Luận án Nghiên cứu chuyển gen mã hóa protein bề mặt của virus H5N1 vào cây đậu tương phục vụ sản xuất vaccine thực vật

48 giờ. 
2.2.2. Các phương pháp sử dụng trong xây dựng mô hình tái sinh và chuyển 
gen in vitro 
Các môi trường đều được chuẩn pH = 5.8 và khử trùng (Bảng 2.8). Thí 
nghiệm được tiến hành ở nhiệt độ 25 ± 20C, cường độ chiếu sáng 30-40 Em-
2s-1, thời gian chiếu sáng 16 giờ sáng/ ngày. 
58 
Bảng 2.8. Thành phần các loại môi trường tái sinh in vitro 
Loại môi trường Kí hiệu Thành phần 
Nảy mầm hạt 
(Germination 
medium) 
GM Muối B5 (3,052 g/l )+ sucrose (20 g/l) + agar (6 
g/l), pH = 5,8 
Bổ sung: vitamin B5(1 mg/l) 
Đồng nuôi cấy 
(Co-cultivation 
medium) 
CCM Muối B5 (0,316 g/l)+ MES (3,9 g/l) + sucrose 
(30g/l )+ agar (5 g/l), pH = 5,4 
Bổ sung: vitamin B5 (1 mg/l )+ AS (0,2 mM) + 
L-cysteine (400 mg/l) + Sodium thiosulfate (158 
mg/l) + DTT (154 mg/l )+ GA3(0,25 mg/l) + BAP 
Cảm ứng tạo đa 
chồi (Shoot 
induction medium) 
SIM Muối B5(3,052 g/l) + MES (0,59 g/l) + sucrose 
(30 g/l), pH = 5,6 
Bổ sung: vitamin B5 (1 mg/l )+ BAP 
Kéo dài chồi 
(Shoot elongation 
medium) 
SEM MS (4,3 g/l) + MES( 0,59 g/l )+ sucrose (30 g/l) 
+ agar (6 g/l), pH = 5,6 
Bổ sung: vitamin B5 1 mg/l + L-asparagine (50 
mg/l) + L-pyroglutamic acid (100 mg/l )+ IAA 
+ GA3 
Ra rễ 
(Rooting 
medium) 
RM MS (1,58 g/l) + MES (0,59 g/l )+ sucrose (20 
g/l) + agar (6 g/l), pH = 5,6 
Bổ sung: IBA + vitamin B5 (1 mg/l ) 
2.2.2.1. Kỹ thuật tái sinh cây thuốc lá mô hình 
Tái sinh đa chồi và chuyển gen: Sau 2-3 tuần cây con phát triển 3-4 lá 
thật thì có thể tiến hành nuôi cấy. Các mảnh lá được cắt với kích thước 
khoảng 1cm2 và đặt lên môi trường tái sinh GM (MS + sucrose 30g/l + Agar 8 
g/l + BAP1 mg/l). Các mảnh lá này cũng là đối tượng cho chuyển gen. Sau 
hai ngày trên môi trường GM, mảnh lá sẽ được ngâm với dịch huyền phù vi 
59 
khuẩn có chứa vector chuyển gen mang gen quan tâm. Sau 10 phút, các mảnh 
lá sẽ được đồng nuôi cấy với vi khuẩn trên môi trường GM (BAP 1 mg/l) 2 
ngày. Sau đó, các mảnh lá tiếp tục được chuyển lên môi trường GM (1mg/l 
BAP) để tái sinh. Sau 4-5 tuần các cụm chồi hình thành tiếp tục được cắt 
chuyển sang môi trường GM mới. 
Ra rễ: Sau 4-5 tuần các chồi phát triển cao khoảng 2-3 cm thì được cắt 
và chuyển sang môi trường ra rễ RM (MS + sucrose 30g/l + Aga 8g/l) có 
chứa kháng sinh chọn lọc và IBA (1 mg/l). 
