Luận án Nghiên cứu đáp ứng miễn dịch của cá chẽm con (Lates calcarifer Bloch 1790) đối với vi khuẩn Streptococcus iniae

 lần bằng 
PBS-Tween. Thêm vào các giếng dung dịch kháng thể đa dòng của thỏ kháng 
immunoglobulin của chuột có gắn kết horseradish peroxidase (Polyclonal Rabbit 
Anti-Mouse Immunoglobulins/HRP, Dako) đã pha loãng (1:2000) trong PBS-
Tween. Ủ ở nhiệt độ phòng trong 60 phút. Rửa 3 lần rồi hoạt hóa horseradish 
peroxidase bằng cách thêm 0-phenylenediamin (Sigma) vào mỗi giếng. Kết thúc 
phản ứng bằng cách thêm 50µl dung dịch H2SO4 2N vào giếng rồi đo mật độ quang 
(OD) ở bước sóng 492 nm bằng quang phổ kế (Titertek multiskan MK II, Flow 
laboratories, Switzerland). 
 46
ii Xác định thành phần protein kháng nguyên của vi khuẩn S. iniae 
Thành phần protein kháng nguyên của vi khuẩn S. iniae được xác định bằng 
kỹ thuật SDS-PAGE và Western blot. Trong đó, kỹ thuật SDS-PAGE được sử dụng 
để phân tách các protein thành phần của vi khuẩn S. iniae, sau đó xác định các 
protein kháng nguyên bằng kỹ thuật Western blot 
Kỹ thuật SDS-PAGE 
SDS-PAGE được tiến hành theo phương pháp của Laemli (1970) có sửa đổi. 
Theo đó, 50 µg vi khuẩn được đưa vào 1 ống eppendorf chứa 1mL PBS (pH 7,3), 
lắc đều và ly tâm ở 2000 g trong 30 phút. Loại bỏ phần dịch nổi rồi và cho thêm 500 
µL dung dịch mix mutanolysine. Trộn đều và ủ ở nhiệt độ 37oC trong 2 giờ. Ly tâm 
(2000 g, 30 phút) rồi chuyển dịch nổi thu được vào một ống eppendorf khác. Lưu 
giữ ở -80oC cho đến khi cần sử dụng. 
Protein thành phần của vi khuẩn được phân tách bằng kĩ thuật điện di trong 
môi trường polyacylamide 12% nhờ vào máy điện di (Mini Protein Tetra cell, 
Biorad). Nhuộm protein bằng Silver stain plus (Biorad) theo hướng dẫn của nhà sản xuất. 
Kỹ thuật Western Blot 
Sau khi tiến hành phân tách bằng kĩ thuật SDS-PAGE, các vạch protein của 
vi khuẩn được thấm chuyển từ gel lên màng nitrocellulose nhờ vào máy Mini Trans 
blot electrophoretic transfer cell (Biorad) hoạt động ở hiệu điện thế 100 V trong 50 
phút. Sau đó, màng nitrocellulose được đưa vào dung dịch skim milk (3%) trong 2 
giờ để khóa các vị trí liên kết không đặc hiệu. Rửa màng nitrocellulose 3 lần bằng 
dung dịch TTBS (5 phút/lần). Ủ màng trong dung dịch huyết thanh (pha loãng 1:50 
trong TTBS) của cá chẽm đã được gây miễn dịch bằng FKC qua đêm (khoảng 15 
giờ) ở nhiệt độ 4oC. Lặp lại thao tác rửa màng trước khi ủ màng trong dung dịch 
kháng thể đơn dòng của chuột kháng IgM cá chẽm (mouse anti asian seabass IgM 
monoclonal antibody, AQUATIC Diagnostics Ltd.) đã pha loãng 1:100 trong dung 
dịch TTBS trong 2 giờ ở 20oC. Rửa màng nitrocellulose rồi ủ trong dung dịch 
kháng thể đa dòng của thỏ kháng immunoglobulin của chuột có gắn horseradish 
peroxidase (Polyclonal Rabbit Anti-Mouse Immunoglobulins/HRP, Dako) (pha 
 47
loãng với TTBS 1:2000) trong 2 giờ ở 20oC. Hoạt hóa horseradish peroxidase 
(HRP) bằng cách ngâm màng vào dung dịch Horseradish peroxidase color 
development reagent (Bio-Rad) trong 30 phút. 
iii Hiệu quả bảo vệ của FKC đối với bệnh do S. iniae gây ra ở cá chẽm 
 Kiểm định tính vô khuẩn và an toàn của hỗn dịch vi khuẩn bất hoạt 
Cấy dàn 0,1 mL hỗn dịch vi khuẩn S. iniae VN091211R đã bất hoạt như ở 
mục 2.4.1.1 trên các đĩa thạch chứa môi trường TSA rồi ủ ở nhiệt độ 28oC trong 48 
giờ. Kiểm tra sự xuất hiện của các khuẩn lạc vi khuẩn trên môi trường nuôi. 
