Luận án Nghiên cứu đặc tính sinh học của vi khuẩn Photobacterium damselae gây bệnh trên một số loài cá biển nuôi lồng tại Việt Nam và tạo chủng đột biến giảm độc lực phục vụ sản xuất vắc xin phòng bệnh

GT-3' 
5'-CACCTCGCGGTCTTGCTG-3' 
267 bp 
 - Thành phần phản ứng: 10 µl DNA tổng số, 5µl 10x PCR buffer (100 
mM Tris–HCl, 2 mM MgCl2, 500mM KCl pH 8,3), 0,2 mM dNTP, 1 µM of 
each primer, 2 U of Taq DNA polymerase, nước cất hai lần vừa đủ 50µl. 
- Điều kiện phản ứng: 94oC trong 4 phút; 30 chu kỳ phản ứng bao gồm: 
95oC for 60 giây, 60 oC trong 60 giây, 72 oC trong 40 giây; 72 oC trong 5 phút. Sản 
phẩm phản ứng được phát hiện bằng phương pháp điện di trên agarose 1% (w/v). 
2.4.11. Phương pháp PCR phát hiện gen dly và hlyA 
Bảng 2.2. Mồi khuếch đại các gen dly và hlyA 
Mồi 
Gen 
đích 
Trình tự mồi (5’ – 3’) 
Kích thước 
(bp) 
DLY – F 
DLY – R 
HLYA– F 
HLYA – R 
dly 
dly 
hlyA 
hlyA 
TCG CAT TTT TTC ACC ATT CCC 
TAA GTT CAC GCA TTG AG 
TGT CGT GGC CAT TTT GCT T 
CCG TGA TGC CAA AAT CAA AA 
540 
540 
1484 
1484 
- Thành phần phản ứng PCR khuếch đại các gen dly và hlyA: 10 µl 
DNA tổng số, 5µl 10x PCR buffer (100 mM Tris–HCl, 2 mM MgCl2, 
50 
500mM KCl pH 8,3), 0,2 mM dNTP, 1 µM of each primer, 2 U of Taq DNA 
polymerase, nước cất hai lần vừa đủ 50µl. 
- Điều kiện phản ứng: 94oC trong 2 phút; 35 chu kỳ phản ứng bao gồm: 
94oC for 50 giây, 60 oC trong 60 giây, 72 oC trong 60 giây; 72 oC trong 8 phút. 
Sản phẩm phản ứng được phát hiện bằng phương pháp điện di trên agarose 
1% (w/v). 
2.4.12. Phương pháp điện di trên agarose 
 Phương pháp điện di trên agarose áp dụng theo phương pháp của 
Sambrook và Russell (2001) [149]. 
 - Agarose 1% được đun sơi, để nhiệt độ hạ xuống khoảng 50° – 60°C, 
đổ dung dịch agarose vào khay gel đã cài sẵn răng lược thích hợp. Sau khoảng 
30 phút, khi gel đã đơng cứng, tháo lược, đặt khay gel vào bể điện di. Đổ đệm 
TAE 1X ngập cách mặt gel khoảng 2 mm. 
- Tra mẫu: Mẫu DNA trộn cùng với đệm tra mẫu theo tỷ lệ thích hợp, 
tra mẫu vào các giếng trên bản gel. 
- Tiến hành điện di với dịng điện 1 chiều cĩ hiệu điện thế 100V, cường 
độ dịng điện 60 – 80 mA, quan sát sự di chuyển của vệt màu bromophenol 
blue để ngừng vào thời gian phù hợp (khoảng 30 phút). 
- Nhuộm DNA bằng EtBr: Bản gel được lấy ra khỏi khuơn và ngâm 
vào dung dịch EtBr (nồng độ 10 g/ml) trong thời gian 15 phút. Sau đĩ rửa 
sạch bản gel bằng nước cất. 