Ra bầu và nhà lưới: Sau 3 - 4 tuần cây con ra rễ và phát triển hoàn chỉnh 
với 3-4 lá thật sẵn sàng cho ra bầu trấu: cát (1:1). Cây phát triển với 4-5 lá thật 
thì chuyển ra trồng trong bầu 40% đất, 30% trấu hun hoặc mùn mục và 30% 
phân chuồng mục được trộn đều và xử lý sạch bệnh dưới điều kiện nhà kính. 
2.2.2.2. Kỹ thuật tái sinh cây đậu tương 
Kỹ thuật tái sinh cây đậu tương qua đa chồi từ nách lá mầm hạt chín 
được tiến hành dựa trên phương pháp của Olhoft và cộng sự (2001) có cải tiến 
[82]. Các bước thực hiện diễn ra theo sơ đồ hình 2.4. Thành phần các loại môi 
trường sử dụng cho tái sinh cây qua đa chồi từ nách lá mầm hạt chín được chỉ 
ra trong bảng 2.8. 
Thí nghiệm được bố trí hoàn toàn ngẫu nhiên với 3 lần lặp lại. Các thí 
nghiệm của phần nuôi cây mô tế bào thực vật đựơc thực hiện trong phòng 
nuôi cây với điều kiện chiếu sáng theo quang chu kì 16 giờ sáng và 8giờ tối, 
nhiệt độ phòng 250C ± 2, cường độ chiếu sáng 2000lux. 
60 
Hình 2.2. Sơ đồ thí nghiệm tái sinh và chuyển gen vào cây đậu tương 
Tạo nguyên liệu và cảm ứng tạo đa chồi 
Hạt đậu tương được loại bỏ các hạt kém chất lượng và tiến hành khử 
trùng bằng khí clo trong bình kín có tủ hốt. Sau khi khử trùng, cho hạt nảy 
mầm trên môi trường GM, sau 4-5 ngày cắt lấy phần lá mầm, tách đôi hai lá 
mầm, loại đỉnh sinh trưởng. Phần lá mầm còn lại được đặt lên môi trường 
cảm ứng tạo đa chồi (SIM). Theo dõi tỷ lệ mẫu tạo cụm chồi, số chồi trung 
Hạt đậu tương 
Khử trùng bề mặt 
Nảy mầm 
A. tumefaciens/gen 
Nuôi lỏng khuẩn 
Tạo huyền phù 
khuẩn 
Gây tổn thương, lây nhiễm 
Cảm ứng tạo đa chồi 
Kéo dài chồi 
Ra rễ 
Ra cây 
61 
bình /cụm sau thời gian cảm ứng là 4 tuần để đánh giá khả năng tạo đa chồi 
của giống đậu tương cũng như mức độ phù hợp của môi trường. 
Kéo dài chồi và tạo cây hoàn chỉnh 
Các cụm chồi được tạo ra từ quá trình nuôi cấy trên môi trường SIM 
được chuyển sang môi trường kéo dài chồi SEM. Đánh giá khả năng kéo dài 
của chồi sau 2 tuần dựa trên việc theo dõi và thống kê số chồi kéo dài/cụm 
nuôi cấy cũng như chất lượng chồi. 
Khi các chồi đạt chiều cao từ 4-5 cm, chọn những chồi khỏe chuyển sang 
môi trường ra rễ RM. Khi cây in vitro có 3 lá, có bộ rễ đảm bảo (thường sau 2 
tuần nuôi cấy) sẽ thực hiện việc ra cây. Cây được lấy ra khỏi bình nuôi cấy 
một cách nhẹ nhàng, rửa sạch phần agar bám quanh gốc và rễ, sau đó cây 
được đặt trên giá thể ra cây. Cây sống sót trên giá thể được đưa ra trồng trên 
chậu đất có bổ sung phân bón và trồng trong điều kiện nhà lưới. 
Chuyển gen vào nách lá mầm hạt chín 
Phương pháp chuyển gen thông qua nách lá mầm được tiến hành dựa 
trên nghiên cứu của Olhoft và cộng sự (2001) có cải tiến [82]. Sơ đồ thí 
nghiệm chuyển gen được mô tả tổng quát trong hình 2.4. 