 Thí nghiệm kiểm định tính an toàn của cá chẽm đối với hỗn dịch vi khuẩn 
bất hoạt được bố trí với 2 nghiệm thức. Mỗi nghiệm thức gồm 200 cá (khối lượng 
thân trung bình 11,6 ± 1,3 g) khỏe mạnh, không có tiền sử cảm nhiễm vi khuẩn S. 
iniae được nuôi trong các bể composite dung tích 2 m3chứa nước biển độ mặn 25 - 
30‰, ở nhiệt độ phòng (27 3°C). Cho cá ăn thức ăn viên (Seabass Feed - Uni-
President Việt Nam), mỗi ngày 2 lần, cho ăn chậm rãi bằng tay cho đến khi cá thôi 
bắt mồi. 
Nghiệm thức 1: Cá được tiêm FKC vào xoang bụng với liều lượng 0,2 mL/con 
Nghiệm thức 2: Cá được tiêm PBS vào xoang bụng với liều lượng 0,2 mL/con 
 Quan sát mọi biểu hiện bất thường của cá thí nghiệm liên tục trong 5 giờ đầu 
tiên sau khi tiêm. Tiếp tục theo dõi số cá chết hàng ngày cho đến ngày thứ 21 sau 
khi tiêm. Trong thời gian này, cá được cho ăn thức ăn viên. Hàng ngày, thay 30% 
lượng nước trong bể. Mọi cá chết thu được đều được kiểm tra và phân lập vi khuẩn 
từ não và thận. Ghi nhận các biến đổi bất thường trong/trên cơ thể cá có liên quan 
đến việc tiêm FKC. Xác định chiều dài và khối lượng của cá ở hai nghiệm thức sau 
khi kết thúc thí nghiệm 
Gây miễn dịch cho cá thí nghiệm bằng FKC. 
Cá chẽm (135 - 155g) khỏe mạnh, không có tiền sử cảm nhiễm vi khuẩn S. 
iniae được chia thành 2 nhóm: nhóm 1, cá được gây miễn dịch bằng cách tiêm FKC 
vào xoang bụng với liều lượng 0,3 mL/con và ở nhóm đối chứng, cá được tiêm PBS 
vào xoang bụng với liều lượng 0,3 mL/con. 
 48
 Cá tiêm FKC và cá đối chứng được nuôi dưỡng riêng biệt trong 2 bể 
composite dung tích 2 m3 với cùng điều kiện bể nuôi (25 - 30‰, 28°C 2°C) và 
chế độ chăm sóc như nhau. Sau 4 tuần tất cả cá thí nghiệm được tiêm nhắc lại giống 
như lần tiêm đầu tiên. 
Công cường độc và đánh giá hiệu quả bảo vệ của FKC 
Việc công cường độc để xác định hiệu quả bảo vệ của vi khuẩn bất hoạt được 
tiến hành ở ngày thứ 60 sau khi gây miễn dịch cho cá. Thí nghiệm được tiến hành 
với 4 nghiệm thức, mỗi nghiệm thức gồm 30 cá chẽm và được lặp lại 2 lần. 
