Luận án Nghiên cứu đặc điểm dịch tễ học phân tử của virus gây bệnh thiếu máu truyền nhiễm ở gà (chicken infectious anemia virus - Ciav) lưu hành tại miền Bắc Việt Nam

m đối chứng, nhưng sự khác biệt này không 
có ý nghĩa thống kê (p > 0,05). Dựa vào kết quả PCR, sau gây nhiễm 3 tuần bắt 
đầu phát hiện gà dương tính với CIAV, tỷ khối huyết cầu từ thời điểm này ở 
nhóm thí nghiệm bắt đầu giảm nhiều so với nhóm đối chứng. Từ tuần 5 sau gây 
nhiễm trở đi, kết quả kiểm định về sự khác biệt tỷ khối huyết cầu giữa 2 nhóm gà 
cho giá trị p < 0,05, chứng tỏ kết quả bắt đầu sai khác và có ý nghĩa thống kê. 
Trong đó, thấy rõ nhóm gà nhiễm CIAV có tỷ khối huyết cầu thấp hơn rõ rệt so 
với nhóm gà đối chứng (các vị trí đánh dấu *, hình 4.10). 
Về thời điểm, các kết quả gây bệnh thực nghiệm cho biết biểu hiện thiếu 
máu (đánh giá qua chỉ tiêu bệnh lý vi thể hoặc tỷ khối huyết cầu) bắt đầu xuất 
hiện trong tuần thứ nhất sau gây nhiễm, tiến triển nặng dần và nặng nhất sau khi 
nhiễm virus 2- 3 tuần (Yuasa & cs., 1979). Nghiên cứu (Toro & cs., 1997) cũng 
 53 
thu được kết quả tương tự khi gây nhiễm chủng CIAV 10343 cho gà 1 ngày tuổi: giá 
trị hematocrit bắt đầu giảm ở tuần thứ 1 và giảm thấp xuống thấp nhất ở tuần thứ 3 
sau khi nhiễm ở nhóm gà thí nghiệm, khác biệt đáng kể so với nhóm đối chứng. 
Trong một số trường hợp, sự thay đổi chỉ số huyết học có thể xảy ra sớm, khoảng 8 
ngày sau gây nhiễm virus (Mcnulty, 1991). Đối chiếu thời điểm bắt đầu xuất hiện 
hiện tượng virus huyết ở nhóm gà gây nhiễm (bảng 4.3) với thời điểm tỷ khối huyết 
cầu có sự khác biệt giữa nhóm thí nghiệm và đối chứng (hình 4.10) có thể thấy độ 
trễ là 2 tuần. Ở khía cạnh này, kết quả trên phù hợp với các mô tả trước đây. 
4.1.4.5. Bệnh tích đại thể ở gà được gây nhiễm CIAV 
Tại thời điểm hiện tượng thiếu máu là khác biệt rõ rệt nhất giữa nhóm thí 
nghiệm và đối chứng (ngày 56 sau nhiễm virus, hình 4.10), toàn bộ gà của 2 
nhóm được mổ khám để nghiên cứu biến đổi bệnh tích đại thể. Bệnh tích đại thể 
được trình bày ở hình 4.11 và hình 4.12 là cơ quan tạo máu, mô lympho tập trung 
và vị trí có biến đổi bệnh lý. 
Hình 4.11. Bệnh tích đại thể ở tuyến ức và tủy xương 
Hình 4.11 cho biết các thùy của tuyến ức ở nhóm gà đối chứng có kích 
thước tương đối đồng đều (hình 4.11E, 4.11F), trong khi đó kích thước của các 
thùy này của nhóm thí nghiệm có sự teo một phần (hình 4.11B) hoặc teo gần như 
hoàn toàn (hình 4.11A). Tủy xương ở nhóm thí nghiệm nhạt màu (hình 4.11D) 
hoặc có màu vàng rõ (hình 4.11C). Ngược lại, tủy xương của nhóm gà đối chứng 
 54 
luôn có màu đỏ nâu (hình 4.11G, 4.11H). Như vậy, gà được gây nhiễm bởi chủng 
CIAV thực địa trong nghiên cứu này có biến đổi bệnh tích điển hình của bệnh 
thiếu máu truyền nhiễm, giống như mô tả của nhiều nghiên cứu trên thế giới 
(Yuasa & cs., 1979; Yuasa & cs., 1980). 