Hạt đậu tương chín sau khi được khử trùng, nảy mầm, tách và thu phần 
lá mầm (tương tự như tạo nguyên liệu nuôi cấy in vitro trong quy trình tái 
sinh cây) sẽ được gây tổn thương bằng mũi dao nhọn từ 7-8 lần vào phần 
nách lá mầm. Lá mầm đã bị tổn thương được nhiễm khuẩn Agrobacterium 
chứa gen quan tâm. 
Mẫu được ngâm trong dịch huyền phù vi khuẩn có OD600 đạt 0,6-1 trong 
thời gian 30 phút. Sau thời gian nhiễm khuẩn, mẫu được chuyển sang môi 
trường đồng nuôi cấy CCM đặc. Quá trình đồng nuôi cấy diễn ra trong tối, ở 
250C trong thời gian là 5 ngày. 
62 
Sau thời gian đồng nuôi cấy, mẫu biến nạp được lắc trong môi trường 
cảm ứng tạo chồi (SIM) có bổ sung cefotaxim 500 mg/l với thời gian là 10 
phút, sau đó thấm khô bằng giấy thấm khử trùng. Cắt bỏ chồi chính trên các 
mảnh lá mầm và cấy mẫu lên môi trường tạo cụm chồi có bổ sung cefotaxim 
500 mg/l. Sau thời gian 2 tuần, mẫu được chuyển sang môi trường SIM đặc 
có bổ sung cefotaxim 500 mg/l và kháng sinh thích hợp. 
Sau 2 tuần, các cụm chồi sống được trên môi trường chọn lọc sẽ được 
chuyển sang môi trường phát triển chồi (SEM) có bổ sung cefotaxim 500 mg/l 
và kháng sinh thích hợp. Khi các chồi phát triển đạt kích thước từ 3-5 cm sẽ 
được chuyển sang môi trường ra rễ (RM) có bổ sung cefotaxim 250 mg/l để 
tạo cây hoàn chỉnh. 
Kiểm tra sự có mặt của gen chuyển 
Với gen gus, được kiểm tra bằng phương pháp nhuộm của Jefferson 
(1987) [54]: Các mảnh lá được nhuộm với dung dịch 5-bromo-4-chloro-3-
indolyl glucoronide (X-gluc) 8-10 giờ trong tối ở nhiệt độ 370C, sau đó rửa 
bằng cồn 70% và quan sát dưới kính hiển vi. Những vùng có gen gus nhuộm 
màu xanh lam. 
Với gen HA được kiểm tra bằng PCR. 
2.2.3. Phương pháp phân tích cây chuyển gen 
2.2.3.1. Kỹ thuật PCR 
DNA hệ gen của các dòng cây được tách nhanh bằng phương pháp của 
Edwards et al.(1991)[46]. Mẫu lá khoảng 100mg được nghiền trong nitơ lỏng, 
sau đó được bổ sung 400 µl đệm tách và trộn đều trong 1 phút. Dịch này sẽ 
được ly tâm tốc độ cao trong 5 phút. Phần dịch lỏng được chuyển vào 300 µl 
isopropanol, sau đó li tâm và hòa tan DNA trong 100 µl H2O. Phản ứng PCR 
được tiến hành với thành phần được trình bày trong bảng 2. 1 và chu kỳ nhiệt 
63 
trong bảng 2.2. Trong đó, nhiệt độ gắn mồi được xác định dựa trên nhiệt độ 
bắt mồi của cặp mồi đã được thiết kế. 
2.2.3.2. Tách chiết protein từ hạt 
Hạt đậu tương được nghiền trong đệm 50 mM Tris-HCl (pH 7.6) có bổ 
sung NaCl (150 mM), EDTA (5 mM), SDS 0.1% và -mercaptoethanol 
(0.1%). Sau đó ly tâm 10000 vòng/phút trong 10 phút. Thu phần dịch và phân 
tích Western blot. Phần còn lại được tinh chế bằng kit ProFound™ c-Myc Tag 
IP/Co-IP Kit (Pierce, Mỹ). 
