : Gramene.org) 
2.1.3.2. Nguồn rầy nâu 
 - Rầy nâu dùng cho nghiên cứu được thu thập từ các tỉnh vùng Đồng 
bằng sông Hồng và vùng Đồng bằng sông Cửu Long 
2.1.3.3. Thiết bị, vật tư hóa chất 
- Máy móc thiết bị phục vụ nghiên cứu đảm bảo đủ điều kiện và độ 
chính xác theo yêu cầu của đề tài, Tại Phòng thí nghiệm của Bộ môn sinh học 
phân tử , Viện Di truyền nông nghiệp. 
­ Các vật tư, hoá chất dùng trong nghiên cứu được mua từ các hãng 
GenSet, Pharmacia, Sigma, Boehringer, Promega, BioRad, ... 
62 
2.2. Phương pháp nghiên cứu 
2.2.1. Phương pháp đánh giá khả năng kháng/nhiễm rầy nâu của các 
dòng/giống lúa 
- Quần thể rầy nâu được thu thập từ một số tỉnh thuộc đồng bằng sông 
Hồng (ĐBSH) và Đồng bằng sông Cửu long (ĐBSCL) nuôi và nhân trong 
lồng cách ly, nuôi từ 30-40 ngày tuổi sao cho chúng đẻ trứng và trứng nở 
thành rầy cám, nguồn thức ăn là giống lúa TN1. 
- Mạ được gieo theo phương pháp gieo khô, các dòng/giống lúa được 
bố trí ngẫu nhiên với 3 lần nhắc lại . Khi mạ được 2 lá khoảng 7- 8 ngày tuổi 
cho nhiễm rầy nâu tuổi 2 với mật độ 5- 6 con/cây. Sau 7 – 8 ngày tiến hành 
đánh giá độ kháng/nhiễm rầy nâu khi cây TN1 (ChuÈn nhiễm) chết hết. Đánh 
giá tính kháng nhiễm rầy nâu theo thang điểm chuẩn của IRRI (Viện nghiên 
cứu lúa Quốc tế), (Bảng 2.3). 
Bảng 2.3. Thang điểm đánh giá tính kháng/ nhiễm rầy nâu (IRRI) 
Tại thời điểm cây TN1 chết hoàn toàn, những cây còn sống sót được 
coi là kháng, những cây chết được coi là nhiễm. 
Viện BVTV đã đưa ra một thang điểm chi tiết hơn dựa trên cơ sở thang 
điểm cơ bản của IRRI. (Bảng 2.4) 
Cấp độ Mức gây hại với cây chủ Đánh giá Kí hiệu 
0 Cây phát triển bình thường, không bị hại Kháng cao KC 
1 Cây phát triển bình thường, lá 1 và 2 bị vàng Kháng cao KC 
3 Có 10% cây chết, lá 1, 2 bị vàng Kháng K 
5 
Có khoảng 20% - 50% số cây chết, lá 
1, 2 và 3 bị vàng nặng 
Kháng TB KV 
7 
Chết trên 50%, số cây còn lại vàng 
không phát triển được 
Nhiễm N 
9 100% số cây bị chết Nhiễm cao NC 
63 
Bảng 2.4. Thang điểm đánh giá tính kháng/ nhiễm rầy nâu (Viện BVTV) 
Cấp 
độ 
Mức gây hại với cây chủ Đánh giá Kí hiệu 
0 
Không có cây chết, phát triển bình 
thường 
Kháng cao KC 
1 Số cây chết từ 0 -> 10% Kháng cao KC 
2 Số cây chết từ 11 -> 15% Kháng K 
3 Số cây chết từ 16 -> 20% Kháng K 
4 Số cây chết từ 21 -> 35% Kháng vừa KV 
5 Số cây chết từ 36 -> 50% Kháng-nhiễm K/N 
6 Số cây chết từ 51 -> 65% Nhiễm nhẹ NV 
7 Số cây chết từ 66 -> 80% Nhiễm N 
8 Số cây chết từ 81 -> 90% Nhiễm nÆng NN 
9 Số cây chết từ 91 -> 100% Nhiễm nÆng NN 
2.2.2. Phương pháp lai hồi giao, qui tụ gen kháng rầy từ dòng/giống cho 
gen vào giống lúa ưu việt 