Nghiệm thức 1: tiêm 0,3 mL dịch huyền phù vi khuẩn S. iniae (107 CFU/mL) vào 
xoang bụng của mỗi cá đối chứng 
Nghiệm thức 2: tiêm 0,3 mL dịch huyền phù vi khuẩn S. iniae (108 CFU/mL) vào 
xoang bụng của mỗi cá đối chứng 
Nghiệm thức 3: tiêm 0,3 mL dịch huyền phù vi khuẩn S. iniae (107 CFU/mL) vào 
xoang bụng của mỗi cá đã gây kích thích miễn dịch 
Nghiệm thức 4: tiêm 0,3 mL dịch huyền phù vi khuẩn S. iniae (108 CFU/mL) vào 
xoang bụng của mỗi cá đã gây kích thích miễn dịch 
 Sau khi tiêm vi khuẩn, cá được nuôi riêng trong các bể composite 1 m3 đặt 
trong phòng gây nhiễm thực nghiệm có điều khiển nhiệt độ ổn định ở 28oC bằng 
máy điều hòa không khí. Hằng ngày cho cá ăn thức ăn viên, lượng thức ăn theo nhu 
cầu và hoạt động bắt mồi của cá, thay 50% lượng nước trong bể. Nước thay ra từ 
các bể thí nghiệm được gom về bể xử lý, diệt khuẩn bằng chlorine 50 ppm trong 24 
giờ trước khi bơm vào hệ thống xử lý chung của cơ sở thí nghiệm. 
 Thường xuyên theo dõi cá thí nghiệm và ghi nhận cá chết trong các bể nuôi. 
Cá thí nghiệm được theo dõi liên tục cho đến khi không xuất hiện cá chết trong mọi 
bể thí nghiệm trong 7 ngày liên tục. 
 Tất cả cá tiêm FKC lẫn cá đối chứng chết trong thời gian theo dõi của thí 
nghiệm gây nhiễm thực nghiệm đều được giải phẩu, kiểm tra và phân lập vi khuẩn 
trên môi trường TSA để xác định nguyên nhân gây chết. 
 49
 Hiệu quả bảo vệ của FKC được đánh giá dựa trên hệ số bảo vệ tương đối 
(relative percent protection - RPP) dựa trên tỷ lệ chết cộng dồn của các nhóm cá 
được tiêm FKC và nhóm cá đối chứng được tiêm cùng mật độ vi khuẩn tại thời 
điểm kết thúc thí nghiệm (7 ngày kể từ ngày cuối cùng có cá chết do vi khuẩn S. 
iniae gây ra trong các bể thí nghiệm). Tại thời điểm này, giá trị RPP được tính theo 
công thức: 
2.4.3 Nghiên cứu sự hình thành và phát triển tuyến ức của cá chẽm 
Cá chẽm mới nở được thu mẫu từ các bể ương nuôi cá bột tại Trung tâm 
Nghiên cứu Giống và Dịch bệnh Thủy sản theo định kỳ 12 giờ một lần (10 - 30 
cá/lần thu) cho đến khi cá đạt 40 ngày tuổi. Mẫu cá được cố định trong dung dịch 
Formalin (10%) đệm phosphate trung tính, và đúc parafin để cắt lát (6 µm) liên tục 
toàn bộ thân cá. Các lát cắt được nhuộm Haematoxylin & Eosin và gắn tiêu bản 
bằng Canada balsam. 
Tất cả các lát cắt mô của từng cá thể được quan sát dưới kính hiển vi quang 
học để nhận định về sự hình thành và phát triển của tuyến ức tương ứng với tuổi cá. 
2.4.6 Phương pháp phân tích số liệu 
 Các số liệu thu thập từ các thí nghiệm được xử lý thống kê dựa trên phần 
mềm SPSS 19.0 và microsoft excel 2003. Các giá trị thu được ở nghiên cứu đáp ứng 
miễn dịch không đặc hiệu và hiệu giá kháng thể được so sánh dựa trên phân tích 
phương sai một yếu tố (one way ANOVA) bằng phép thử Tukey với độ tin cậy 
95%. Sai khác về khối lượng trung bình của cá thí nghiệm đánh giá tính an toàn của 
vi khuẩn bất hoạt (FKC) được kiểm định bằng T-test. Biến động hàm lượng kháng 
thể đặc hiệu kháng vi khuẩn S. iniae trong huyết thanh của cá chẽm được gây miễn 
dịch và cá đối chứng được kiểm định dựa trên phân tích phương sai một yếu tố với 
phép thử Tamhane. 