2.2.3.3. Phân tích Western blot 
Protein tổng số được chạy trên gel 12.5% SDS polyacrylamide theo 
phương pháp của Laemmli (1970) [60], sau đó được chuyển lên màng 
nitrocellulose HybondTM (Amersham). Màng lai đã được rửa bằng TBS và 
block với 3% BSA trong 1 giờ. Sau đó màng được rửa tiếp và ủ với kháng thể 
c-myc trong TBS bổ sung 0.5% BSA và 0.05% Tween 20. Sau thời gian 1 
giờ, màng được rửa và ủ với kháng thể 2 có gắn ALP hoặc kháng thể IgG của 
chuột cộng hợp với horseradish peroxidase HRP (Abcam). Sau khi rửa lần 
cuối màng được ủ trong NBT/BCIP để phát hiện protein tái tổ hợp. 
2.3. ĐỊA ĐIỂM NGHIÊN CỨU VÀ HOÀN THÀNH LUẬN ÁN 
 Các thí nghiệm được thực hiện tại Phòng Công nghệ tế bào thực vật, 
Trại thực nghiệm sinh học, Phòng thí nghiệm trọng điểm công nghệ gen, Viện 
Công nghệ sinh học. 
 Công trình được hoàn thành tại Bộ môn Di truyền & Sinh học hiện đại, Khoa 
Sinh - Kỹ thuật Nông nghiệp, Trường Đại học Sư phạm - Đại học Thái Nguyên. 
64 
Chương 3 
KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN 
3.1. THIẾT KẾ VECTOR CHUYỂN GEN MANG GEN HA VÀ ĐOẠN 
GEN HA1 CỦA VIRUS H5N1 
3.1.1. Kết quả thiết kế vector chuyển gen mang gen HA 
 Các tế bào miễn dịch không phản ứng hoặc không nhận diện toàn bộ phân 
tử kháng nguyên mà chúng chỉ nhận diện những vị trí nhất định trên phân tử 
kháng nguyên. Những vị trí đó được gọi là epitope hoặc vị trí quyết định 
kháng nguyên. Dựa trên công bố của một số công trình nghiên cứu về epitope 
trên protein HA của virus cúm A/H5N1, các trình tự của epitope B và T được 
xác định như sau: 
Epitope B: 
 Ser-Lys-Ala-Phe-Ser-Asn-Cys-Tyr-Pro-Tyr-Asp-Val-Pro-Asp-Tyr-Ala-
Ser-Leu 
Epitope T: 
Pro-Lys-Tyr-Val-Lys-Gln-Asn-Thr-Leu -Lys-Leu-Ala-Thr 
Các epitope B và T nằm ở các vị trí tương ứng là 91-108 và 307-319. 
Trình tự HA của virus cúm A/H5N1 (AJ867074) cho thấy ở các vị trí này 
trình tự amino acid có độ tương đồng cao với các epitope trên. 
Vector biểu hiện trong thực vật bao gồm một cấu trúc SLHEP chứa 
signal peptide (2S2), các epitope B và T của HA, một trình tự có khả năng 
gây miễn dịch niêm mạc ruột (LTB), trình tự nhận biết protein trong nội chất 
(KDEL) và các vị trí nhận biết điểm cắt của enzyme (Hình 3.1). 
65 
Hình 3.1. Trình tự SLHEP (A) và cấu trúc của đoạn gen SLHEP (B) 
3.1.1.1. Tổng hợp gen HA chứa mã bộ ba biểu hiện cao trong thực vật 
Sự biểu hiện protein tái tổ hợp là hướng đi cơ bản của công nghệ sinh 
học hiện đại. Tuy nhiên các protein rất khó biểu hiện ở cơ thể khác loài. Một 
số mã bộ ba rất dễ biểu hiện cao trong loài này nhưng không biểu hiện hay 
biểu hiện thấp trong loài khác. Mục tiêu của nghiên cứu này là biểu hiện gen 
HA của virus H5N1 ở cơ thể thực vật, do vậy cần thiết phải thay đổi một số 
mã bộ ba nhằm làm tăng mức độ biểu hiện gen HA trong tế bào chủ. 