Cặp lai được lựa chọn là dòng /giống cho gen kháng rầy (donor) mang 
gen kháng và có đặc tính kháng cao, dòng hoặc giống nhận gen là những 
dòng/giống có các đặc điểm ưu việt như chất lượng gạo ngon, năng suất cao, 
các đặc điểm nông sinh học đáp ứng nhu cầu sản xuất. Khi gieo hạt phải tính 
toán thời gian sinh trưởng của các dòng/giống cho và nhận gen sao cho thời 
gian trç b«ng phải trùng nhau. Tiến hành theo những bước sau: 
- Gieo hạt cây bố mẹ, chăm sóc cây đến khi trç b«ng. Chọn những hoa 
phát triển tốt, có khả năng cho hạt bình thường. (Hình 2.3) 
64 
 Hình 2.3. Cấu tạo hoa lúa 
 Nguồn :  lua.org.vn 
- Tiến hành khử đực cây mẹ khi lúa bắt đầu trổ bông. Mỗi bông chọn 
15 - 25 hoa ở giữa bông, không chọn hoa ở đầu bông và cuối bông. Khử đực 
bằng tay. Khử đực ®­îc tiến hành khi vách bao phấn chưa mở, kh«ng ®Ó gây 
tổn thương hoa, khử ®ùc khi hạt ch­a được thụ phấn. Khử đực b»ng c¸ch cắt 
vát vỏ phần nửa trên của hoa, chú ý không cắt vào vòi nhôy, sau đó dùng 
panh nhỏ vµ máy thổi để loại bỏ hết nhị đực trong hạt lúa. 
- Sau khi khử đực xong tiến hành cách ly các hoa để tránh giao phấn từ 
những cây khác trong quần thể bằng cách bao giấy bóng mờ hay những bao 
nilong để tránh mưa, vừa tạo cho cây và hoa quang hợp. Sau khi khử đực 1-2 
ngày có thể cho thụ phấn. Chuẩn bị phấn của cây bố để thụ phấn cho cây mẹ, 
cần phải chuẩn bị luợng phấn đủ để thụ phấn cho hoa của những cây mẹ đã 
khử đực. 
Thông thường, chúng tôi tiến hành khử đực chiều hôm trước và cho thụ 
phấn vào 10-12 giờ ngày hôm sau vì đó là thời gian vòi nhụy dễ dàng tiếp 
nhận và hạt phấn dễ nẩy mầm ở trên đầu nhụy. Cũng có thể để cây bố và mẹ 
cạnh nhau hay có thể rũ phấn cây bố vào cây mẹ hoặc dùng panh nhỏ gắp bao 
phấn đặt lên vòi nhụy. Khi thụ phấn nên dùng những hạt phấn ở trên những 
65 
cây bố khoẻ, hoa tươi mới. Sau thụ phấn, tiến hành chăm sóc cây và các biện 
pháp chống côn trùng phá hoại hạt lai. Sau 25- 30 ngày có thể thu hạt lai. 
2.2.3. Phương pháp thu thập thông tin các chỉ thị sử dụng trong nghiên cứu. 
 Các thông tin về các chỉ thị phân tử SSR sử dụng trong nghiên cứu 
được tham khảo từ các tài liệu, báo cáo khoa học, bài báo quốc tế và 1 số 
website trên Internet trang  thông tin đầy đủ về 
các chỉ thị phân tử. 
2.2.4. Phương pháp chọn tạo các dòng lúa kháng rầy nâu trên cơ sở sử 
dụng công nghệ chỉ thị phân tử 
2.2.4.1. Chọn tạo các dòng lúa ưu tú từ quần thể phân ly (F2 trở đi đến F6) 
mang tổ hợp gen mong muốn 
- Đánh giá và chọn dòng cá thể từ thế hệ F2 trở đi đến F6 trên đồng 
ruộng thông qua đánh giá các đặc tính nông sinh học và các yếu tố cấu thành 
năng suất của các tổ hợp lai. 
