Luận án Nghiên cứu đặc điểm và chuyển gen GmDREB2 nhằm cải thiện tính chịu hạn của cây đậu tương (Glycine max (L.) Merrill)

 55 
Tạo rễ: Khi các chồi phát triển đạt kích thước từ 3 - 4cm sẽ được chuyển sang 
môi trường tạo rễ (RM) có bổ sung cefotaxim 400mg/l và kanamycin 50mg/l để 
tạo cây hoàn chỉnh. 
Cây ra giá thể: Những cây hoàn chỉnh, khoẻ mạnh được đưa ra bầu trấu hun : cát 
(tỷ lệ 1 : 1). Sau khoảng 1 - 2 tuần, các cây sống sót được trồng ra nhà lưới. Tính 
toán thời gian biến nạp và tái sinh để thời điểm ra cây trùng với thời vụ gieo 
trồng đậu tương. 
2.3.4. Nhóm các phương pháp phân tích cây chuyển gen 
2.3.4.1. Kiểm tra sự có mặt của gen chuyển bằng kỹ thuật PCR 
Tách chiết DNA tổng số từ lá cây chuyển gen và thực hiện phản ứng PCR 
với cặp mồi đặc hiệu GmDREB2-BamHI/Cmyc-SacI để xác định sự có mặt của 
gen GmDREB2. Kiểm tra kết quả bằng điện di trên gel agarose 1,0%. 
2.3.4.2. Phân tích cây chuyển gen bằng lai DNA (Southern blot) 
 Tổng hợp DNA mẫu dò GmDREB2 được tiến hành theo hướng dẫn của bộ 
kit "Biotin DecaLabel DNA Labeling Kit" [202]. Khuôn DNA là gen GmDREB2 
trong vector tái tổ hợp pBT-GmDREB2. Phản ứng tạo mẫu dò là PCR một chu 
kỳ, thành phần gồm: Enzyme là đoạn Klenow Fragment, exo-; dNTP (1,0mM 
dGTp, 1,0mMdATP, 0,65mM dCTP, 0,35mM Biotin-110dUTP); mồi random 
primer. Sản phẩm tạo ra các phân đoạn DNA có kích thước khác nhau tương 
đồng với cả hai mạch DNA, mỗi phân đoạn đều có Biotin-11-dUTP ở các vị trí 
ngẫu nhiên. Klenow Fragment là đại phân tử protein được tạo ra khi cắt DNA 
polymerase I từ E.coli bằng protease subtilisin Klenow Fragment. Klenow 
Fragment, exo- là dạng đột biến của Klenow Fragment, mất khả năng 3’ 5’ 
exonuclease, nhưng lại có khả năng tổng hợp 5 3’ và tổng hợp ngay cả khi 
DNA ở dạng sợi kép. 
 Phản ứng tổng hợp DNA dò gồm hai bước: (1) Hỗn hợp chứa dung dịch 
 56 
đệm và DNA khuôn được biến tính ở 95oC, sau đó hạ nhiệt độ đột ngột xuống 
0oC, mồi random primer gắn ngẫu nhiên lên mạch DNA khuôn; (2) Bổ sung 
thêm Klenow Fragment, exo- và dNTP, ủ ở 37oC, phản ứng kéo dài trình tự 
nucleotide được thực hiện. Từ 1g DNA ban đầu có thể tạo thành từ vài g đến 
vài chục g DNA dò. 
 Phản ứng lai Southern blot bao gồm các bước: (1) Tách chiết DNA tổng 
số từ cây đậu tương chuyển gen, thu 30 - 50g DNA tinh sạch và xử lý bằng 
enzyme giới hạn SacI; (2) Điện di sản phẩm cắt bởi enzyme giới hạn trên gel 
agarose 1% và chuyển sang màng lai; (3) Bổ sung DNA dò GmDREB2 đã được 
đánh dấu trong đệm chứa 50% formamid, ở nhiệt độ 42oC; (4) Rửa màng lai ở 
nhiệt độ 65oC trong đệm 0,1X SSC; (5) Hiện kết quả lai trên màng. Quy trình 
hiện màng được thực hiện theo kit Biotin Chromogenic Detection Kit (Thermo 
Scientific). 