Trên cơ sở trình tự gen HA và protein HA của virus H5N1 chúng tôi đã 
thiết kế nhân tạo gen HA (HAop) có khả năng biểu hiện tối ưu ở thực vật và 
gửi tổng hợp tại công ty Geneart (Germany) sau đó được sử dụng để ghép nối 
vào vector p201-SLHEP. Gen nhân tạo HAop gồm 1695 nucleotide và có sự 
thay đổi một số mã bộ ba nucleotide, nhưng trình tự amino acid không thay 
đổi (Hình 3.2). 
ANKLFLVCAALALCFLLTNALDAPQSITELCSEYRNTQIYTINDKILSYTESMAGKREMV
IITFKSGATFQVEVPGSQHIDSQKKAIERMKDTLRITYLTETKIDKLCVWNNKTPNSIAA
ISMENSDPHVPNLDLEEFEWSYIVEKANPVNDLCYPGGGECPKYVKSNRLVLATGLRNSK
DEQKLISEEDLNGSKDEL. 
(A) 
(B) 
66 
ATGGAGAAAATAGTGCTTCTTCTTGCAATAGTCAGTCTTGTTAAAAGTGATCAGATTTGCATTGGTTACCATGCAAACAA 
 M E K I V L L L A I V S L V K S D Q I C I G Y H A N N 
ATGGAAAAGATTGTGCTTTTGCTTGCTATTGTGTCTCTTGTGAAGTCTGATCAGATCTGCATTGGATACCACGCTAACAA 
CTCGACAGAGCAGGTTGACACAATAATGGAAAAGAACGTTACTGTTACACATGCCCAAGACATACTGGAAAAGACACACA 
 S T E Q V D T I M E K N V T V T H A Q D I L E K T H 
CTCTACTGAGCAAGTGGATACAATTATGGAAAAGAACGTGACTGTTACTCACGCTCAGGATATTCTTGAAAAGACTCACA 
ACGGGAAGCTCTGCGCTCTAGATGGAGTGAAGCCTCTAATTTTGAGAGATTGTAGTGTAGCTGGATGGCTCCTCGGAAAC 
N G K L C A L D G V K P L I L R D C S V A G W L L G N 
ACGGAAAGTTGTGCGCTCTTGATGGTGTTAAGCCACTTATTCTTAGGGATTGCTCTGTTGCTGGATGGCTTCTTGGAAAC 
CCAATGTGTGACGAATTCATCAATGTGCCGGAATGGTCTTACATAGTGGAGAAGGCCAATCCAGTCAATGACCTCTGTTA 
 P M C D E F I N V P E W S Y I V E K A N P V N D L C Y 
CCAATGTGTGATGAGTTCATTAACGTGCCAGAGTGGTCTTATATTGTGGAGAAGGCTAACCCAGTGAACGATCTTTGCTA 
CCCAGGGGATTTCAATGACTATGAAGAATTGAAACACCTATTGAGCAGAATAAACCATTTTGAGAAAATTCAGATCATCC 
 P G D F N D Y E E L K H L L S R I N H F E K I Q I I 
CCCTGGTGATTTCAACGATTACGAAGAGCTTAAGCACCTTCTTTCTAGGATTAACCACTTCGAGAAGATTCAGATTATTC 
CCAAAAGTTCTTGGTCCAGTCATGAAGCCTCATTAGGGGTGAGCTCAGCATGTCCATACCAGGGAAAGTCCTCCTTTTTC 
P K S S W S S H E A S L G V S S A C P Y Q G K S S F F 
CAAAGTCATCTTGGTCATCTCACGAGGCTTCTCTTGGAGTTTCTTCTGCTTGCCCATACCAGGGAAAGTCATCTTTCTTC 
AGAAATGTGGTATGGCTTATCAAAAAGAACAGTACATACCCAACAATAAAGAGGAGCTACAATAATACCAACCAAGAAGA 
 R N V V W L I K K N S T Y P T I K R S Y N N T N Q E D 
AGGAACGTTGTTTGGCTTATTAAGAAGAACTCTACTTACCCAACTATTAAGAGGTCTTACAACAACACTAACCAGGAAGA 