- Quan sát và chụp ảnh: Gel được quan sát dưới ánh sáng tử ngoại. 
Quan sát thấy DNA hiện lên dưới dạng các vạch sáng. Ảnh điện di được chụp 
trên máy Bio – Rad với tia UV cĩ bước sống 250 nm. 
2.4.13. Phương pháp tạo chủng nhược độc bằng kỹ thuật gây đột biến thực 
nghiệm 
2.4.13.1. Phương pháp gây giảm độc lực bằng tia cực tím 
 Để giảm độc lực của vi khuẩn P. damselae bằng tia cực tím, được áp 
dụng theo phương pháp của Preecha et al., (2010)[136]. 
 Chủng vi khuẩn P. damselae T4.3 được nuơi cấy tăng sinh trong mơi 
trường Nutrient broth (Sigma, 70148) ở 28°C trong 24 giờ. Pha lỗng sinh 
khối vi khuẩn để đạt mật độ 108cfu/mL (0.2 ở bước sống OD600nm) rồi cấy 
trải trên mơi trường Nutrient agar (Sigma, N9405). Đĩa cấy vi khuẩn được 
chiếu tia UV (cường độ ánh sáng 65 W) trong 1, 2, 3, 4, 5, 10 phút ở khoảng 
51 
cách 30cm. Đĩa xử lý UV được nuơi cấy trong tủ ấm 28°C, trong điều kiện 
khơng cĩ ánh sáng cho đến khi xuất hiện các khuẩn lạc. 
 Các khuẩn lạc mọc trên đĩa được cấy lại trên mơi trường Nutrient agar 
và tiếp tục xử lý UV với điều kiện như trên. Các khuẩn lạc trên đĩa xử lý UV 
lặp lại được cấy lại trên mơi trường Nutrient agar, các khuẩn lạc cĩ hình thái 
biến đổi được lựa chọn để đánh giá sự biến đổi về độc lực thơng qua các 
phương pháp kiểm tra mức độ gây dung huyết và mức độ gây bệnh trên cá. 
2.4.13.2. Phương pháp gây giảm độc lực vi khuẩn bằng kháng sinh rifampicin 
 Để giảm độc lực của vi khuẩn P. damselae bằng kháng sinh rifampicin, 
được áp dụng theo phương pháp của Gliniewicz et al.(2015) [75]. 
 Chủng vi khuẩn P. damselae T4.3 được nuơi cấy tăng sinh trong mơi 
trường Nutrient broth (Sigma, 70148) ở 28°C trong 24 giờ. Pha lỗng sinh 
khối vi khuẩn để đạt mật độ 108cfu/mL (0.2 ở bước sống OD600nm) rồi cấy 
trải trên mơi trường Nutrient agar (Sigma, N9405). Lấy các khuẩn lạc đơn cấy 
chuyển sang mơi trường Nutrient agar bổ sung kháng sinh rifampicin (Sigma, 
5723476) nồng độ 5 µg/ml rồi tiếp tục nuơi cấy ở 28°C cho đến khi xuất hiện 
các khuẩn lạc. 
 Lấy ngẫu nhiên 2 khuẩn lạc riêng rẽ, đặt tên dịng rồi tiếp tục cấy riêng 
rẽ trên Nutrient agar bổ sung kháng sinh rifampicin (Sigma, 5723476) với 
nồng độ tăng dần. Quá trình này lặp lại cho đến khi nồng độ kháng sinh đạt 
250 µg/ml. Ở mỗi bước, các khuẩn lạc được thu lại để đánh giá sự biến đổi về 
độc lực thơng qua các phương pháp kiểm tra mức độ gây dung huyết và mức 
độ gây bệnh trên cá. 
2.4.14. Đánh giá khả năng gây dung huyết của các dịng vi khuẩn đột biến 
giảm độc lực 
 Để đánh giá khả năng gây dung huyết của các dịng vi khuẩn P.damselae 
đột biến giảm độc lực, được áp dụng theo phương pháp của Vaca et al., (2009) 
[170]. 