2.3.4.3. Phân tích cây chuyển gen bằng Western blot 
Kiểm tra hoạt động của gen chuyển qua sự có mặt của protein DREB2 
bằng Western blot với các bước cơ bản sau: (1) Tách chiết protein tổng số 
(nghiền 0,5g lá trong nitơ lỏng và hoà tan trong 1ml PBS + Tween 0,05%, ly tâm 
13000rpm, 15 phút); (2) Điện di biến tính protein trên gel polyacrylamide - SDS 
10%; (3) Chuyển protein trên gel điện di lên màng lai nitrocellulose bằng máy 
Pierce G2 Fast Blotter (25V, 1,3mA trong 20 phút); (4) Màng chứa kháng 
nguyên cmyc được phủ bằng 5% sữa tách béo pha trong dung dịch PBS + Tween 
0,05% trong 16 giờ; (5) Lai kháng thể 1 (ngâm màng trong 15 ml dung dịch PBS 
5% sữa tách béo có chứa kháng thể cmyc với độ pha loãng 700 lần, lắc trong 3 
giờ ở nhiệt độ phòng); (6) Lai kháng thể 2 (ngâm màng trong 15ml dung dịch 
PBS + 5% sữa tách béo có chứa kháng thể anti-mouse IgG có gắn HRP (Horse 
Radish Peroxidase) trong 2 giờ); (7) Hiện màu trong dung dịch có chứa cơ chất 
 57 
TMB (3,3’,5,5’-tetramethyl benzidine) hoặc DAB (3,3'-diaminobenzidine 
tetrahydrochloride), hiển thị kết quả dưới ánh sáng thường. 
2.3.4.4. Xác định hàm lượng prolin trong cây chuyển gen 
Hàm lượng prolin trong cây chuyển gen được xác định bằng phương pháp 
Bates và cs (1973) [15]. 
Gây hạn nhân tạo các dòng thuốc lá chuyển gen và các cây đối chứng 
không chuyển gen. Nghiền 0,5g lá khô đã xử lý hạn ở ngưỡng sau hạn 5 ngày và 
9 ngày trong cối chày xứ, thêm 10ml dung dịch axit sunfosalisilic 3%, li tâm 
8000 vòng/phút trong 30 phút, thu dịch. Đo hấp thụ quang phổ ở bước sóng 
520nm. Hàm lượng prolin của mỗi dòng cây thuốc lá được tính bằng đơn vị μmol/g 
khối lượng khô. 
2.3.5. Các phương pháp phân tích, xử lý số liệu 
Hiệu suất chuyển gen ở cây đậu tương ở mỗi giai đoạn phân tích được xác 
định bằng công thức: 
 Số dòng cây mang gen chuyển/ 
 hoặc số dòng cây biểu hiện protein tái tổ hợp 
Hiệu suất chuyển gen (%) = 
Tổng số mẫu biến nạp 
Kết quả nghiên cứu về phân tích trình tự gen được xử lý bằng phần mềm 
Blast trong NCBI, BioEdit và DNA Star. 
Các số liệu phân tích hàm lượng prolin xử lý bằng phần mềm Microsoft 
Excel để xác định các đại lượng thống kê như: Giá trị trung bình, phương sai, 
độ lệch chuẩn, sai số trung bình mẫu với mức ý nghĩa α = 0,001 [6]. 
 58 
Chương 3. KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU 
3.1. ĐẶC ĐIỂM CỦA GEN GmDREB2 PHÂN LẬP TỪ CÂY ĐẬU TƯƠNG 
3.1.1. Tách dòng và xác định trình tự của gen GmDREB2 từ một số giống 
đậu tương 
Thiết kế cặp mồi đặc hiệu để nhân bản gen GmDREB2 
Dựa trên trình tự gen DREB2 của đậu tương đã công bố tại Ngân hàng Gen 
mang mã số DQ054363, cặp mồi đặc hiệu GmDREB2-NcoI/GmDREB2-NotI có 
trình tự nucleotide được thiết kế cho phản ứng PCR để nhân bản gen GmDREB2 
từ 6 giống đậu tương nghiên cứu (Bảng 2.1). Cặp mồi được thiết kế bao gồm cả 
trình tự chứa điểm cắt của enzyme giới hạn để phục vụ cho việc thiết kế vector 
sau này. Ở vị trí trước bộ ba mở đầu có bổ sung 9 nucleotide trên mồi xuôi 
GmDREB2-NcoI chứa điểm cắt của enzyme NcoI và 11 nucleotide trên mồi 
ngược GmDREB2-NcoI chứa điểm cắt của enzyme NotI ngay sau bộ ba kết thúc. 
