Luận án Nghiên cứu đáp ứng miễn dịch ở cá mú chấm cam (Epinephelus coioides Hamilton, 1822) nuôi tại Khánh Hòa đối với vi khuẩn vibrio Parahaemolyticus

gây miễn dịch bằng chủng V1 bất hoạt formalin 
 + Nghiệm thức 3: Cá đƣợc gây miễn dịch bằng chủng V2 bất hoạt formalin 
 + Nghiệm thức 4: Cá đƣợc gây miễn dịch bằng chủng V3 bất hoạt formalin 
 + Nghiệm thức đối chứng: cá đƣợc tiêm PBS. 
 Thí nghiệm lặp lại 2 lần. 
b. Cá và điều kiện thí nghiệm 
Cá mú chấm cam sau khi thuần dƣỡng 2 tuần, 200 cá thể khỏe mạnh có khối 
lƣợng và chiều dài trung bình lần lƣợt là 45,6 ± 8,8 g và 13,2 ± 1,2 cm đƣợc chọn sử 
dụng cho thí nghiệm. Cá đƣợc chia vào 10 bể composit với thể tích 500 lít/bể chứa 
nƣớc biển đã qua lọc cơ học và xử lý bằng tia UV. Thí nghiệm trong điều kiện nuôi 
nƣớc chảy vận tốc 2 lít/phút, sục khí liên tục, nhiệt độ dao động từ 28 - 29 oC, độ 
mặn từ 33 - 34 ‰. Mật độ thí nghiệm 20 con/bể. 
c. Cách gây miễn dịch 
 Trƣớc khi gây miễn dịch, cá không đƣợc cho ăn trong 24 giờ. Gây mê cá thí 
nghiệm bằng Ethyleneglycol Monophenylether với nồng độ 100 ppm trong nƣớc 
biển. Cá đƣợc gây miễn dịch bằng cách tiêm xoang bụng 0,1 mL kháng nguyên/cá 
thể, đối với nhóm đối chứng tiêm 0,1 mL PBS/cá thể. 
d. Theo dõi, chăm sóc 
Cá thí nghiệm đƣợc cho ăn mỗi ngày một lần bằng thức ăn viên (M503, Uni-
President) với khẩu phần 2 % khối lƣợng thân. Hàng ngày, theo dõi các yếu tố môi 
trƣờng và tình trạng sức khỏe cá. 
e. Thu mẫu 
 Sau khi gây miễn dịch 30, 45 và 60 ngày, tiến hành thu mẫu huyết thanh để 
phân tích kháng thể. Tại mỗi thời điểm, thu ngẫu nhiên 5 con/bể, lấy máu tại tĩnh 
mạch đuôi để tách huyết thanh sử dụng cho định lƣợng kháng thể. 
Số cá lấy mẫu không cho lại vào bể thí nghiệm. 
54 
f. Định lượng kháng thể trong huyết thanh cá thí nghiệm 
Hiệu giá kháng thể trong huyết thanh cá thí nghiệm đƣợc xác định bằng 
phƣơng pháp miễn dịch liên kết enzyme gián tiếp (indirect Enzyme Linked 
Immunosorbent Assay- i-ELISA) đƣợc mô tả bởi Jakobsen (1999) [98]. Phƣơng 
pháp này dựa trên sự liên kết đặc hiệu giữa kháng nguyên và kháng thể để tạo thành 
phức hợp miễn dịch. Kháng thể trong phức hợp miễn dịch này sẽ đƣợc kết hợp với 
một kháng thể thứ cấp có gắn enzyme và đƣợc phát hiện thông qua phản ứng tạo 
phức màu do tác dụng của enzyme này lên cơ chất tƣơng ứng. 
Hiệu giá kháng thể cần đo phụ thuộc vào độ đậm nhạt của phức màu và đƣợc 
định lƣợng bằng mức độ hấp phụ ánh sáng khi sử dụng máy đo mật độ quang học. 