RPP = (1 - ------------------------------------------------------------------) x 100 (%) 
Tỷ lệ chết tích lũy ở nhóm cá tiêm FKC
Tỷ lệ chết tích lũy ở nhóm cá tiêm nước muối sinh lý 
 50
Chương 3 
KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU 
3.1 NGHIÊN CỨU ĐẶC ĐIỂM CỦA CÁC CHỦNG VI KHUẨN Streptococcus 
iniae PHÂN LẬP TỪ CÁ CHẼM 
3.1.1 Phân lập vi khuẩn S. iniae từ cá chẽm nuôi tại Khánh Hòa 
3.1.1.1 Tình hình dịch bệnh do S. iniae gây ra ở cá chẽm nuôi tại Khánh Hòa 
Kết quả phân tích 104 đàn cá chẽm nuôi tại Khánh Hòa đã khẳng định sự có 
mặt của vi khuẩn S. iniae ở cá chẽm tại các vùng nuôi cá trọng điểm của Khánh Hòa 
kể cả hình thức nuôi trong ao hoặc nuôi trong lồng. Mặc dù tỉ lệ cảm nhiễm của vi 
khuẩn này ở cá chẽm chưa cao (7,2%) nhưng tác hại do chúng gây ra rất đáng kể. 
Bảng 3.1 Nguồn phân lập các chủng S. iniae từ cá chẽm nuôi tại Khánh Hòa 
Môi trường và mô phân lập(*) 
TSA TCBS KF 
Thời 
điểm 
thu mẫu 
Địa 
điểm 
Hình 
thức 
nuôi 
Cỡ 
cá 
(g) 
Dấu hiệu bệnh lý
G T N G T N G T N 
Tỉ lệ 
chết 
(%) 
Kí 
hiệu 
chủng
11/2008 Ninh Hòa Ao 12 
Xuất huyết ở 
nắp mang, hậu 
môn 
+ + >50 NH081011P
11/2008 Ninh Hòa Ao 18 
Xuất huyết dưới 
da, hậu môn, 
mắt mờ 
+ + >50 NH081107P
06/2009 Nha Trang Lồng 111 
Sưng thận, xuất 
huyết ở vùng 
miệng 
++ ++ + + + >40 NT090612C
07/2009 Cam Ranh Ao 
12 
Xuất huyết dưới 
da và vùng nắp 
mang 
++ +++ - + ++ - 0,1 (**) CR090722P
10/2009 Cam Ranh Ao 590 Bình thường ++ ++ + - + - + + + 0 
CR09
1016P
11/2009 Cam Ranh Ao 680 Bình thường + ++ - - - - - + - 0 
CR09
1122P
12/2009 Vạn Ninh Lồng 18 Mòn đuôi + + - - - - - + - 0,3 
(**) VN09
1208R
12/2009 Vạn Ninh Lồng 23 
Xuất huyết ở 
gan, lồi mắt - + - - - - - - - 0,3 
(**) VN09
1211R
Ghi chú: (*) Mô phân lập gồm gan (G), thận (T), não (N); (**) % tổng số cá trong ao / ngày. 
 51
Ngoài 2 đàn cá chẽm nuôi ở Cam Ranh, tất cả các đàn cá nhiễm S. iniae đều 
xuất hiện tỉ lệ chết cao. Tỉ lệ cá chết hàng ngày trong giai đoạn mắc nhiễm S. iniae 
biến động trong khoảng 0,1 – 0,3% lượng cá nuôi. Trong trường hợp không điều trị 
kịp thời, tỉ lệ gây chết tích lũy của vi khuẩn này có thể lên đến hơn 50% lượng cá 
nuôi (Bảng 3.1). Biểu hiện bệnh lý của những cá chẽm nuôi tại Khánh Hòa mắc 
nhiễm S. iniae thường gặp là hiện tượng xuất huyết dưới da. Dấu hiệu này có thể 
xuất hiện ở da vùng miệng, nắp mang, hậu môn hoặc ở thân cá, mắt cá mờ đục hoặc 
lồi ra bên ngoài (Hình 3.1a, 3.1b). Các dấu hiệu này tương tự với các thông báo của 
nhiều tác giả trước đây [3, 6, 36, 135]. 
ba 
c d
Hình 3.1 Cá chẽm mắc nhiễm Streptococcus iniae nuôi tại Khánh Hòa.(a: dấu 
hiệu xuất huyết ở thân, các gốc vây và vùng miệng; b: dấu hiệu lồi và xuất huyết ở 
mắt; c: dấu hiệu xuất huyết ở gan và d: dấu hiệu sưng thận). 