 Dịch nuơi cấy vi khuẩn được pha lỗng để đạt mật độ 108 CFU/ml. 
Canh khuẩn được xử lý với 0,2% kháng sinh Gentamicin (v/v) và ủ ở 30oC/ 2 
giờ sau đĩ đem ly tâm ở điều kiện 6000 vịng/10 phút ở 4oC rồi thu dịch nổi. 
 Dịch ly tâm được pha lỗng theo hệ số 2 rồi nhỏ vào phiến nhựa 96 
giếng đáy chữ U, mỗi giếng 100 µl. 
52 
Tiếp tục bổ sung vào các giếng 50 µl dịch hồng cầu cừu 3% rồi ủ đĩa 
phản ứng ở 37oC trong 6 giờ. Mức độ gây tan huyết được đánh giá khi hồng 
cầu bị dung huyết hồn tồn. 
Đối chứng dương: 100 µl dịch ly tâm của canh khuẩn chủng tự nhiên kết 
hợp với 50 µl dịch hồng cầu cừu 3% rồi ủ đĩa phản ứng ở 370C trong 6 giờ. 
Đối chứng âm: 100 µl nước muối sinh lý kết hợp với 50 µl dịch hồng 
cầu cừu 3% rồi ủ đĩa phản ứng ở 37oC trong 6 giờ. 
2.4.15. Phương pháp mơ bệnh học 
 Nghiên cứu mơ bệnh học cá biển do vi khuẩn P. damselae, được áp 
dụng theo phương pháp của Mitchell et al., (2004) [118]. 
Sử dụng phương pháp này để tìm hiểu quá trình phát triển bệnh ở mức 
độ vi thể trong các mẫu mơ gan, thận và lách của cá được gây nhiễm với 
dịng vi khuẩn đột biến giảm độc lực. Mẫu cố định trong dung dịch formol 
trung tính rồi xử lý qua các giai đoạn: loại nước, làm trong mẫu và tẩm 
paraffin. Sau đĩ mẫu được đúc khối, cắt với độ dày từ 4 – 6 m và nhuộm 
Haematoxylin và Eosin. Tiêu bản được quan sát dưới kính hiển vi lần lượt ở 
độ phĩng đại 40x và 100x và chụp hình tiêu bản đặc trưng. 
Hình 2.1. Sơ đồ phương pháp mơ bệnh học 
Cố định mẫu 
Thẩm thấu 
Đúc khuơn 
Cắt mẫu 
Nhuộm mẫu 
Đọc mẫu 
Kết luận 
Mẫu bệnh 
53 
 Số mẫu bị nhiễm 
Tỷ lệ nhiễm (% ) = x 100 
 Tổng số mẫu kiểm tra 
2.4.16. Giải trình tự DNA, xử lý và phân tích số liệu trình tự các gen 
 - Giải trình tự DNA 
 Sau khi PCR nhân các gen quan tâm trình tự các gen được gửi đến địa 
chỉ Jalan SP 2/7, Taman Serdang Perdana, Seksyen 2, Seri Kembangan 
43300, Selangor, Malaysia để giải trình tự. 
 - Xử lý và phân tích số liệu trình tự các gen 
 Sử dụng cơng cụ Clustal omega của phần mềm trực tuyến EMBL-EBI 
để đánh giá: Sự sai khác di truyền gen dly, hlyA của các dịng P.damseale 
giảm độc lực và chủng gốc và sự sai khác trong trình tự protein suy diễn từ 
gen của dịng giảm độc lực. 