Trình tự gen GmDREB2 đã được công bố bởi Wang và cs (2006) có kích thước 
480 bp, mã hóa 159 amino acid, miền AP2 có 59 amino acid, từ vị trí amino acid 
34 đến 92 [180]. 
Như vậy, đoạn gen GmDREB2 được khuếch đại từ cDNA bằng cặp mồi 
GmDREB2-NcoI/GmDREB2-NotI thì kết quả sẽ cho sản phẩm PCR với kích 
thước là 500 bp. 
Kết quả nhân bản gen GmDREB2 
Hạt của 6 giống đậu tương (DT2008, CB, CBD, ĐT26, ĐVN5, ĐT51) 
được ngâm ủ, nảy mầm, khi được 6 ngày tuổi tiến hành thu mẫu mô vùng sinh 
trưởng của lá để phục vụ thí nghiệm tách chiết RNA. Tách chiết RNA tổng số và 
tổng hợp cDNA, gen GmDREB2 được nhân bản bằng kỹ thuật PCR với cặp mồi 
GmDREB2-NcoI/GmDREB2-NotI và sản phẩm PCR được kiểm tra bằng điện di 
trên gel agarose 0,8% (Hình 3.1A). 
 59 
M 1 2 3 4 5 6

2,0 kb 
0,5 kb 
A 
1 2 3 4 M 5 6 
1,0 kb 
0,5 kb 
 0,66 kb
B 
Hình 3.1. A: Kết quả điện di kiểm tra sản phẩm PCR khuếch đại cDNA của gen 
GmDREB2 từ 6 giống đậu tương; B: Kết quả điện di kiểm tra sản phẩm 
colony-PCR với cặp mồi pUC18-F/pUC18-R từ 6 dòng khuẩn lạc. 
(M: Thang DNA chuẩn 1 kb; 1-DT2008; 2-CB; 3-CBD; 4-ĐT26; 5-ĐVN5; 
6-ĐT51). 
Kết quả chọn dòng khuẩn lạc chứa vector tái tổ hợp dựa trên kiểu hình và 
bằng phản ứng colony-PCR với cặp mồi pUC18-F/pUC18-R cho thấy xuất hiện 
băng DNA có kích thước khoảng 0,66 kb từ 6 dòng khuẩn lạc (Hình 3.1B), 
plasmid tái tổ hợp đã được tách và đem giải trình tự nucleotide. Kết quả xác định 
trình tự nucleotide được thể hiện ở hình 3.2. Kết quả ở hình 3.2 cho thấy, đoạn 
mã hóa gen GmDREB2 có 480 nucleotide, mã hóa cho 159 amino acid. Bằng 
chương trình phân tích BLAST trong NCBI cho kết quả về độ tương đồng từ 
94,6% - 99,6% so với trình tự gen GmDREB2 mang mã số DQ054363 trên Ngân 
hàng Gen. Như vậy, kết quả phân tích trên đã khẳng định đoạn gen phân lập từ 
mRNA của 6 giống đậu tương là gen GmDREB2. Trình tự gen của 6 giống đậu 
tương (DT2008, ĐT51, ĐT26, CB, ĐVN5, CBD) đã được đăng ký trên Ngân 
hàng Gen với mã số theo thứ tự như sau: LK936507, LK936508, LK936509, 
HG965097, HG965098, HG965099. 
 60 
 61 
Hình 3.2. Trình tự đoạn mã hóa của gen GmDREB2 phân lập từ các giống đậu 
tương: DT2008, CB, CBD, ĐT26, ĐVN5, ĐT51 so với trình tự gen GmDREB2 
mang mã số DQ054363 trên Ngân hàng Gen. 
Tuy nhiên, giữa các trình tự nucleotide gen GmDREB2 của các giống đậu 
tương trên khác nhau ở một số vị trí nucleotide (Bảng 3.1). Kết quả ở bảng 3.1 
cho thấy, giữa các trình tự nucleotide có 36 vị trí nulceotide sai khác. So với 
DQ054363, trình tự gen GmDREB2 của giống DT2008 sai khác ở 17 vị trí 
nucleotide, giống CB sai khác ở 9 vị trí nucleotide, giống CBD sai khác ở 9 vị trí 
nucleotide, giống ĐT26 sai khác ở 3 vị trí nucleotide, giống ĐVN5 sai khác ở 15 
vị trí nucleotide và giống ĐT51 sai khác ở 12 vị trí nucleotide. 