 Những quan sát từ hiện trường cho thấy những đàn cá mắc nhiễm vi khuẩn 
S. iniae còn có biểu hiện bơi xoắn. Đây được xem là dấu hiệu điển hình của bệnh do 
S. iniae gây ra ở cá. Hiện tượng bơi bất thường này đã được mô tả ở nhiều báo cáo 
 52
về bệnh do S. iniae gây ra ở cả cá tự nhiên, cá nuôi hoặc cá cảm nhiễm thực nghiệm 
và nguyên nhân gây ra triệu chứng bơi bất thường được giải thích là do sự thoái hóa 
của mô não do vi khuẩn S. iniae có khả năng xuyên qua màng não và gây chứng 
viêm não cho các kí chủ [37, 63, 162]. Tuy nhiên không phải tất cả cá chẽm nhiễm 
S. iniae đều biểu hiện triệu chứng này. Nghiên cứu của Bromage và Owens năm 
2002 cho biết thời gian ủ bệnh do S. iniae ở cá chẽm thường ngắn hơn so với nhiều 
loài cá khác, do đó việc quan sát diễn tiến của dấu hiệu bệnh lý do vi khuẩn này gây 
ra ở cá chẽm khó khăn hơn. Một số cá mắc nhiễm S. iniae còn biểu hiện dấu hiệu 
sưng thận hoặc xuất huyết ở gan (Hình 3.1c, 3.1d), dấu hiệu này cũng đã được 
thông báo bởi Ugajin (1981), Bromage và các cộng sự (1999) [37, 184]. 
3.1.1.2 Đặc điểm phân loại của các chủng vi khuẩn phân lập 
Tất cả các chủng vi khuẩn phân lập được đều là liên cầu khuẩn Gram dương, 
âm tính với các phản ứng catalase, oxydase, có khả năng dung huyết anpha hoặc 
beta, đường kính của khuẩn lạc sau 24 - 48 giờ nuôi cấy trên môi trường TSA nhỏ 
hơn 1mm (Hình 3.2). 
a b
Hình 3.2 Hình dạng khuẩn lạc và tế bào các chủng vi khuẩn S. iniae phân lập 
từ cá chẽm nuôi tại Khánh Hòa. (a: bên trái - kiểu dung huyết β, bên phải – kiểu 
dung huyết α; b: vi khuẩn đã nhuộm Gram) 
Có sự tương đồng về đặc điểm sinh hóa của các chủng vi khuẩn phân lập và 
chủng S. iniae ATCC 29178 (Bảng 3.2). Kết quả xác định các đặc điểm sinh hóa 
của những chủng vi khuẩn này bằng API 20STREP cho thấy tất cả đều âm tính với 
các phản ứng Voges Proskauer (VP), β-glucuronidase (β -GUR), alkaline 
 53
Bảng 3.2 Một số đặc điểm sinh hóa của các chủng vi khuẩn phân lập từ cá 
chẽm nuôi tại Khánh Hòa so với chủng chuẩn tham chiếu S. iniae ATCC 29178 
(1: VN091211R; 2: CR091016P; 3: NH081107P; 4: NH081011P; 5: VN091208R; 
6: CR091122P; 7: NT090612C và 8: CR090722P) 
1 2 3 4 5 6 7 8 ATCC
Phân lập từ Cá chẽm Cá chẽm Cá chẽm Cá chẽm Cá chẽm Cá chẽm Cá chẽm Cá chẽm Cá heo
Nhuộm Gram + + + + + + + + +
Hình dạng tế bào Cocci Cocci Cocci Cocci Cocci Cocci Cocci Cocci Cocci
Sinh Catalase - - - - - - - - -
Sinh Oxidase - - - - - - - - -
Voges Proskauer - - - - - - - - -
Haemolysis (5% sheep RBC) α/β α/β β β α/β α/β β β β
Phát triển trên/trong môi trường
Brain Heart Infusion Agar + + + + + + + + +
Tryptic Soy Agar + + + + + + + + +
Tryptic Soy Broth + + + + + + + + +
Blood agar + + + + + + + + +
Phát triển ở
10oC - - - - - - - - -
27oC + + + + + + + + +
35oC + + + + + + + + +
NaCl 6.5% - - - - - - - - -
Hippurate (HIP) - - - - - - - - -
Esculin (ESC) + + + + + + + + +
Pyrrolidonyl acrylamidase + + + + + + + + +
α-Galactosidase (α-GAL) - - - - - - - - -
β-Glucuronidase (β-GUR) - - - - - - - - -
β-Galactosidase (β-GAL) - - - - - - - - -
Alkalin Phosphatase (PAL) - - - - - - - - -
Leucine Aminopeptidase (LAP + + + + + + + + +
L-arginie (ADH) - - + + - - + + +
D-ribose (RIB) + + + + + + + + +
L-arabinose (ARA) - - - - - - - - -
D-manitol (MAN) + + + + + + + + +
D-sorbitol (SOR) - - - - - - - - -
D-lactose (Tortoli et al., ) - - - - - - - - -
D-trehalose (Sarabhai et al.,) + + - - - - - + +
Inulin (Shapiro et al., ) - - - - - - - - -
D-raffinose (Ton-That et al.,) - - - - - - - - -
Starch (2) (AMD) + + - - + + - - +
Glycogen (GLYG) - - - - - - - - -
Đặc điểm Các chủng phân lập tại Khánh Hòa so với chủng chuẩn ATCC 29178
 54
phosphatase (PAL), leucine aminopeptidase (LAP), trehalose (TRE) và glycogen 
(GLY), dương tính với các phản ứng esculine (ESC) pyrrolidonyl arylamidase 
(PYRA), ribose (RIB) và mannitol (MAN). 