Hình 4.12. Bệnh tích đại thể ở túi Fabricius và gan 
Trong trạng thái sinh lý bình thường, tuyến ức và túi Fabricius teo nhỏ/ 
thoái hóa khi gà > 13 tuần tuổi (Tarek & cs., 2012). Hiện tượng teo túi Fabricius 
ở gà < 13 tuần tuổi có thể quan sát rõ ràng hơn khi so sánh kích thước với lách. 
Một số nghiên cứu trước đây (Mcnulty, 1991; Smyth & cs., 1993; Dhama & cs., 
2002) đã khẳng định tổn thương do CIAV gây ra không chỉ làm cạn kiệt các yếu 
tố bạch huyết không những ở tuyến ức mà còn ở túi Fabricius, các hạch manh 
tràng cùng với các tổn thương ở mô sinh sản. Ở nhóm gà nhiễm CIAV, ngoài 
tuyến ức, túi Fabricius cũng là cơ quan có biến đổi rõ với hiện tượng teo nhỏ, kết 
quả được trình bày ở hình 4.12A - 4.12F. Hình 4.12A - 4.12C cho thấy kích 
 55 
thước túi Fabricius của nhóm gà đối chứng luôn lớn gấp 3 lần so với kích thước 
lách. Ngược lại, ở nhóm gà nhiễm CIAV, kích thước tương đối túi Fabricius so 
với kích thước của lách chỉ gấp khoảng 1,5 lần (hình 4.12D, 4.12E), thậm chí là 
nhỏ hơn (hình 4.12F). Kết quả trên cho thấy túi Fabricius ở nhóm gà thí nghiệm 
đã teo nhỏ. Hiện tượng thoái hóa/ teo nhỏ của tuyến ức và túi Fabricius ở gà 
nhiễm CIAV có thể được giải thích là do virus có thể nhân lên ở nhiều loại tế bào 
của gà mẫn cảm, trong đó có các tế bào tiền lympho T (Adair, 2000). Ngoài các 
cơ quan kể trên, khi đối chiếu màu gan giữa nhóm thí nghiệm và nhóm đối 
chứng, có thể thấy rõ màu gan vàng hơn ở nhóm thí nghiệm (hình 4.12J - 4.12L) 
so với nhóm đối chứng (hình 4.12G - 4.12I). Kết quả này phản ánh tình trạng 
thiếu máu, dẫn tới nhạt màu của một số cơ quan nội tạng, nhất là gan. Trong quá 
trình mổ khám, ngoài những cơ quan kể trên, hầu hết các hệ cơ quan khác của gà 
nhiễm CIAV đều không có biến đổi bệnh tích đại thể rõ so với nhóm đối chứng. 
Biến đổi bệnh tích chính ở gà sau một thời gian gây nhiễm thực nghiệm được 
tổng hợp và trình bày ở bảng 4.4. 