 62 
Bảng 3.1. Các vị trí sai khác trong trình tự nucleotide của gen GmDREB2 giữa 
các giống đậu tương 
TT Vị trí nucleotide DQ054363 DT2008 CB CBD ĐT26 ĐVN5 ĐT51 
1 8 A A T T A A A 
2 9 A C A A A A A 
3 12 G G G G G G T 
4 33 C C C C C T C 
5 36 T G T T T T T 
6 40 A T A A A A A 
7 41 C C C C C G C 
8 45 T G T T T T T 
9 57 A G A A A A A 
10 63 G T G G G G G 
11 69 A A A A A G A 
12 78 G A G G G G G 
13 96 G G G G G C G 
14 159 T T C C C C C 
15 163 C C A A A A A 
16 165 T T G G G G G 
17 178 C C T T T T T 
18 202 A G G G G G G 
19 219 T T C C C C C 
20 234 C C C C C C A 
21 261 C C T T T T T 
22 268 C C G G C C C 
23 318 G C G G G G G 
24 340 A A A A A C A 
25 348 G C G G G G G 
26 355 G G G G G G A 
27 405 G C G G G G G 
28 406 A T A A A A A 
29 415 A G A A A A A 
30 416 T C T T T T T 
31 419 G A G G G G G 
32 437 A C A A A A A 
33 441 G C G G G G G 
34 458 A A A A A G A 
35 459 G G G G G A G 
36 473 A A A A A A G 
 63 
Kết quả so sánh trình tự amino acid suy diễn từ gen GmDREB2 của 6 
giống đậu tương nghiên cứu với nhau và với trình tự amino acid của protein 
DREB2 mang mã số DQ054363 trên Ngân hàng Gen được thể hiện ở hình 3.3. 
Hình 3.3. Trình tự amino acid suy diễn của gen GmDREB2 phân lập từ 6 giống 
đậu tương (DT2008, CB, CBD, ĐT26, ĐVN5, ĐT51) và gen DREB2 mang mã số 
DQ054363 trên Ngân hàng Gen. 
Hình 3.3 cho thấy, trình tự amino acid suy diễn từ gen GmDREB2 của các 
giống đậu tương có sự tương đồng từ 91,2% - 99,4%. Tuy nhiên, giữa các trình 
tự amino acid có 17 vị trí amino acid sai khác. So với DQ054363, giống DT2008 
có số vị trí amino acid sai khác là nhiều nhất (10 vị trí amino acid), giống CB và 
CBD sai khác ở 3 vị trí amino acid, giống ĐT26 sai khác ở 1 vị trí amino acid, 
 64 
giống ĐVN5 sai khác ở 5 vị trí amino acid và giống ĐT51 sai khác ở 4 vị trí 
amino acid (Bảng 3.2). 
Bảng 3.2. Các vị trí sai khác trong trình tự amino acid suy diễn từ gen 
GmDREB2 giữa các giống đậu tương 
TT Vị trí DQ054363 DT2008 CB CBD ĐT26 ĐVN5 ĐT51 
1 3 E D V V E E E 
2 14 T S T T T R T 
3 21 E D E E E E E 
4 32 K K K K K N K 
5 68 T A A A A A A 
6 78 F F F F F F L 
7 90 P P A A P P P 
8 106 K N K K K K K 
9 114 K K K K K Q K 
10 119 V V V V V V I 
11 136 T S T T T T T 
12 139 I A I I I I I 
13 140 S N S S S S S 
14 146 I S I I I I I 
15 147 E D E E E E E 
16 153 E E E E E G E 
17 158 E E E E E E G 
Thuộc tính chủ yếu của DREB là miền bảo thủ AP2 liên kết với các 
nhân tố phản ứng với các stress. Phân tích trình tự amino acid ở miền AP2 của 
DREB2 ở 6 giống đậu tương Việt Nam và giống mang mã số DQ054363 đã 
cho thấy, miền AP2 gồm 59 amino acid, từ vị trí amino acid thứ 34 đến 92 
(Hình 3.4, Bảng 3.3). 