- Sử dụng kỹ thuật chỉ thị phân tử SSR để phát hiện các cá thể mang 
các gen kháng rầy nâu cần thiết từ thế hệ F1 trở đi đến F6. 
- Kiểm tra tính kháng rầy nâu của các dòng mang gen kháng trong nhà 
lưới để chọn ra dòng kháng rầy nâu hiệu quả bằng phương pháp đánh giá của 
IRRI và Viện BVTV. 
2.2.4.2. Chọn tạo các dòng lúa ưu việt trên cơ sở hồi giao các dòng lúa ưu 
tú sẵn có và được kết hợp thêm tính trạng kháng rầy nâu 
- Trên cơ sở các tổ hợp lai với các donor mang gen kháng rầy nâu hiệu 
quả, tiến hành hồi giao từ BC1F1 đến BC5F1 hoặc BC6F1. 
- Sử dụng kỹ thuật chỉ thị phân tử để phát hiện các cá thể BCnF1 mang 
gen kháng rầy nâu cần thiết. 
- Kiểm tra tính kháng rầy nâu của các dòng mang gen kháng trong nhà 
lưới để chọn ra dòng kháng rầy nâu hiệu quả. 
2.2.5. Một số kỹ thuật dùng trong phòng thí nghiệm 
2.2.5.1. Tách chiết ADN và tinh sạch theo phương pháp CTAB 
66 
 ADN lúa được tách chiết và tinh sạch theo phương pháp CTAB theo 
protocol của phòng thí nghiệm Di truyền học của trường Đại học Tổng hợp 
Ghent Bỉ ( Đã được Phòng Sinh học Phân tử Viện Di truyền Nông nghiệp cải 
tiến). 
* Hoá chất dùng trong tách chiết ADN 
 + Đệm chiết (extraction buffer) gồm có các thành phần: (Bảng 2.5) 
Bảng 2.5. Thành phần dung dịch EB (Extraction buffer) 
Thành phần V = 100 ml 
dH2O 63ml 
Tris HCl 1M; pH = 8.0 10ml 
NaCl 5M 10ml 
EDTA0,5; pH = 8.0 10ml 
 - Mercaptol ethanol 7l 
 + Dung dịch CTAB Buffer và TE (10 : 0,1) 
Bảng 2.6. Thành phần dung dịch CTAB Buffer và dung dịch TE (10 : 0,1) 
+ Dung dịch SDS (Sodium dedoxyl sulfat) 10% 
+ Ethanol 96% 
+ Ethanol 70% 
+ Isopropanol alcohol 
+ Chloroform : isomyl alcohol (24:1) 
Đệm CTAB V = 500ml 
Đệm TE (10:0.1) 
V= 
100ml 
CTAB 10 g TrisHCl 1M; pH = 8.0 1000l 
EDTA 0.5M pH= 8 50ml EDTA 0,5M; pH = 8.0 20l 
NaCl 5M 200ml dH20 98.8ml 
TrisHCl 1M ; pH = 
7.5 
100ml 
dH20 150ml 
67 
+RNase (10mg/ml) 
* Các bước tiến hành 
Phương pháp này cho ADN có chất lượng cao, rẻ tiền nhưng tốn nhiều 
thời gian hơn so với các phương pháp khác. Quy trình thực hiện gồm các bước: 
1. Lá của các dòng, giống lúa nghiên cứu được cắt lấy mẫu sau khi cấy 
khoảng 1 tháng. Mẫu được lấy vào sáng sớm là lúc nồng độ muối trong lá 
thấp. các enzym hoạt động ít là điều kiện tốt để tách chiết ADN. 
2. Nghiền mẫu trong Eppendorf (hoặc cối sứ) thành dạng bột mịn, khi 
nghiền luôn để mẫu trong nitơ lỏng. 