Bảng 4.4. Bệnh tích đại thể ở nhóm gà nhiễm CIAV 
Biến đổi bệnh tích 
Số gà 
mổ khám (con) 
Số gà 
có bệnh tích (con) 
Tỷ lệ 
(%) 
Tủy xương nhạt màu 9 7 77,8 
Tuyến ức teo 9 3 33,3 
Tuyến ức xuất huyết 9 8 88,9 
Gan có ánh vàng 9 7 77,8 
Túi Fabricius teo 9 5 55,6 
Túi Fabricius xuất huyết 9 0 0,0 
Xuất huyết cơ 9 0 0,0 
Kết quả tổng hợp (bảng 4.4) cho thấy nhóm gà thí nghiệm xuất hiện bệnh 
tích điển hình của bệnh thiếu máu truyền nhiễm là hiện tượng tủy xương nhạt 
màu với tỷ lệ 77,8%, tiếp sau là teo túi Fabricius (55,6%) và teo tuyến ức 
(33,3%). Ngoài ra, các bệnh tích khác như gan nhạt màu và xuất huyết điểm ở 
tuyến ức cũng gặp với tỷ lệ cao, lần lượt là 77,8% và 88,9%. Cho đến nay, đã có 
nhiều công trình nghiên cứu về biến đổi bệnh tích đại thể của gà mắc bệnh thiếu 
máu truyền nhiễm ở ngoài tự nhiên (Buscaglia & cs., 1994; Toro & cs., 1997; 
Ledesma & cs., 2001; Rimondi & cs., 2014) cũng như trong điều kiện thí nghiệm 
(Goodwin & cs., 1989; Bougiouklis & cs., 2007; Hegazy & cs., 2014; Simeonov 
 56 
& cs., 2014; Hussein & cs., 2016), điểm chung của các nghiên cứu này là: ngoại 
trừ một số bệnh tích ít gặp như xuất huyết dưới da, xuất huyết cơ, biến đổi ở 
tuyến ức và tủy xương là phổ biến nhất. Dựa vào đặc điểm trên, kết quả nghiên 
cứu về biến đổi bệnh tích đại thể của nhóm gà nhiễm CIAV trong nghiên cứu này 
là phù hợp. Tuy nhiên, nghiên cứu này không phát hiện được bệnh tích xuất 
huyết ở một số cơ quan như dạ dày tuyến và cơ đùi, cơ lườn đã được mô tả khi 
gây bệnh thực nghiệm cho gà SPF 1 ngày tuổi (Yuasa & cs., 1979). Sự khác biệt 
về loại tổn thương cũng như mức độ nghiêm trọng của tổn thương đã được chứng 
minh phụ thuộc vào độc lực của chủng virus (Spackman & cs., 2002a). Cũng cần 
chú ý, bệnh tích teo túi Fabricius hoặc teo tuyến ức có thể do nhiễm virus gây 
bệnh Gumboro hoặc virus Marek’s thể tăng độc lực (vvIBDV, vv+ MDV) 
(Calnek & cs., 1998; Stoute & cs., 2009). Do đó, chẩn đoán lâm sàng bệnh thiếu 
máu truyền nhiễm cần (i) phân biệt với các bệnh kể trên và (ii) dựa vào đặc điểm 
về lứa tuổi và bệnh tích ở tủy xương. 
Từ các kết quả đạt được, nghiên cứu hoàn toàn có cơ sở khẳng định sự có 
mặt của bệnh thiếu máu truyền nhiễm cũng như sự lưu hành của các chủng CIAV 
tại miền Bắc Việt Nam là các chủng có độc lực. Bên cạnh đó, các biểu hiện lâm 
sàng trong điều kiện gây nhiễm thực nghiệm cùng các quan sát thực tế đã góp 
phần không nhỏ trong việc phát hiện bệnh, là cơ sở để thực hiện các nghiên cứu 
chuyên sâu về CIAV tại Việt Nam. Trên cơ sở các kết quả đã đạt được, nghiên 
cứu tiến hành làm rõ một số đặc điểm dịch tễ học phân tử của các chủng CIAV 
lưu hành tại miền Bắc Việt Nam thông qua các bước: giải trình tự, phân tích gen 
và xây dựng cây phát sinh loài của các chủng CIAV thực địa kết hợp so sánh và 
phân tích với các trình tự đã có trong GenBank. Kết quả thu được sẽ góp phần 
hoàn thiện bức tranh về sự lưu hành của các chủng CIAV tại miền Bắc Việt Nam. 