Qui trình phân tích nhƣ sau: 
Vi khuẩn đã bất hoạt đƣợc lƣu giữ dƣới dạng đông khô đƣợc hòa loãng trong 
PBS (pH 7,3) tƣơng ứng với nồng độ 10 µg/mL. Cho 150 µl dịch khuẩn/giếng (Đĩa 
96 giếng, Nunc MaxiSorpTM), ủ qua đêm ở 4 oC, mỗi chủng vi khuẩn thực hiện trên 
đĩa riêng. Sau khi cố định 1 giờ ở nhiệt độ phòng trong PBS-T (PBS + 0,05 % 
Tween 20) và 3 % sữa tách béo (Skim milk), tiếp tục ủ trong 100 µl kháng huyết 
thanh cá mú (Pha loãng 1:200 trong PBS-T) trong 2 giờ ở nhiệt độ phòng. Mỗi 
giếng thêm 50 µl huyết thanh thỏ kháng IgM cá mú ( Pha loãng 1:3000 trong PBS-
T) trong 2 giờ. Sau đó, thêm 50 µl/giếng huyết thanh dê kháng IgG thỏ có gắn 
enzyme HRP (Goat anti-rabbit IgG conjugated with HRP- Biorad, pha loãng 1:2000 
trong PBS-T) trong 1 giờ. Thêm 50 µl/giếng cơ chất Peroxidase gồm 0-
Phenylenediamine (Sigma) pha trong dung dịch đệm Phosphate citrate. Sau 10 phút, 
kết thúc phản ứng bằng 50 µl dung dịch H2SO4 2.0 M. Đo mật độ quang của các 
giếng bằng máy đo quang phổ (iMark microplate reader - Bio-rad) ở bƣớc sóng 490 
nm. Mỗi mẫu huyết thanh đƣợc thực hiện lặp lại 3 lần trên cùng một đĩa. 
2.3.4.4. Đáp ứng tạo kháng thể và khả năng kháng bệnh của cá mú chấm cam 
đƣợc gây miễn dịch bằng Vibrio parahaemolyticus bất hoạt bằng formalin có bổ 
sung chất bổ trợ FIA 
a. Bố trí thí nghiệm 
Thí nghiệm bao gồm 4 nghiệm thức nhƣ sau: 
+ Nghiệm thức 1 : Gây miễn dịch bằng vi khuẩn bất hoạt có bổ sung FIA (V3F) 
55 
+ Nghiệm thức 2 : Gây miễn dịch bằng vi khuẩn bất hoạt không bổ sung FIA (V3) 
+ Nghiệm thức 3: Đối chứng tiêm PBS tiệt trùng (PBS-C) 
+ Nghiệm thức 4: Đối chứng không tiêm (C). 
Thí nghiệm lặp lại 2 lần trong cùng thời điểm. 
Phƣơng thức gây miễn dịch, theo dõi, chăm sóc, thu mẫu huyết thanh: Tƣơng 
tự thí nghiệm ở mục 2.3.4.2, trang 52. 
b. Chuẩn bị kháng nguyên 
Chọn chủng vi khuẩn có khả năng kích thích tạo kháng thể cao nhất ở thí 
nghiệm trên để gây miễn dịch cho cá. 
Chuẩn bị kháng nguyên tƣơng tự nhƣ ở tiểu mục b, mục 2.3.4.1, trang 52. 
c. Cá thí nghiệm 
Sau khi nuôi thuần dƣỡng 1 tháng, cá thí nghiệm gồm 400 con có khối lƣợng 
và chiều dài thân trung bình lần lƣợt là 49,8 ± 12,8 g và 14,7 ± 1,3 cm. Mật độ thí 
nghiệm là 50 con/bể. Thí nghiệm bố trí trong hệ thống bể composit thể tích 500 lít 
với các điều kiện nuôi tƣơng tự thí nghiệm ở mục 2.3.4.2, trang 53. 
d. Gây nhiễm thực nghiệm 
Khả năng kháng bệnh của cá mú chấm cam đƣợc đánh giá qua kết quả gây 
nhiễm thực nghiệm tại 2 thời điểm: 30 ngày và 60 ngày sau khi gây miễn dịch. Ở 
mỗi thời điểm, 10 cá thể/bể đƣợc tiêm vào cơ huyền dịch khuẩn V. 