TCTTTTGGTACTGTGGGGGATTCACCATCCTAATGATGCGGCAGAGCAGATAAAGCTCTATCAAAACCCAACCACCTATA 
 L L V L W G I H H P N D A A E Q I K L Y Q N P T T Y 
TCTTTTGGTTCTTTGGGGAATTCACCACCCAAATGATGCTGCTGAACAGATTAAGTTGTACCAGAACCCAACTACTTACA 
TTTCCGTTGGGACATCAACACTAAACCAGAGATTGGTACCAAGAATAGCTACTAGATCCAAAGTAAACGGGCAAAGTGGA 
I S V G T S T L N Q R L V P R I A T R S K V N G Q S G 
TTTCTGTGGGAACTTCTACTCTTAACCAGAGGCTTGTGCCAAGAATTGCTACTAGGTCTAAGGTGAACGGACAATCTGGA 
AGGATGGAGTTCTTCTGGACAATTTTAAAACCGAATGATGCAATCAACTTCGAGAGTAATGGAAATTTCATTGCTCCGGA 
 R M E F F W T I L K P N D A I N F E S N G N F I A P E 
AGGATGGAATTCTTCTGGACTATTCTTAAGCCAAACGATGCTATTAACTTCGAGTCTAACGGAAACTTCATTGCTCCAGA 
ATATGCATACAAACTTGTCAAGAAAGGGGACTCAACAATTATGAAAAGTGAATTGGAATATGGCAACTGCAACACCAAGT 
Y A Y K L V K K G D S T I M K S E L E Y G N C N T K Q 
GTACGCTTACAAGTTGGTGAAGAAGGGTGATAGTACTATTATGAAGTCTGAGCTTGAGTACGGAAACTGCAACACTAAGT 
GTCAAACTCCAATGGGGGCGATAAACTCTAGTATGCCATTCCACAATATACACCCTCTCACCATCGGGGAATGCCCCAAA 
T P M G A I N S S M P F H N I H P L T I G E C P K 
GCCAAACTCCAATGGGAGCTATTAACTCTTCTATGCCATTCCACAACATTCACCCACTTACTATTGGAGAGTGCCCAAA 
TATGTGAAATCAAACAGATTAGTCCTTGCGACTGGGCTCAGAAATAGCCCTCAACGAGAGACGCGAGGATTATTTGGAGC 
 Y V K S N R L V L A T G L R N S P Q R E R R G L F G A 
TACGTGAAGTCTAACAGGCTTGTGCTTGCTACTGGACTTAGGAACTCTCCACAGAGAGAAAGAAGGGGACTTTTCGGAGC 
TATAGCAGGTTTTATAGAGGGAGGATGGCAGGGAATGGTAGATGGTTGGTATGGGTACCACCATAGCAACGAGCAGGGGA 
 I A G F I E G G W Q G M V D G W Y G Y H H S N E Q G 
TATTGCTGGATTCATTGAGGGAGGATGGCAGGGAATGGTTGATGGATGGTACGGATACCATCACTCTAACGAGCAAGGAT 
GTGGGTACGCTGCAGACAAAGAATCCACTCAAAAGGCAATAGATGGAGTCACCAATAAGGTCAACTCGATTATTGACAAA 
S G Y A A D K E S T Q K A I D G V T N K V N S I I D K 
CTGGATATGCTGCTGATAAGGAATCTACTCAGAAAGCTATTGATGGTGTTACTAACAAGGTGAACTCTATTATTGATAAG 
ATGAACACTCAGTTTGAGGCCGTTGGAAGGGAATTTAACAACTTAGAAAGGAGAATAGAGAATTTAAACAAGAAGATGGA 
 M N T Q F E A V G R E F N N L E R R I E N L N K K M E 
ATGAACACTCAGTTCGAAGCTGTTGGAAGAGAGTTCAACAACCTTGAGAGAAGGATTGAGAACCTTAACAAGAAAATGGA 
67 
AGACGGGTTCCTAGATGTCTGGACTTATAATGCTGAACTTCTAGTTCTCATGGAAAACGAGAGAACTCTAGACTTTCATG 
D G F L D V W T Y N A E L L V L M E N E R T L D F H 
AGATGGATTCCTTGATGTGTGGACTTACAACGCTGAGTTGCTTGTGCTTATGGAAAACGAGAGGACTCTTGATTTCCACG 