Theo khóa phân loại của Bergey [34], các chủng vi khuẩn phân lập được từ 
cá chẽm bệnh là S. iniae. Sự khác biệt về đặc điểm sinh hóa chỉ thể hiện ở 3 phản 
ứng: arginine dihydrolase (ADH), D-trehalose và Starch (AMD). Tuy nhiên những 
khác biệt này đã từng được công bố bởi các tác giả đã nghiên cứu về vi khuẩn S. 
iniae trước đây như Bromage, Kusuda, Pier và các cộng sự [37, 96, 137]. 
Dựa vào phản ứng L-arginine (ADH) có thể chia các chủng vi khuẩn phân 
lập được thành 2 nhóm: nhóm serotype I (dương tính với phản ứng L-arginine-
ADH) gồm các chủng NH081107P, NH081011P, NT090612C, CR090722P và 
ATCC 29178; nhóm serotype II (âm tính với phản ứng L-arginine) gồm các chủng 
VN091211R, VN091208R, CR091016P, CR091122P [17, 19]. 
Kết quả giải trình tự 16S rDNA của 8 chủng vi khuẩn phân lập từ cá chẽm 
thực hiện bởi Công ty Nam Khoa (Nam Khoa Biotest) cho thấy cả 8 chủng vi khuẩn 
phân lập được đều là S. iniae với mức độ tương đồng từ 99 - 100% so với trình tự 
DNA của các chủng S. iniae đã được công bố ở NCBI trên độ dài của đoạn DNA 
được so sánh từ 405 – 478 bp (phụ lục 1). 
3.1.2 Độc lực của vi khuẩn S. iniae phân lập từ cá bệnh 
Kết quả thu được từ thí nghiệm cảm nhiễm ngược các chủng vi khuẩn S. 
iniae vào cá chẽm cho thấy đàn cá thí nghiệm bắt đầu xảy ra hiện tượng chết từ 2 - 
3 ngày sau khi tiêm vi khuẩn S. iniae vào xoang bụng. Số lượng cá chết tăng mạnh 
vào ngày thứ 5 sau đó giảm dần, đến ngày thứ 10 thì dừng hẳn. 
Dấu hiệu bệnh lý của cá thí nghiệm cũng thể hiện tương tự như cá nhiễm S. 
iniae ở ngoài tự nhiên. Cá hấp hối thường chuyển màu đen sậm và bơi lội bất 
thường. Các dấu hiệu khác như mòn vây, xuất huyết ngoài da, gan hoặc sưng thận 
cũng được tìm thấy ở cá thí nghiệm. Tuy nhiên vẫn có một số cá thí nghiệm chết mà 
không thể hiện dấu hiệu bệnh lý. 