parahaemolyticus V3 mật độ 2,5 x 105 cfu/g (sau 30 ngày) và 2,0 x 105 cfu/g ( sau 
60 ngày). Hàng ngày, theo dõi quá trình phát bệnh và ghi nhận số cá chết ở các 
nghiệm thức trong thời gian gây nhiễm. 
 e. Đánh giá đáp ứng kháng thể 
 + Thu mẫu: Các mẫu huyết thanh của cá thí nghiệm ở các nghiệm thức đƣợc 
thu tại thời điểm 30, 45 và 60 ngày sau khi gây miễn dịch đƣợc sử dụng phân tích 
tính đặc hiệu và định lƣợng kháng thể. 
+ Xác định tính đặc hiệu: Kháng thể đƣợc phát hiện dựa trên kỹ thuật 
Western blot theo phƣơng pháp của Towbin et al. (1979) [200]. Các vạch phản ứng 
thể hiện sự kết hợp đặc hiệu giữa các thành phần protein mang tính kháng nguyên 
56 
của vi khuẩn và kháng thể của cá với sự có mặt của các enzyme và kháng thể trung 
gian. Các bƣớc thực hiện phát hiện kháng thể đƣợc tóm lƣợc nhƣ sau: 
Thành phần protein của vi khuẩn V. parahaemolyticus sau khi tách bằng kỹ 
thuật SDS-PAGE đã mô tả nhƣ ở mục 2.3.1.2 trang 43, đƣợc chuyển qua màng NC 
(Pure Nitrocellulose Membrane 0,45 µm, Bio-rad) ở 100 V trong 2 giờ ở 4 oC. Sau 
đó, cố định màng NC trong 1 giờ ở nhiệt độ phòng trong hỗn hợp TBS (150 mM 
NaCl, 20 mM Tris base, pH 7,4) và 5 % sữa tách béo trƣớc khi ủ trong các mẫu 
huyết thanh cá mú với tỷ lệ pha loãng 1:50 trong TBS ở 33 oC trong 2 giờ. Các 
bƣớc thực hiện tiếp theo tƣơng tự nhƣ mô tả ở mục 2.3.3.5 trang 51. 
+ Định lƣợng kháng thể: Kháng thể trong huyết thanh cá mú đƣợc định 
lƣợng theo phƣơng pháp ELISA gián tiếp đã mô tả bởi Jakobsen (1999) [98]. Các 
bƣớc thực hiện phân tích kháng thể tƣơng tự nhƣ đã mô tả ở mục 2.3.4.2, tiểu mục 
f, trang 54. 
+ Đánh giá hệ số bảo hộ RPS (Relative percent survival) của kháng nguyên 
đối với cá theo phƣơng pháp của Ellis (1988) [60]. 
2.4. Phƣơng pháp xử lý số liệu 
 Số liệu thu thập đƣợc xử lý thống kê trên phần mềm SPSS version 15.0. Các 
giá trị trung bình của các đại lƣợng (khối lƣợng, chiều dài thân cá, tỷ lệ các loại tế 
bào bạch cầu trong máu, tỷ lệ tế bào tham gia thực bào, giá trị OD trên các phép đo 
mật độ quang, tỷ lệ nhiễm bệnh) giữa các nghiệm thức đƣợc so sánh theo phƣơng 
pháp phân tích phƣơng sai một yếu tố (one-way ANOVA) và Chi- test. So sánh sự 
khác biệt có ý nghĩa thống kê giữa nhiều giá trị trung bình của các biến bằng phân 
tích Post Hoc test theo phép kiểm định Tukey HSD ở độ tin cậy 95 %. 