ACTCAAATGTCAAGAACCTTTACGACAAGGTCCGACTACAGCTTAGGGATAATGCAAAGGAGCTGGGTAACGGTTGTTTC 
D S N V K N L Y D K V R L Q L R D N A K E L G N G C F 
ATTCTAACGTGAAGAACCTTTACGATAAAGTGAGGCTTCAGCTTAGGGATAACGCTAAAGAGCTTGGAAACGGTTGCTTC 
GAGTTCTATCATAAATGTGATAATGAATGTATGGAAAGTGTAAGAAACGGAACGTATGACTACCCGCAGTATTCAGAAGA 
 E F Y H K C D N E C M E S V R S G T Y D Y P Q Y S E E 
GAGTTCTACCACAAGTGCGATAACGAGTGCATGGAATCTGTGAGATCTGGAACTTACGATTACCCACAGTACTCTGAAGA 
AGCAAGACTAAAAAGAGAGGAAATAAGTGGAGTAAAATTGGAATCAATAGGAATTTACCAAATATTGTCAATTTATTCTA 
 A R L K R E E I S G V K L E S I G I Y Q I L S I Y S 
AGCTAGGCTTAAGAGGGAAGAGATTTCTGGTGTTAAGTTGGAGTCTATTGGTATTTACCAGATTCTTTCTATTTACTCTA 
CAGTGGCGAGCTCCCTAGCACTGGCAATCATGGTAGCTGGTCTATCCTTATGGATGTGCTCCAATGGGTCGTTACAATGC 
T V A S S L A L A I M V A G L S L W M C S N G S L Q C 
CTGTGGCTTCTTCTCTTGCTCTTGCTATTATGGTGGCTGGACTTTCTCTTTGGATGTGCTCTAACGGATCTCTTCAGTGC 
AGAATTTGCATTTAA 
 R I C I . 
AGGATCTGCATTTAA 
Hình 3.2. Trình tự gen HA đã được thay đổi mã bộ ba (HAop) 
Trình tự trên: trình tự gen HA của chủng virus A/Hatay/2004/(H5N1) AJ867074); 
trình tự ở giữa: trình tự amino acid; trình tự dưới: trình tự nucleotid đã được thay đổi 
3.1.1.2. Thiết kế vector tái tổ hợp mang cấu trúc gen HAop 
Kết quả khuếch đại gen HA 
Dựa trên trình tự gen HAop, cặp mồi đặc hiệu XhoI-HA/HindIII-HA đã 
được thiết kế (Bảng 3.1), trong đó các nucleotid in nghiêng đậm là trình tự 
nhận biết của enzym cắt hạn chế XhoI và HindIII, các nucleotid in thường là 
trình tự tương đồng với gen HAop 
Bảng 3.1. Trình tự cặp mồi XhoI-HA/HindIII-HA 
Tên mồi Trình tự 
XhoI-HA CCGCTCGAGATCTGCATTGGATACCACGCT 
HindIII-HA CCCAAGCTTGCAGATCCTGCACTGAAGAGAT 
68 
Hiệu quả của phản ứng PCR có thể giảm do những nguyên nhân như 
nồng độ muối quá cao, hay quá thấp, nhiệt độ bắt cặp mồi không thích hợp, 
lượng plasmid quá nhiều...Vì vậy trong quá trình thực hiện phản ứng chúng 
tôi đã tiến hành điều chỉnh nhiệt độ bắt cặp mồi, lượng mẫu, nồng độ mồi để 
đảm bảo phản ứng xảy ra đặc hiệu nhất. Sản phẩm PCR được điện di kiểm tra 
trên gel agarose 0,8% cùng với thang DNA chuẩn 1kb (Hình 3.3) cho thấy kết 
quả nhận được một đoạn DNA có kích thước khoảng 1,7 kb phù hợp với kích 
thước gen HA theo tính toán lý thuyết. 