2.4.17. Phương pháp xác định khả năng tạo đáp ứng miễn dịch bảo hộ ở cá 
của dịng vi khuẩn đột biến giảm độc lực 
Các dịng vi khuẩn đột biến đã được đánh giá giảm khả năng gây dung 
huyết và khả năng gây bệnh được tăng sinh trong mơi trường Nutrient broth 
(Sigma, 70148) ở 28°C trong 24 giờ. Pha lỗng sinh khối vi khuẩn để đạt mật 
độ 105CFU/ml rồi tiêm phúc mạc cho cá mú cĩ khối lượng 50-100g, liều 
lượng 0,2ml/con. 
Sau 15 ngày gây miễn dịch, cá được thử thách bởi chủng tự nhiên T4.3, 
với liều cơng cường độc là 5x1000LD50, tiêm vào vị trí phúc mạc, dưới gốc 
vây đuơi với liều lượng 0,2ml/con. 
 Theo dõi và ghi chép số lượng cá sống sĩt sau 60 ngày. 
 Thí nghiệm được nhắc lại 2 lần với các bước thực hiện như trên. 
2.4.18. Phương pháp ELISA xác định kháng thể đặc hiệu 
Phản ứng ELISA xác định kháng thể đặc hiệu được thực hiện theo 
phương pháp của Yoshihito (2002) [179] . 
54 
 - Kháng nguyên của vi khuẩn P. damselae được tạo bằng cách tăng sinh 
chủng gốc T4.3 ở 28°C, lắc 150 vịng/phút trong vịng 24 giờ trong mơi trường 
BHI. Canh khuẩn được ly tâm ở điều kiện 6,000 rpm trong 10 phút ở 4oC, thu 
cặn. Tế bào vi khuân được phá vỡ bằng thiết bị siêu âm siêu tốc (sonicator) ở 
20kHz, 2 lần trong 1 phút. - Huyết thanh chuẩn là kháng thể đơn dịng kháng 
Anti-Photobacterium damselae subsp. piscicida (code: CABT-B1034, Creative 
Diagnostics, Mỹ). Huyết thanh của cá thí nghiệm được lấy từ máu ở tĩnh mạch 
đuơi của cá sau khi được gây miễn dịch 30, 45, 60, 75, 90, 120 ngày. 
 - Phản ứng ELISA gián tiếp phát hiện kháng thể đặc hiệu với P. 
damselae được thực hiện trong đĩa microplates (96 wells, Nunc 
MaxiSorpTM) được phủ với kháng nguyên của vi khuẩn P. damselae cĩ nồng 
độ là 3,0μg/giếng. Đĩa được rửa 3 lần bằng dung dịch PBS 0.05% Tween20, 
pH7.4 sau khi đổ bỏ dung dịch kháng nguyên thừa. Đập khơ đĩa rồi tiếp tục 
phủ các giếng bằng dung dịch sữa tách bơ 0,5%, ủ đĩa ở 37℃ trong 2 giờ. Lặp 
lại bước rửa đĩa như trên rồi bổ sung 100μl huyết thanh pha lỗng vào các 
giếng, ủ đĩa 35oC trong 2 giờ. Tiếp tục lặp lại bước rửa đĩa và bổ sung 100μl 
rabbit anti-grouper IgM (1/5000), ủ đĩa 45 phút ở nhiệt độ phịng. Đĩa được rửa 
5 lần bằng PBS 0.05% Tween20, pH7.4 rồi đập khơ và bổ sung 100μL dung 
dịch TMB, giữ đĩa ở nhiệt độ thường trong 20 phút. Phản ứng được dừng lại 
bởi 50μL H2SO4 2M. Kết quả phản ứng được xác định bằng giá trị OD450. 