* 100 ) ( 1 
Tỷ lệ chết ở nhóm đối chứng (%) 
Tỷ lệ chết ở nhóm gây miễn dịch (%) 
RPS (%) = 
57 
CHƢƠNG 3 
KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN 
3.1. Đặc điểm vi khuẩn Vibrio parahaemolyticus gây bệnh lở loét ở cá mú chấm cam 
3.1.1. Bệnh xuất huyết lở loét ở cá mú chấm cam nuôi tại Khánh Hòa 
Trong thời gian từ tháng 3 – 7 năm 2008, 24 mẫu cá mú chấm cam E. coioides 
bị bệnh xuất huyết lở loét đƣợc thu từ các vùng nuôi cá mú thƣơng phẩm tại Khánh 
Hòa. Trong đó, 16 cá thể đƣợc thu từ các lồng nuôi trên biển ở Vũng Ngán, Nha 
Trang và 8 cá thể từ các ao nuôi thƣơng phẩm tại Cam Ranh. Các mẫu cá bệnh thu 
đƣợc có khối lƣợng thân từ 16 – 1.250 g và chiều dài thân từ 11,5 – 41,0 cm. 
Đặc điểm bệnh xuất huyết lở loét ở cá mú chấm cam với các triệu chứng ban 
đầu là cá thƣờng bơi gần mặt nƣớc hoặc bơi sát vào lƣới, da cá sẫm màu, xuất hiện 
các đốm đỏ trên thân. Sau đó, các đốm này tạo thành vết loét rộng ra xung quanh, 
kèm theo biểu hiện xuất huyết ở vây, miệng, hậu môn, đuôi. Giải phẫu nội quan 
thƣờng thấy gan nhợt nhạt, thận đen bầm, đôi khi tích dịch trong xoang bụng ở một 
số trƣờng hợp bệnh nặng. 
Hình 3.1: Cá mú chấm cam Epinephelus coioides bị bệnh lở loét thu tại Khánh 
Hòa (a: Biểu hiện bên trong, b: Biểu hiện bên ngoài) 
Trong 24 mẫu cá bệnh thu đƣợc, các dấu hiệu bệnh lý xuất hiện với tỷ lệ khác 
nhau tùy thuộc vào tình trạng nhiễm bệnh. Trong đó, 100 % mẫu có triệu chứng 
xuất huyết vây, miệng; 75 % mẫu có nhiều vết loét trên thân; 62,5 % mẫu có gan 
nhợt nhạt; 58,3 % mẫu có thận bầm, nhão; và 33,3 % mẫu có tích dịch vàng trong 
xoang bụng. 
a. b. 
5 cm 
58 
 Từ các mẫu cá nhiễm bệnh đã phân lập đƣợc 16 chủng vi khuẩn V. 
parahaemolyticus với tần số bắt gặp 66,7 %. Trong đó, 8 chủng đƣợc phân lập từ 
thận, 4 chủng từ gan và 4 chủng từ phần cơ tại vết loét. 
Các chủng vi khuẩn phân lập từ cá bệnh đã đƣợc kiểm tra nhanh độc lực bằng 
cách tiêm 0,2 mL dịch khuẩn (108 cfu/mL) cho cá khỏe và quan sát cá thí nghiệm 
trong 5 ngày. Kết quả sàng lọc đã chọn đƣợc 4 chủng có gây triệu chứng sƣng đỏ, 
loét tại vết tiêm và gây chết cá thí nghiệm với biểu hiện lở loét tƣơng tự nhƣ cá 
nhiễm bệnh ngoài tự nhiên. Tuy nhiên, liều gây chết 50 % (LD50) của 4 chủng này 
có sự khác nhau qua thí nghiệm xác định độc lực. Trong đó, chủng có độc tính cao 
nhất là C07K đƣợc phân lập từ thận có giá trị LD50 thấp nhất là 2,14 x 10
3
 cfu/g. 
Chủng này đƣợc ký hiệu là V3, và đƣợc sử dụng để so sánh với các chủng V. 
parahaemolyticus phân lập từ cá mú nhiễm bệnh ở miền Bắc Việt Nam (Viện 
Nghiên cứu Nuôi trồng Thủy sản I cung cấp, ký hiệu là chủng V1), ở miền Nam 
(Viện Nghiên cứu Nuôi trồng Thủy sản II cung cấp, ký hiệu chủng V2) và chủng 
chuẩn do ATCC cung cấp (Chủng A). Các kết quả thu mẫu, phân lập và sàng lọc vi 
khuẩn trình bày chi tiết ở phụ lục 1. 