 65 
Hình 3.4. Trình tự amino acid suy diễn của miền AP2 trong protein DREB2 
Bảng 3.3. Các vị trí amino acid sai khác ở miền AP2 của protein DREB2 giữa 
các giống đậu tương nghiên cứu 
TT Vị trí amino acid DQ054363 DT2008 CB CBD ĐT26 ĐT51 ĐVN5 
1 68 T A A A A A A 
2 78 F F F F F L F 
3 90 P P A A P P P 
Kết quả so sánh cho thấy, miền AP2 của protein DREB2 gồm 59 amino 
acid, từ vị trí thứ 34 đến 92 với độ tương đồng rất cao. Trong 6 giống đậu tương 
nghiên cứu, protein DREB2 của 3 giống có miền AP2 với độ tương đồng đạt 
100% (DT2008, ĐT26 và ĐVN5), các giống còn lại đều đạt 98,3%. Các giống 
đậu tương nghiên cứu chỉ sai khác với giống có mã số DQ054363 từ 1 đến 2 vị 
trí amino acid. Kết quả ở hình 3.3 còn cho thấy, các điểm liên kết của nhân tố 
phiên mã DREB2 với DNA (DNA binding site) ở 11 amino acid, đó là các vị trí: 
35, 36, 38, 40, 42, 44, 48, 50, 57, 59, 62. Tuy nhiên, chưa tìm thấy sự khác biệt 
nào trong trình tự amino acid của miền AP2 giữa các giống đậu tương nghiên 
cứu và giống có trình tự gen GmDREB2 mang mã số DQ054363 trên Ngân hàng 
Gen. Từ kết quả so sánh trên có thể khẳng định: Miền AP2 của protein DREB2 
có tính bảo thủ cao và những thay đổi về thành phần amino acid tại miền này có 
thể làm thay đổi lớn đặc tính của protein. 
 66 
Mối quan hệ giữa 6 giống đậu tương dựa trên trình tự nucleotide, trình tự 
amino acid suy diễn của gen GmDREB2 và trình tự gen GmDREB2 mang mã số 
DQ054363 được thể hiện ở hình 3.5. 
%
A 
%
B 
Hình 3.5. Sơ đồ hình cây mô tả mối quan hệ giữa các giống đậu tương dựa trên 
trình tự nucleotide (A) và trình tự amino acid suy diễn (B) của gen GmDREB2 
Dựa trên phân tích trình tự nucleotide gen GmDREB2 của các giống 
đậu tương ở hình 3.5A cho thấy, giống DT2008 phân bố riêng ở một nhánh 
chính và các giống còn lại phân bố trong nhánh chính thứ hai. Khoảng cách di 
truyền giữa hai nhánh là 2,5%. Dựa trên trình tự amino acid suy diễn từ gen 
GmDREB2, 7 giống đậu tương được phân bố trong hai nhánh và giống DT2008 
ở một nhánh chính. Khoảng cách di truyền giữa giống DT2008 và các giống còn 
lại là 4,0% (Hình 3.5B). 
3.1.2. Sự đa dạng của gen GmDREB2 phân lập từ cây đậu tương 
 Tiến hành phân tích so sánh trình tự nucleotide và trình tự amino acid suy 
diễn của gen GmDREB2 phân lập từ một số giống đậu tương Việt Nam với các 
trình tự công bố trên Ngân hàng Gen (Bảng 3.4) để xác định hệ số tương đồng và 
hệ số phân ly (Bảng 3.5), thiết lập sơ đồ hình cây về mối quan hệ di truyền giữa 
các giống đậu tương (Hình 3.6). 