55 
Chương 3. KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN 
3.1. Kết quả phân lập vi khuẩn P. damselae 
3.1.1. Đặc điểm mẫu cá bệnh 
 Trong thời gian từ cuối tháng 2 đến tháng 6 năm 2015 tại một số trang 
trại nuơi cá biển ở các tỉnh miền Bắc (Hải Phịng; Nam Định; Quảng Ninh), 
20 mẫu cá biển (cá mú 7 mẫu, cá bớp 9, cá vược 2 mẫu, cá hồng 3 mẫu) cĩ 
dấu hiệu bệnh Photobacteriosis (được gọi là xuất huyết nhiễm trùng, hoặc 
bệnh đốm trắng ở thận trên cá biển) như: cá bơi gần mặt nước hoặc bơi sát lưới, 
chết rải rác, loét trên da, da tối màu, mang hoại tử, bụng chướng cĩ dấu hiệu 
bị bệnh (hình 3.1). 
Hình 3.1. (a), (b) Mẫu cá mú nghi mắc bệnh Photobacteriosis, thu tại Hải Phịng 
 (c) Mẫu cá mú khơng bị bệnh 
Các mẫu được thu và lưu giữ trong các dụng cụ đã được vơ trùng, bảo 
quản ở 4oC trong suốt quá trình vận chuyển về phịng thí nghiệm tại khoa 
a b 
c 
56 
Cơng Nghệ Sinh Học- Viện Đại Học Mở Hà Nội. Các mẫu được xử lý trong 
vịng 24 giờ kể từ thời điểm lấy mẫu. 
Bảng 3.1. Kết quả thu mẫu và mẫu bệnh phẩm 
TT Địa điểm thu mẫu Đặc điểm mẫu quan sát bên ngồi 
Số lượng mẫu 
thu được 
1 Lồng nuơi cá ở biển 
Cát Bà Hải Phịng 
Cá hồng, cá mú cĩ hiện tượng xuất 
huyết, cĩ vết loét nhỏ trên da 
8 mẫu 
2 Lồng nuơi cá ở biển ở 
Quảng Ninh 
Cá chẽm, cá bớp cĩ hiện tượng thân 
tối màu, chướng bụng, bơi dữ dội 
5 mẫu 
3 Lồng nuơi cá ở biển 
Hải Thịnh-Nam Định 
Cá bớp, cá mú thân tối màu, lở loét 
trên da 
7 mẫu 
Trong 20 cá bệnh thu được với biểu hiện bệnh lý bên ngồi khác nhau, 
tiến hành giải phẫu cá, chúng tơi thu được 60 mẫu từ các cơ quan gan, thận, 
lách, tim, não với các dấu hiệu bị xuất huyết nhiễm trùng, xuất hiện các nốt 
kem trắng hoặc u hạt màu trắng ở các cơ quan nội tạng, hoại tử trong nội tạng 
(hình 3.2). 
Hình 3.2. Hình ảnh cơ quan nội tạng cá bị bệnh Photobacteriosis 
(1) Gan sưng to và cĩ các đốm nhỏ trên bề mặt; (2) Niêm mạc dạ dày bị viêm 
nhiễm; (3) Lách sưng và cĩ đốm trắng; (4) Thận sưng và cĩ các đốm trắng 
57 
Theo kết quả nghiên cứu của Đỗ Thi Hịa và cs năm 2008, cho rằng cá 
giị (cá bớp) nuơi lồng tại Vạn Ninh bị bệnh Photobacteriosis với các biểu hiện 
như: kém ăn, chậm lớn, giải phẫu bên trong cơ thể thận sưng, xuất các đốm trắng 
trong mơ thận, đơi khi gặp ở gan và tụy và gây hết cá rải rác [5]. So sánh các dấu 
hiệu bệnh lý bên ngồi, đặc điểm mẫu bệnh phẩm cá biển được tại các tỉnh 
miền Bắc hồn tồn phù với đặc điểm mơ tả của Đỗ Thị Hịa và cs (2008)[5]. 
Điều này khẳng định, các mẫu cá biển bị bệnh nuơi lồng thu từ các tỉnh miền 
Bắc bị bệnh Photobacteriosis. 