3. Cho mẫu vào Eppendorf 2ml và cho 1ml đệm chiết (extraction 
buffer) rồi đảo đều, giữ trong đá và thêm 50l SDS 10%. 
4. Đặt vào nồi cách thủy ủ trong 30 phút ở 650C, thỉnh thoảng đảo cho 
dịch được trộn đều. 
5. Ly tâm 13.000 vòng/phút trong 20 phút. 
6. Lấy ra hút phần dịch nổi ở phía trên sang một eppendorf mới. Thêm 
1ml isopropanol alcohol rồi để vào tủ 40C cho kết tủa khoảng 30 phút (hoặc 
qua đêm) . 
7. Ly tâm 13000 vòng/phút trong 25 phút. 
8. Đổ hết dịch nổi ở trên rồi giữ lại tủa ở dưới đáy Eppendorf. Cho 
400l đệm TE (10: 0,1) cho vào tủ 650C C ủ trong 5 phút. Dùng pipet nhỏ 
hoặc búng nhẹ hoà tan tủa, bước này có thể giữ ở 40C qua đêm. 
9. Cho 3l Rnase (10mg/ml) vào mỗi Eppendorf. Ủ ở 370C khoảng 3 tiếng. 
10. Thêm 400l đệm CTAB, đặt vào nhiệt độ 650C trong 15 phút, thỉnh 
thoảng trộn, đảo đều. 
11. Cho và tủ hút, thêm vào 800l chloroform/isoamyl alcohol (24:1), 
lắc trộn từ 5 – 7 giây. 
12. Ly tâm ở 13500 vòng/phút trong 10 phút. Dung dịch bên trong 
Eppendorf tách thành 2 phần 
68 
13. Sử dụng pipet hút chuyển dịch nổi ở phía trên sang một eppendorf 
mới. Nếu chưa sạch có thể chiết lại lần 2 bằng chloroform/isoamyl alcohol 
(24:1). 
14. Thêm 2,5 lần thể tích ethanol 96% và giữ trong tủ lạnh sâu (- 200C) 
15. Ly tâm 13000 vòng/phút trong 30 phút, loại bỏ cồn để giữ lại tủa 
trắng ở đáy ống. 
16. Rửa tiếp bằng 400l cồn 70% rồi đưa vào máy ly tâm 13000 
vòng/phút trong 5 phút. 
17. Đổ cồn đi giữ lại tủa, cho vào máy làm khô chân không khoảng 10 
phút làm khô tủa (ADN), sau đó cho 100l TE (10: 0,1) vào mỗi eppendorf 
hoà tan tủa. 
18. Giữ ADN trong tủ lạnh sâu (-200C) để sử dụng cho các bước nghiên 
cứu tiếp theo 
Kiểm tra độ tinh sạch và xác định nồng độ ADN 
ADN đủ độ tinh sạch là AND không lẫn tạp chất, không đứt gẫy, băng 
sáng rõ khi được kiểm tra trên gel agarose với ADN nồng độ chuẩn. 
2.2.5.2. Kiểm tra ADN bằng điện di trên gel agorose 0.8% 
* Hoá chất: 0.5 x TBE được pha từ dịch gốc 10 xTBE 
Bảng 2.7. Dung dịch (10 x TBE) 
+ Dung dịch 
0,25% Bromophenol Blue 
40% Sucrose 
10xTBE V = 1000ml 
Tris base 108g 
Boric acid 55.2g 
EDTA 0,5M 40 ml 
Chỉnh pH = 8 bằng NaOH 
Thêm H2O khi trùng đủ 1 lít 
69 
H 2O cất khử trùng 
* Chuẩn bị gel agarose 0,8% 
Cân 0.8g agarose, đun sôi trong 100ml 0.5xTBE cho đến khi agorose 
tan hết. Để nguội xuống còn 500C - 600C, cho thêm 4l EtBr, lắc đều. Đổ 
dung dịch agarose vào khay gel đã cài lược sẵn, để nguội rút lược ra. 
Đặt khay gel vào bể điện di và cho 0.5xTBE ngập gel từ 2-3mm. 