 67 
Bảng 3.4. Các trình tự gen GmDREB2 phân lập từ các giống đậu tương Việt Nam 
và các trình tự gen mang mã số trên Ngân hàng Gen được sử dụng phân tích 
STT Mã số trên Ngân hàng Gen Năm công bố Quốc gia Tác giả 
1 LK936507 2014 Việt Nam Dao,T.X và cs 
2 LK936508 2014 Việt Nam Dao,T.X và cs 
3 LK936509 2014 Việt Nam Dao,T.X và cs 
4 HG965097 2014 Việt Nam Dao,T.X và cs 
5 HG965098 2014 Việt Nam Dao,T.X và cs 
6 HG965099 2014 Việt Nam Dao,T.X và cs 
7 HG965100 2014 Việt Nam Hoang TX và cs 
8 HG965101 2014 Việt Nam Hoang TX và cs 
9 DQ054363 2006 Trung Quốc Wang N và cs 
10 FJ965341 2009 Mỹ Charlson và Purcell 
11 JF946766 2011 Indonesia Arumingtyas và cs 
12 JF946767 2011 Indonesia Arumingtyas và cs 
13 JF946768 2011 Indonesia Arumingtyas và cs 
14 JF946769 2011 Indonesia Arumingtyas và cs 
15 JF946770 2011 Indonesia Arumingtyas và cs 
16 JF946771 2011 Indonesia Arumingtyas và cs 
 Bảng 3.4 cho thấy, trong 16 trình tự gen GmDREB2 sử dụng phân tích có 8 
trình tự gen phân lập từ các giống đậu tương Việt Nam, 1 trình tự ở Trung Quốc, 
1 trình tự ở Mỹ và 6 trình tự ở Indonesia. Kết quả phân tích hệ số tương đồng và 
hệ số phân ly dựa trên trình tự nucleotide của gen GmDREB2 ở bảng 3.5 cho 
thấy, hệ số tương đồng dao động từ 94% - 99,8%, còn hệ số phân ly dao động từ 
0,2% - 6,3%. 
 68 
Bảng 3.5. Hệ số tương đồng và hệ số phân ly của các giống đậu tương dựa trên 
trình tự nucleotide của gen GmDREB2 
Mối quan hệ di truyền giữa các giống đậu tương dựa trên trình tự nucleotide 
của gen GmDREB2 được thể hiện ở sơ đồ hình 3.6. Trên sơ đồ hình 3.6 cho thấy, 
16 giống đậu tương phân bố ở hai nhánh chính: Nhánh thứ nhất có 4 giống, trong 
đó có DT2008, nhánh chính thứ hai là 12 giống còn lại. Khoảng cách di truyền 
giữa hai nhánh là 3,1%. 
% 
Hình 3.6. Sơ đồ hình cây mô tả mối quan hệ của 16 giống đậu tương dựa trên 
trình tự nucleotide của gen GmDREB2. 
 69 
 Tiếp tục phân tích tính đa dạng di truyền dựa trên trình tự amino acid suy 
diễn của gen GmDREB2, kết quả được thể hiện ở bảng 3.6 và hình 3.7. 
Bảng 3.6. Hệ số tương đồng và hệ số phân ly của các giống đậu tương dựa trên 
trình tự amino acid suy diễn của gen GmDREB2 
Bảng 3.6 cho thấy, hệ số tương đồng giữa các giống đậu tương từ 
91,2% - 100%; hệ số phân ly từ 0% - 9,3%. Mối quan hệ di truyền giữa các 
giống đậu tương dựa trên trình tự amino acid suy diễn của gen GmDREB2 được 
thể hiện ở sơ đồ hình 3.7. 
Trên hình 3.7, 16 giống đậu tương phân bố trong 3 nhóm thuộc hai 
nhánh chính. Nhánh chính thứ nhất chỉ có giống BS, 15 giống còn lại thuộc 
nhánh chính thứ hai với khoảng cách di truyền là 2,8%. 
 70 
Kết quả phân tích dựa trên trình tự nucleotide và dựa trên trình tự amino 
acid suy diễn của gen GmDREB2 ở cả hai sơ đồ hình 3.6 và hình 3.7 cho thấy, có 
đặc điểm chung là giống đậu tương chịu hạn DT2008 có quan hệ gần với các 
giống đậu tương ở Indonesia. 
%
Hình 3.7. Sơ đồ hình cây mô tả mối quan hệ của 16 giống đậu tương dựa trên 
trình tự amino acid suy diễn của gen GmDREB2. 
3.2. THIẾT KẾ VECTOR CHUYỂN GEN THỰC VẬT MANG GEN GmDREB2 
3.2.1. Đặc điểm của vector chuyển gen mang cấu trúc chứa gen GmDREB2 
3.2.1.1. Thiết kế cấu trúc 35S-GmDREB2-cmyc 
Đoạn gen GmDREB2 (cDNA) phân lập từ mRNA của giống đậu tương 
DT2008 chịu hạn tốt đã được tạo dòng trong vector pBT. Cắt vector pBT-GmDREB2 
và vector trung gian pRTRA7/3 bằng cùng cặp enzyme giới hạn NcoI và NotI 
thu được kết quả trên hình 3.8. 