 55
0
10
20
30
40
50
60
70
80
90
100
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11
Ngày sau khi cảm nhiễm
Tỉ 
lệ 
ch
ết 
tíc
h 
lũy
 (%
)
đối chứng
10^2 CFU/mL
10^3 CFU/mL
10^4 CFU/mL
10^5 CFU/mL
10^6 CFU/mL
10^7 CFU/mL
0
20
40
60
80
100
120
0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10
Ngày sau khi cảm nhiễm
Tỉ 
lệ 
ch
ết 
tíc
h 
lũy
 (%
)
đối chứng
2,52x10^2 CFU/mL
2,52x10^3 CFU/mL
2,52x10^4 CFU/mL
2,52x10^5 CFU/mL
2,52x10^6 CFU/mL
2,52x10^7 CFU/mL
0
10
20
30
40
50
60
70
80
90
100
0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10
Ngày sau khi cảm nhiễm
Tỉ 
lệ 
ch
ết 
tíc
h 
lũy
 (%
)
đối chứng
4,86x10^2 CFU/mL
4,86x10^3 CFU/mL
4,86x10^4 CFU/mL
4,86x10^5 CFU/mL
4,86x10^6 CFU/mL
4,86x10^7 CFU/mL
Hình 3.3 Tỉ lệ chết tích lũy ở các nhóm cá chẽm thí nghiệm sau khi tiêm S. 
iniae vào xoang bụng với các nồng độ khác nhau. (a: chủng VN091211R; b: 
chủng NH081107P và c: chủng CR090722P) 
Kết quả phân lập vi khuẩn từ cá thí nghiệm đã thu được vi khuẩn S. iniae 
thuần khiết ở não, gan và thận cá. Không có bất kì hiện tượng chết nào xảy ra ở các 
nghiệm thức đối chứng (Hình 3.3). 
 56
Liều gây chết 50% (LD50) khi tiêm vi khuẩn VN091211R, CR090722P và 
NH081107P vào xoang bụng của cá chẽm khối lượng 16 ± 2 g được xác định lần 
lượt là 104,8, 105,8 và 105,6 CFU (Hình 3.4). 
0
10
20
30
40
50
60
70
80
90
100
1 2 3 4 5 6 7 8 9
log10 của nồng độ VK VN091211R
Tỉ 
lệ 
ch
ết 
tíc
h 
lũy
 (%
)
0
10
20
30
40
50
60
70
80
90
100
1 2 3 4 5 6 7 8 9
log10 của nồng độ VK NH081107P
Tỉ 
lệ 
ch
ết 
tíc
h 
lũy
 (%
)
0
10
20
30
40
50
60
70
80
90
100
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10
log10 của nồng độ VK CR090722P 
Tỉ 
lệ 
ch
ết 
tíc
h 
lũy
 (%
)
Hình 3.4 Tương quan giữa nồng độ vi khuẩn S. iniae tiêm vào xoang bụng và tỉ 
lệ chết tích lũy của các nhóm cá chẽm thí nghiệm 
 57
 58
So sánh với báo cáo của Bromage (1999) và Suanyuk (2010) thì diễn tiến 
bệnh của cá thí nghiệm do các chủng vi khuẩn S. iniae phân lập từ cá chẽm nuôi tại 
Khánh Hòa chậm hơn (ở 2 báo cáo này, cá bắt đầu chết ở ngay ngày thứ nhất sau 
khi tiêm và dừng chết vào ngày thứ 6) và dường như độc lực của các chủng thí 
nghiệm thấp hơn độc lực của chủng vi khuẩn S. iniae phân lập từ cá chẽm nuôi ở Úc 
(LD50 = 3,2 x 104CFU) [37] và ở Thái Lan (LD50 = 1,08 x 104CFU) [172]. Tuy 
nhiên, rất khó để có một sự so sánh một cách chính xác về độc lực của các chủng vi 
khuẩn S. iniae ở nghiên cứu này và các nghiên cứu trước vì ngoài phương thức lây 
nhiễm, diễn tiến bệnh của cá chẽm còn phụ thuộc nhiều yếu tố khác như kích thước 
cá, tình trạng sức khỏe của cá hay tác động của các yếu tố môi trường nuôi[6]. 
Kết quả nghiên cứu của Bromage và các cộng sự (1999) cho biết sau khi kết 
thúc thí nghiệm cảm nhiễm, vi khuẩn S. iniae vẫn còn tồn tại ở não của cá chẽm 
sống sót [37]. Tuy nhiên trong nghiên cứu này, vi khuẩn S. iniae không phân lập 
được từ bất kỳ cơ quan nào của cá sống sót sau khi kết thúc thí nghiệm. 
3.1.3 Độ nhạy của S. iniae với các loại kháng sinh 
Các chủng S. iniae