Tra mẫu điện di: Lần lượt tra mẫu vào các giếng điện di. Mẫu là ADN 
trộn với dung dịch Bromophenol blue 0,25% và nước cho đủ 10l (2:2:6) 
Cường độ dòng điện và thời gian chạy điện di phụ thuộc vào mẫu điện di 
và mục đích sử dụng, thường để vạch thuốc nhuộm chạy qua giếng 2mm - 3mm 
* Kiểm tra mẫu điện di trên máy soi ADN (tia UV) 
2.2.5.3. Kỹ thuật PCR 
 Là kỹ thuật cơ bản được sử dụng trong nghiên cứu này với các chỉ thị 
SSR liên kết gen kháng rầy nâu 
Bảng 2.8. Thành phần của mỗi phản ứng PCR 
Phản ứng PCR được tiến hành trong ống Eppendorf 0,2ml và thực hiện 
trên máy Mastercycler chương trình chạy như sau: (Bảng 2.9) 
Thành phần Thể tích (l) 
dH2O 5,3 
Đệm PCR (10X) 1 
dNTP (2mM) 1 
MgCl2 5mM 0,6 
Mồi xuôi (5M) 0,5 
Mồi ngược (5M) 0,5 
Taq polymerase (5U/l) 0,1 
ADN (20ng/l) 1 
Tổng thể tích 10 
70 
Bảng 2.9. Chương trình chạy phản ứng PCR 
Các bước 
Nhiệt độ 
(0C) 
Thời gian 
(phút) 
Số chu kỳ Tác dụng 
1 94 4 1 Biến tính 
2 
94 
55-65 
72 
1 
1 
2 
35 
Biến tính 
Gắn mồi 
Tổng hợp 
3 72 7 1 Tổng hợp 
4 4 Bảo quản 
2.2.5.4. Kỹ thuật làm gel và điện di kiểm tra sản phẩm 
* Gel Agarose 
- Agarose 1% 
- TBE (Tris base, Boric acid, EDTA) 0,5x. 
- Ethidium bromide 10mg/ml (Stock solution) 
* Gel Acrylamide 4,5% 
 Chuẩn bị kính 
- Lau kỹ bề mặt hai tấm kính 3 lần bằng nước cất, sau đó lau lại 3 lần 
bằng ethanol 95%, để khô sau mỗi lần lau. 
- Lau tấm kính dài với giấy lụa tẩm Rain-X . Để 5 phút cho khô dung dịch. 
Chú ý. Tránh làm dính dung dịch này lên tấm kính ngắn. 
 - Lau tấm kính ngắn với dung dịch dính (Bind silane) được tạo thành 
bằng cách thêm 2l Bind Silane vào 1ml chứa 95% ethanol và 5% glacial 
acetic acid. 
- Để cho tấm kính khô, lau tiếp bằng ethanol 95% 1 lần. 
- Lắp ghép 2 tấm kính lại với nhau, sử dụng nẹp Sigma 0,4mm. 
Chuẩn bị gel polyacrylamide 
Chuẩn bị dung dịch 4,5% acrylamide từ dung dịch gốc 40% acrylamide 
(19:1 = acrylamide: bisacrylamide). (Bảng 2.10) 
71 
Bảng 2.10. Dung dịch gốc 40% acrylamide 
Lọc dung dịch 4,5% acrylamide qua giấy lọc. 
- Đổ 60ml dung dịch 4,5% acrylamide vào 1 cốc đong 100ml. Thêm 
300l APS10% và 60l TEMED, trộn đều. 
- Bơm dung dịch gel vào giữa hai tấm kính sao cho không có bọt khí. 
- Cài lược vào giữa hai tấm kính (răng lược hướng ra phía ngoài). Dùng 
kẹp cố định lược. 
- Để gel polyme hóa trong 1 - 2 giờ. 
Bảng 2.11. Dung dich acrylamide 4.5% 
* Điện di 
- Tháo lược và loại bỏ hết các mảnh gel thừa bám trên mặt tấm kính. 
- Lắ