Song song với việc thu mẫu cá, chúng tơi cũng tiến hành đo các yếu tố 
mơi trường ở ao, lồng nuơi xuất hiện bệnh: nhiệt độ 18 – 30oC, pH dao động 
từ 7,5 – 8,5, độ mặn 10 – 32 ‰. Các thơng số mơi trường trên là thích hợp 
cho sự tồn tại và phát triển của các lồi cá biển được nghiên cứu.Theo kết quả 
thu mẫu, chúng tơi nhận thấy các mẫu bệnh thường thu được ở những lồng 
nuơi thả theo hình thức thâm canh, mật độ dày, nước bị ơ nhiễm nặng. Đây cĩ 
thể là những yếu tố khiến cho sức đề kháng của cá giảm, nguy cơ mắc bệnh 
và lây nhiễm bệnh tăng lên. 
Từ các mẫu bệnh phẩm thu được, tiến hành nuơi cấy tăng sinh vi khuẩn 
trong mơi trường dinh dưỡng khơng chứa chất ức chế BHI ở điều kiện 28oC 
trong 4 – 8 giờ. 
3.1.2. Kết quả phân lập vi khuẩn Photobacterium damselae gây bệnh trên 
cá biển nuơi lồng 
Trong quá trình thu mẫu tại vùng biển Quảng Ninh, Nam Định, Hải Phịng, 
chúng tơi thu nhận được 20 mẫu cá (cá mú, cá hồng, cá bớp, cá vược) cĩ dấu hiệu 
của bệnh Photobacteriosis cĩ vết loét trên da, bong trĩc vảy, xuất huyết trên da, 
xuất huyết vây ngực, da tối màu, bơi dữ dội khác thường. Thực hiện phân lập vi 
khuẩn P. damselae chúng tơi thu được các kết quả trong bảng 3.2. Theo nghiên 
cứu của Robohm năm (1983) ở cá ngừ bị bệnh Photobacteriosis, các u hạt bao 
quanh mơ hoại tử và vi khuẩn thường xuất hiện nhiều trong lá lách, thận và 
gan của cá nhiễm [143]. 
58 
Kết quả phân lập vi khuẩn P. damsalae từ cá biển bị bệnh 
Photobacteriosis thu ở các tỉnh miền Bắc cho thấy cĩ sự khác biệt về chủng và số 
lượng chủng phân lập được tại các nội quan, nhiều nhất từ thận (với 4 chủng), tiếp 
đến là gan (với 2 chủng) và ít nhất là lách (với 1 chủng). Điều này, cĩ thể khẳng 
định thận cá, gan là nơi vi khuẩn P. damsalae xuất hiện nhiều nhất. Kết quả 
nghiên cứu của chúng tơi cũng phù hợp với nghiên cứu của Robohm năm 
(1983) [143] và nghiên cứu của Fouz et al, (1992) [65]. 
Bảng 3.2. Kết quả phân lập vi khuẩn P. damsalae từ các mẫu cá biển nghi 
mắc Photobacteriosis (xuất huyết nhiễm trùng) 
TT 
Tên 
chủng 
Nguồn 
gốc 
phân 
lập 
Đặc điểm vi 
khuẩn 
Các phản ứng sinh hĩa 
Catalase Indole KIA 
Khả 
năng 
dung 
huyết 
1 T1.7 Cá mú 
(Thận) 
Trực khuẩn, 
lưỡng cực, 
gram (-) 
+ - Tùy tiện, lên men 
glucose, sinh khí 
β 
2 T1.8 Cá bớp 
(Gan) 
Trực khuẩn, 
lưỡng cực, 
gram (-) 
+ - Tùy tiện, lên men 
glucose, sinh khí 
β 
3 T4.2 Cá hồng 
(Thận) 
Trực khuẩn, 
gram (-) 
+ + Khơng thực hiện 
4 T4.3 Cá mú 
(Thận) 
Trực khuẩn 
gram (-) 
+ - Tùy tiện, lên men 
glucose, sinh khí 
β 
5 T4.4 Cá bớp 
(Thận) 
Trực khuẩn 
gram (-) 
+ - Tùy tiện, lên men 
glucose, sinh khí 
β 
6 B5.22 Cá mú 
( Gan) 
Trực khuẩn, 
lưỡng cực, 
gram (-) 
+ - Tùy tiện, lên men 
glucose, sinh khí 
β 
7 B10.25 Cá vược 
(Lách) 
Trực khuẩn 
gram (-) 
+ - Tùy tiện, lên men 
glucose, sinh khí 
α 
59 
 Từ 20 mẫu bệnh phẩm ban đầu, chúng tơi phân lập được 07 chủng vi 
khuẩn P. damsalae với các đặc điểm hình thái: khuẩn lạc màu trắng đục, vàng 
sậm hoặc nâu đỏ, trịn đều, trơn, bĩng với kích thước 1- 2 mm (hình 3.3.a), tế 
bào dạng trực khuẩn, lượng cực, gram âm (hình 3.3.b). 