 71 
Hình 3.8. Kết quả kiểm tra sản phẩm cắt vector pBT-GmDREB2 và vector 
pRTRA7/3 bằng cặp enzyme NcoI và NotI. 
M: Thang DNA chuẩn 1kb; giếng 1: pBT-GmDREB2 đã cắt; giếng 2: pBT-
GmDREB2 chưa cắt; giếng 3: pRTRA7/3 đã cắt; giếng 4: pRTRA7/3 chưa cắt. 
 Trên hình 3.8, tại giếng 2 có thể thấy vector pBT-GmDREB2 có kích thước 
khoảng trên 3 kb, sản phẩm sau khi cắt bởi cặp enzyme NcoI và NotI thu được 2 
phân đoạn ở vị trí khoảng 500 bp và 2,7 kb tương ứng với kích thước lý thuyết 
của gen GmDREB2 và vector pBT. Vector trung gian pRTRA7/3 sau khi được 
cắt bằng cặp enzyme giới hạn có 2 phân đoạn khoảng 3,3 kb và 900 bp. Trong đó, 
phân đoạn 3,3 kb chính là vector pRTRA đã được cắt mở vòng và phân đoạn 
900 bp là đoạn gen đã được cắt văng ra. Các phân đoạn gen GmDREB2 và 
pRTRA7/3 mở vòng được thôi gel và tinh sạch, sau đó chúng được ghép nối 
bằng enzyme T4 ligase và được biến nạp vào E.coli DH5α để tạo dòng trong 
vi khuẩn E.coli DH5α. Vì trên vector pRTRA7/3 đã có sẵn promoter 35S và 
đuôi cmyc nên sau khi tạo dòng ta sẽ thu được cấu trúc 35S-GmDREB2-cmyc. 
Kết quả tạo dòng cấu trúc 35S-GmDREB2-cmyc được kiểm tra bằng phương 
pháp PCR từ plasmid tái tổ hợp pRTRA-GmDREB2 với cặp mồi đặc hiệu 
GmDREB2-NcoI/GmDREB2-NotI (Hình 3.9). 
 72 
M (+) (-) 1 2 3
1,0 kb 
2,0 kb 
0,5 kb 
Hình 3.9. Kết quả PCR kiểm tra các dòng khuẩn E.coli DH5α chứa vector 
pRTRA7/3 với cặp mồi đặc hiệu GmDREB2-NcoI/GmDREB2-NotI. 
M: Thang DNA chuẩn 1kb, (+): Đối chứng dương pBT-GmDREB2; (-): Đối 
chứng âm; giếng 1-3: Các dòng khuẩn lạc. 
Trên hình 3.9 có thể nhận thấy, cả ở 3 giếng (1, 2, 3) và giếng đối chứng 
dương (+) (pBT-GmDREB2) xuất hiện phân đoạn ở vị trí khoảng 500 bp, đây 
chính là phân đoạn gen GmDREB2, trong khi đó ở giếng đối chứng âm (-) không 
xuất hiện. Ở 3 giếng (1, 2, 3) cũng xuất hiện các phân đoạn ở vị trí bằng với 
phân đoạn ở giếng đối chứng dương khoảng 500 bp. Kết quả PCR chứng tỏ cả 
3 dòng khuẩn lạc đều đã mang cấu trúc 35S-GmDREB2-cmyc. Các dòng 
khuẩn lạc cho sản phẩm PCR được tiếp tục tách chiết plasmid chứa cấu trúc 
35S-GmDREB2-cmyc để chuyển vào vector chuyển gen pBI121. 
3.2.1.2. Chuyển cấu trúc chứa gen GmDREB2 vào vector chuyển gen pBI121 
Sau khi tạo được cấu trúc mang gen GmDREB2 chứa đầy đủ các thành 
phần cần thiết cho biểu hiện và kiểm tra hoạt động của gen, việc tiếp theo là gắn 
cấu trúc này vào vector chuyển gen phù hợp để có thể biến nạp được vào hệ gen 
thực vật. 
 73 
Vector pBI121 được lựa chọn chuyển gen vì mang những đặc điểm phù 
hợp, như: Có điểm cắt của enzyme phù hợp, giữa bờ trái (Left boder - LB) và bờ 
phải (Righ boder - RB) có gen kháng kanamycin hoạt động trong tế bào thực