4.2. ĐẶC ĐIỂM DỊCH TỄ HỌC PHÂN TỬ CỦA CIAV TẠI MIỀN BẮC 
4.2.1. Đặc điểm di truyền bộ gen của CIAV lưu hành ở miền Bắc 
4.2.1.1. Cấu trúc bộ gen của CIAV 
Để tìm hiểu đặc điểm cấu trúc bộ gen của CIAV lưu hành tại miền Bắc, bộ 
gen của 3 chủng virus đã được giải mã thành công (MH536104 - MH536106) và 
đều có kích thước 2298 nucleotide. Kích thước bộ gen của CIAV thu được trong 
nghiên cứu này tương đương với đa số các chủng CIAV trên thế giới (161/ 176 
chủng công bố trên GenBank dài 2298 nucleotide). Kết quả phân tích cấu trúc bộ 
gen 3 chủng CIAV ở miền Bắc được lần lượt trình bày ở các phần dưới đây. 
 57 
Ghi chú:  ÷  trình tự nucleotide lặp (direct repeat); ATF: trình tự bám yếu tố khởi động phiên mã; 
CCAAT: trình tự tăng cường tính bám của yếu tố khởi đầu phiên mã; Sp1: trình tự giàu GC bám protein 
Sp1; TFIID: trình tự bám yếu tố khởi động phiên mã II D. 
Hình 4.13. Cấu trúc vùng khởi đầu phiên mã của CIAV ở miền Bắc 
 58 
Hình 4.13 trình bày cấu trúc đầu 5’ không mã hóa protein của CIAV. So 
với 2 chủng tham chiếu, 3/3 chủng CIAV của Việt Nam đều có 4 vùng trình tự 
lặp lại (ký hiệu 1, 2, 4, 5, hình 4.13) và giống với chủng virus có độc lực (Cux-1, 
mã số M81223). Vùng 5’ này còn chứa các trình tự bám cho yếu tố khởi động 
quá trình phiên mã, ví dụ như ATF, CCAAT, Sp1 và TFIID (hình 4.13). Như 
vậy, 3 chủng virus ở miền Bắc mang cấu trúc gen đặc trưng ở vùng 5’ của CIAV 
(Noteborn & cs., 1991). So sánh với chủng CIAV clone 10 (U66304) đã được 
chứng minh có độc lực thấp (Meehan & cs., 1997), 3/3 chủng CIAV trong nghiên 
cứu này và chủng Cux-1 độc lực cao đều không có đột biến thêm 21 nucleotide 
(đánh dấu màu xám, hình 4.13) nằm giữa trình tự lặp số 2 và số 4. 
Cho đến nay, cấu trúc vùng mã hóa protein trong bộ gen của CIAV đã 
được làm rõ (Noteborn & cs., 1992a). Dựa vào chủng CIAV tham chiếu 
(M81223), đã xác định cấu trúc vùng gen mã hóa protein của 3/3 chủng CIAV 
trong nghiên cứu này (hình 4.14). 
Ghi chú: giá trị (%) biểu thị mức tương đồng nucleotide giữa các gen của 3 chủng CIAV ở miền Bắc với 
chủng virus tham chiếu M81223. Chiều của mũi tên biểu thị hướng của quá trình dịch mã. 
Hình 4.14. Cấu trúc vùng mã hóa protein của CIAV ở miền Bắc 
Có thể thấy vùng mã hóa protein của 3 chủng CIAV gồm 3 gen cùng 
chiều, lồng nhau, theo thứ tự ORF2 - ORF3 - ORF1 (hình 4.14). Về mức tương 
đồng, gen ORF2 tương đồng 100%, gen ORF3 tương đồng 98,3% - 99,2% và 
gen ORF1 tương đồng từ 98,9% -99,1% so với chủng CIAV tham chiếu. Từ hai 
kết quả phân tích (hình 4.13 và hình 4.14) cho thấy: 3 chủng virus ở miền Bắc 
mang đầy đủ các cấu trúc bộ gen điển hình của CIAV. 
 59 
4.2.1.2. Mức tương đồng trình tự nucleotide của bộ gen virus 
Mức tương đồng trình tự bộ gen của 3 chủng CIAV ở miền Bắc đã được 
so sánh với 176 chủng CIAV trên thế giới. Kết quả được trình bày ở hình 4.15. 