Hình 3.3. Hình thái vi khuẩn P. damselae 
(a): Hình thái khuẩn lạc trên mơi trường Marine agar; (b): Hình thái vi khuẩn 
P. damselae nhuộm gram soi dưới kính hiển vi quang học (100X); (c), (d): Hình 
thái khuẩn lạc khi ria trên mơi trường TCBS sau 24 giờ nuơi cấy 
 Các chủng này đều phát triển tốt, tạo khuẩn lạc màu xanh trên mơi trường 
TCBS ở điều kiện 28ºC trong 24 – 32 giờ (hình 3.3.c). Đặc điểm này tương tự 
với báo cáo của Love et al. (1981) và Thyssen et al., (2000) trên TCBS, khuẩn 
lạc vi khuẩn P. damselae cĩ màu xanh, trịn, lồi, bĩng [111], [166]. 
a b 
c d 
T1.7 
60 
 Vi khuẩn P. damsalae là trực khuẩn lưỡng cực gram âm cĩ khả năng lên 
men đường glucose và sinh hơi (Hình 3.4a), dương tính với phản ứng catalase 
(Hình 3.4b), âm tính với phản ứng indol (Hình 3.4c) và cĩ khả năng gây dung 
huyết β (Hình 3.4d). So sánh kết quả thử các phản ứng sinh hĩa các chủng vi 
khuẩn P. damsalae phân lập của chúng tơi tương tự với cơng bố của Thyssen 
et al. (2000). Các đặc điểm này đều cĩ ở 7 chủng vi khuẩn cĩ tên trong bảng 
3.2. Như vậy, bước đầu chúng tơi nhận định rằng, đã phân lập được 7 chủng 
vi khuẩn P. damsalae gây bệnh xuất huyết ở cá biển nuơi tại một số tỉnh miền 
Bắc Việt Nam. 
Hình 3.4. Kết quả thử nghiệm các phản ứng sinh hĩa của chủng T1.7 
(a) các phản ứng lên men trên mơi trường KIA; (b) Phản ứng Catalase; (c) 
Phản ứng sinh Indol với thuốc thử Kovac; (d) Khuẩn lạc P. damselae trên 
thạch máu 
Từ kết quả trên cho thấy vi khuẩn P. damselae phân lập được trên các 
đối tượng: cá mú, cá hồng, cá vược, cá bớp tại miền BắcViệt Nam. Tuy nhiên, 
nghiên cứu của một số tác giả đã tìm thấy vi khuẩn P. damselae trên nhiều đối 
61 
tượng: Fouz et al. (1992) tìm thấy vi khuẩn này trên Cá bơn (Psetta); 
Pedersen et al., (2009) phân lập được vi khuẩn này trên cá hồi vân 
(Oncorhynchus mykiss), Vera et al. (1991) tìm thấy P. damselae trên cá vền 
biển (Sparus aurata),.. [65], [134], [172]. Sự khác nhau này cho thấy vi khuẩn 
P. damselae cĩ thể gây bệnh trên nhiều lồi cá biển khác nhau với các vùng 
địa lý khác nhau là khác nhau. Kết quả này cho thấy vi khuẩn P. damselae 
xuất hiện tại nhiều nước trên thế giới, trên nhiều đối tượng cá biển nuơi và 
gây thiệt hại cho người nuơi cá biển. 