Hình 3.3. Hình ảnh điện di kiểm tra kết quả PCR nhân đoạn gen HAop 
bằng XhoI-HA/HindIII-HA (M: Thang DNA chuẩn 1kb) 
Tinh sạch sản phẩm PCR 
Để ghép nối sản phẩm PCR- đoạn gen HAop vào vector tách dòng có 
hiệu quả thì sản phẩm PCR phải được làm sạch loại bỏ các thành phần có tạp 
chất trong sản phẩm PCR như mồi, đệm, enzym. Khi dung dịch qua cột tinh 
-1kb 
 1 M 
 -6 kb 
-3 kb 
1,7 kb 
69 
M 
sạch DNA sẽ được gắn vào phân tử có ái lực cao với chúng cố định trên màng 
lọc của cột. Dịch đệm cùng agarose được loại bỏ nhờ ly tâm tốc độ cao, sau 
đó DNA được thu lại bằng nước khử ion. Sản phẩm tinh sạch được kiểm tra 
trên gel agarose 0,8% (Hình 3.4). 
 M HA 
Hình 3.4. Hình ảnh điện di kiểm tra sản phẩm thôi gel 
 (M: thang DNA 1kb) 
Kết quả ở Hình 3.4 cho thấy sản phẩm PCR đã được tinh sạch có hàm 
lượng cao không bị đứt gãy, đúng với kích thước, đảm bảo cho việc tiến hành 
các phản ứng tiếp theo. 
Ghép nối đoạn gen HA vào vector p201-SLHEP 
Sản phẩm PCR tinh sạch được xử lý đồng thời bởi hai enzyme 
XhoI/HindIII và được nối vào vector p201-SLHEP. Trên vector có 2 vị trí tái 
tổ hợp attL1 và attL2, đoạn gen cần chuyển sẽ được xen vào giữa 2 vị trí này. 
Trên vector còn chứa gen kháng kháng sinh kanamycin và vị trí gắn mồi, 
phục vụ cho việc chọn các dòng khuẩn lạc mang plasmid mong muốn. Nhờ 
enzyme nối mà các đầu của sản phẩm PCR sẽ được ghép vào vector, kết quả 
plasmid tái tổ hợp p201-SLHEP-HA được tạo thành. Sơ đồ của thí nghiệm 
  1,7 kb 
1kb - 
70 
ghép nối đoạn gen HA vào vector p201-SLHEP được thể hiện ở hình 3.5. Hỗn 
hợp phản ứng được ủ ở 250C trong 90 phút để phản ứng xảy ra hoàn toàn. 
Hình 3.5 Sơ đồ thí nghiệm ghép nối gen HA/HA1 vào vector p201-SLEHP 
tạo p201-SLEHP-HA/HA1 
Biến nạp plasmid tái tổ hợp vào tế bào khả biến E. coli DH5α 
Plasmid tái tổ hợp được tạo ra từ phản ứng ligation sẽ được biến nạp 
vào tế bào khả biến E. coli DH5α bằng phương pháp sốc nhiệt để chọn lọc, 
nhân nhanh plasmid với số lượng lớn. Kết quả của quá trình biến nạp được thể 
hiện ở hình 3.6. 
71 
Hình 3.6. Hình ảnh khuẩn lạc sau khi biến nạp plasmid tái tổ hợp vào 
E.coli 
Hình 3.6 cho thấy kết quả thu được các khuẩn lạc mọc được trên môi 
trường chọn lọc. Từ đây có thể kết luận sơ bộ rằng đã biến nạp thành công 
plasmid tái tổ hợp p201- SLHEP-HA vào tế bào E. coli. Tuy nhiên, các khuẩn 
lạc thu được có thể mang vector tái tổ hợp hoàn chỉnh hoặc chỉ là khuẩn lạc 
mang các plasmid thường, không chứa gen đích hay gen đích bị đứt gãy cần 
phải tiến hành chọn lọc. Để có thể chọn lọc được những dòng khuẩn lạc mang 
vector chứa gen HA còn nguyên vẹn như mong muốn, chúng tôi tiến hành 
nuôi và tách plasmid từ những khuẩn lạc và kiểm tra bằng phản ứng cắt với 
enzyme giới hạn.