Hình 4.15. Tương đồng trình tự nucleotide bộ gen giữa các chủng CIAV 
Dựa vào sự phân bố về màu sắc (tương quan với mức tương đồng trình tự 
nucleotide của bộ gen), có thể thấy rõ 179 chủng CIAV được chia thành 2 nhóm 
lớn: nhóm có mức tương đồng từ 94% - 96% và nhóm có mức tương đồng từ 
97% - 100%. Kết quả trên cũng phù hợp với các công bố trước đây trên thế giới. 
Tại Ấn Độ, nghiên cứu (Gowthaman & cs., 2014) đã chỉ ra mức tương đồng rất 
cao (98%- 100%) giữa 16 chủng phân lập tại nước này; mức tương đồng (98,5% 
- 99,7%) với các chủng của Mỹ và Australia và (98,8% - 100%) là mức tương 
đồng gen khi so sánh chúng với các chủng của Brazil, Malaysia và Bangladesh. 
Nghiên cứu tiếp tục so sánh mức tương đồng dọc theo chiều dài bộ gen hoàn 
chỉnh giữa 3 chủng CIAV của miền Bắc với các chủng virus thuộc 3 genogroup 
 60 
(G1, G2 và G3) công bố trên GenBank. Kết quả thể hiện ở hình 4.16. 
Ghi chú: 3 bộ gen CIAV lần lượt được so sánh với chủng virus tham chiếu thuộc genogroup 1 (A), 2 (B) 
và 3 (C). Dấu * và ★ đánh dấu các vùng có mức tương đồng < 95% (đường nét đứt). 
Hình 4.16. Biến động về mức tương đồng dọc chiều dài bộ gen của CIAV 
Khi xem xét toàn bộ genome của 3 chủng CIAV của Việt Nam kết hợp so 
sánh với các chủng virus thuộc 3 genogroup của CIAV trên thế giới, kết quả cho 
thấy: vùng gen có mức tương đồng cao (> 95%) của 3 chủng CIAV của Việt 
Nam rộng hơn khi so sánh với các chủng thuộc nhóm di truyền G2, G3 (hình 
4.15B, 4.15C); ngược lại vùng gen có mức tương đồng thấp (< 95%) giữa 3 
chủng của Việt Nam chiếm diện tích rộng hơn khi so sánh với các chủng thuộc 
nhóm di truyền G1. Các nhận xét trên đã góp phần khẳng định gen mã hóa 
protein VP1 có nhiều biến đổi nhất so với 2 gen còn lại. 
4.2.2. Đặc điểm di truyền của gen mã hóa capsid protein 
4.2.2.1. Biến đổi di truyền ở cấp độ nucleotide 
Đối với CIAV, sự biến đổi về trình tự nucleotide thường dao động trong 
phạm vi 5% và tập trung ở vùng gen mã hóa cho protein VP1 (Ducatez & cs., 
 61 
2006; Eltahir & cs., 2011; Zhang & cs., 2013). Từ đó, nghiên cứu tiếp tục phân 
tích đặc điểm di truyền của gen mã hóa capsid protein (hình 4.17 - hình 4.18). 
10 20 30 40 50 60 70 80 90 100 110 120 130 140 150
....|....|....|....|. ...|....|....|....|....|.. ..|....|....|....|....|.... |....|....|....|....|....| ....|....|....|....|....|. ...|....|....|....|....|
Vx_P4_AJ890284 ATGGCAAGACGAGCTCGCAGACCGAGAGGCCGGTTTTACGCCTTCAGAAGAGGACGGTGGCACCACCTCAAGCGACTTCGACGAAGATATAAATTTCGACATCGGAGGAGACAGCGGTATCGTAGACGAGCTTTTAGGAAGGCCTTTCAC
Vx_3711_EF683159 ................................A.....................................................................................................................