3.1.3. Xác định phân lồi P. damselase gây bệnh trên cá biển nuơi lồng 
bằng phương pháp sinh học phân tử 
Bệnh bệnh xuất huyết ở cá biển được Snieszko et al., (1964) xác định do 
lồi vi khuẩn P. damselae subsp. piscicida gây nên [157]. Dựa trên trình tự 
gen 16S rRNA, Gauthier et al., (1995) đã xác định vi khuẩn này cĩ họ hàng 
gần với lồi P. damselae subsp. damselae thuộc chi Photobacterium [73]. Các 
nghiên cứu gần đây về gen ribosome của các chủng P. damselae ở các vùng 
địa lý và vật chủ khác nhau đã xác định được hai phân lồi này cĩ cùng trình 
tự gen 16S rRNA [129], [131]. 
Cho đến nay, cĩ nhiều phương pháp được xây dựng để xác định lồi P. 
damselae:Bakopoulos et al. (1997), Romalde et al. (1999) sử dụng liên kết 
enzyme xét nghiệm miễn dịch hấp thụ (ELISA) và kỹ thuật xét nghiệm miễn 
dịch enzime (EIA) và Osorio et al. (1999) dựa vào gen 16S rRNA giải trình tự 
để xác định P. damselae [36],[145], [131]. Tuy nhiên tất cả các phương pháp 
này khơng thể phân biệt chính xác giữa 2 phân lồi. Gần đây, một cách tiếp 
cận kết hợp của kỹ thuật PCR và phương pháp mạ đã được đề xuất bởi Rajan 
et al. (2003) [139]. Magariđos et al. (2000) đề xuất phương pháp RAPD (Đa 
hình khuếch đại ngẫu nhiên DNA), Thyssen et al. (2000) xây dựng phương 
pháp đa hình đoạn dài khuếch đại (AFLP) cho thấy khẳ năng phân biệt 2 phân 
lồi [166]. 
62 
Theo Magarinos et al., (1996) đặc trưng trong đặc điểm sinh hĩa 
của P. damselae subsp. damselae là cĩ khả năng thủy phân urê, đặc điểm này 
khơng được phát hiện thấy trong bất kỳ phân lồi nào của chi Photobacterium 
[114]. Mặc dù gen này được phát hiện thấy ở nhiều lồi vi khuẩn thuộc họ 
Vibrionaceae nhưng lồi P. damselae subsp. Piscicida cĩ sự thiếu hụt gen này 
trong bộ gen nhân cũng như plasmid [53], [65]. Vì vậy, trong nghiên cứu này, để 
phân biệt hai lồi P. damselae subsp. Piscicida và P. damselae subsp. damselae 
chúng tơi thực hiện phản ứng multi- PCR để phát hiện 2 gen 16S rRNA và ureC. 
Kết quả thực hiện phản ứng multi- PCR khuếch đại 2 gen 16S rRNA và 
ureC cho thấy: cĩ 05 chủng chỉ phát hiện thấy 1 đoạn gen cĩ kích thước 
khoảng 267bp, 02 chủng phát hiện thấy 02 đoạn gen cĩ kích thước khoảng 
267bp và 448bp (Hình 3.5). So sánh với kết quả nghiên cứu của Osorio et al. 
(2000) [130] và các cơng bố của tác giả này năm 1999 [129], Magarinos et al. 
(1996) [114] cho thấy 05 chủng T1.7, B5.22, T4.4, B10.25 và T4.2 thuộc 
phân