Cux1_M55918 ................................A......T..............................................................................................................
Vn_VP10_KP780292 ................................A................................G....................................................................................
Vn_VP9_KP780291 ................................A.....................................................................................................................
Vn_VP8_KP780290 ................................A.....................................................................................................................
Vn_VP7_KP780289 ................................A................................G....................................................................................
Vn_HN1_KP780288 ................................A.....................................................................................................................
Vn_BN1_KP780287 ................................A.....................................................................................................................
C1_2016 ................................A..............................A......................................................................................
C5_2016 ................................A.....................................................................................................................
C8_2016 ................................A..............................A......................................................................................
C10_2016 ................................A..............................A......................................................................................
C13_2017 ................................A.....................................................................................................................
C12_2017 ................................A.....................................................................................................................
C16_2017 ................................A.....................................................................................................................
160 170 180 190 200 210 220 230 240 250 260 270 280 290 300
....|....|....|....|. ...|....|....|....|....|.. ..|....|....|....|....|.... |....|....|....|....|....| ....|....|....|....|....|. ...|....|....|....|....|
Vx_P4_AJ890284 AACCCCCGCCCCGGTACGTATAGTGTGAGGCTGCCGAACCCCCAATCTACTATGACTATCCGATTCCAAGGAGTCATCTTTCTCACGGAAGGACTCATTCTGCCTAAAAACAGCACAGCGGGGGACTATGCAGACCACATGTACGGGGCG
Vx_3711_EF683159 ...................................A........G..C..G...........C.......................C..............A.................T....G......G..................
Cux1_M55918 ..............................................................C........G....................................................G.........................
Vn_VP10_KP780292 ................................A...........G..A..G...........C..T......A....T.....T..C.....................................G.............C...........
Vn_VP9_KP780291 ..............................................................C....................................T........................G.........................
Vn_VP8_KP780290 ..............................................................C....................................T........................G.........................
Vn_VP7_KP780289 ................................A...........G..A..G...........C..T......A....T.....T..C.....................................G.............C...........
Vn_HN1_KP780288 ..............................................................C....................................T........................G.........................
Vn_BN1_KP780287 ..............................................................C....................................T........................G.........................
C1_2016 ..............................................................C........CA...................................................G.............T...........
C5_2016 ..............................................................C....................................T........................G.........................
C8_2016 ..............................................................C........CA...........................................C.......G.............T...........
C10_2016 ..............................................................C........CA...........................................C.......G.............T...........
C13_2017 .............................A................................C.............................................................G.........................
C12_2017 .............................A................................C....................................T........................G.........................
C16_2017 ..............................................................C....................................T........................G.........................
310 320 330 340 350 360 370 380 390 400 410 420 430 440 450
....|....|....|....|. ...|....|....|....|....|.. ..|....|....|....|....|.... |....|....|....|....|....| ....|....|....|....|....|. ...|....|....|....|....|
Vx_P4_AJ890284 AGAGTCGCCAAGATCTCTGTAAACCTGAAAGAGTTCCTGCTAGCGTCAATGAACCTGACATACGTGAGCAAAATCGGAGGACCCATCGCCGGTGAGTTGATTGCGGACGGGTCTAAATCACAAGCCGCGGAGAATTGGCCTAATTGCTGG
Vx_3711_EF683159 .................A..G.................C.....A..........................G..A.....C......................................G..............C.....A.........
Cux1_M55918 ....................G.......................C...................................C..................................................C..................
Vn_VP10_KP780292 .................A..G.................C...................................A.....C.................................C..........A...C................T...
Vn_VP9_KP780291 ....................G........G..........................C...............C.......C.....................................................C........C......
Vn_VP8_KP780290 ....................G........G..........................C...............C.......C.....................................................C........C......
Vn_VP7_KP780289 .................A..G.................C...................................A.....C.................................C..........A...C................T...
Vn_HN1_KP780288 ....................G........G..........................C...............C.......C.....................................................C........C......
Vn_BN1_KP780287 ....................G........G..........................C...