Từ kết quả này có thể thấy vi khuẩn V. parahaemolyticus chiếm tỷ lệ bắt gặp 
khá lớn trong các trƣờng hợp cá mú chấm cam bị bệnh xuất huyết lở loét nuôi 
thƣơng phẩm tại Khánh Hòa. Ngoài ra, kết quả cảm nhiễm cũng đã chứng tỏ vi 
khuẩn này là tác nhân gây ra bệnh xuất huyết lở loét cho cá mú chấm cam trong 
điều kiện nhân tạo. 
Kết luận này cũng tƣơng tự với kết quả nghiên cứu bệnh ở cá mú nuôi tại 
Khánh Hòa mà tác giả thu đƣợc trong quá trình thực hiện luận văn thạc sĩ năm 
2005. Kết quả điều tra tình hình bệnh cá mú tại thời gian này cho thấy có tới 77,8 % 
số hộ nuôi cá mú trong ao đất ở Cam Ranh và 83,3 % số hộ nuôi cá mú lồng bè ở 
Nha Trang đã chịu thiệt hại do bệnh xuất huyết lở loét với tỷ lệ cá nhiễm bệnh từ 20 
– 30 % đàn cá /ao (lồng)/vụ và đã xác định V. parahaemolyticus là một trong những 
tác nhân gây bệnh có tần số bắt gặp khá lớn với 56 % [148]. 
59 
Gần đây, Đỗ Thị Hòa và ctv (2008) cũng thông báo rằng bệnh Vibriosis xảy ra 
100 % ở cá biển nuôi lồng và 58,3 % ở cá nuôi ao, trong đó trên cá mú nuôi, bệnh 
này chiếm 40/65 ( 61,5 %) số hộ đƣợc điều tra tại Khánh Hòa [5]. 
Hầu hết các nghiên cứu bệnh thƣờng gặp trên cá mú nuôi tại các vùng nuôi 
khác nhau ở Việt Nam cũng đều khẳng định Vibriosis là bệnh thƣờng gặp và chiếm 
tỷ lệ cao nhất ở cá nuôi. Bệnh lây lan rất nhanh, nếu không phát hiện kịp thời có khả 
năng gây chết rất cao. Bệnh thƣờng xuất hiện vào mùa nóng và đầu mùa mƣa, khi 
môi trƣờng thay đổi đột ngột, làm cá dễ bị sốc. Hơn nữa, vi khuẩn tổng số trong 
nƣớc có xu hƣớng tăng khi nhiệt độ tăng. Đây là điều kiện tốt cho vi khuẩn xâm 
nhập gây bệnh và đặc biệt gây chết nhiều đối với cá giống mới thả nuôi [9], [14], 
[15]. 
Mặc dù nhận thức rõ về tác hại do V. parahaemolyticus nói riêng và bệnh do vi 
khuẩn Vibrio gây ra cho nghề nuôi cá biển, nhƣng các nghiên cứu sâu hơn về đặc 
điểm vi khuẩn gây bệnh cũng nhƣ khả năng sinh đáp ứng miễn dịch ở ký chủ đối với 
chúng vẫn chƣa đƣợc quan tâm đúng mức. Vì vậy, các nghiên cứu về đặc điểm sinh 
hóa, độc tính, thành phần protein nhằm cung cấp những hiểu biết cơ bản về tác nhân 
gây bệnh đã trở nên rất cần thiết và có ý nghĩa quan trọng trong ứng dụng nghiên cứu 
phát triển vaccine phòng bệnh Vibriosis trên cá mú trong tƣơng lai. 
3.1.2. Đặc điểm của vi khuẩn Vibrio parahaemolyticus 
3.1.2.1. Đặc điểm hình thái, sinh hóa, sinh lý 
Bốn chủng vi khuẩn đƣa vào nghiên cứu (V1, V2, V3 và A) đều thể hiện các 
đặc điểm hình thái, sinh lý, sinh hóa khá giống nhau: vi khuẩn Gram âm, hình que 
ngắn, có khả năng di động, tạo khuẩn lạc màu xanh trên môi trƣờng TCBS do 
không có khả năng phân giải đƣờng sucrose và đều có khả năng chịu mặn cao đến 8 
% trong môi trƣờng TSB (Bảng 3.1). 
 Kết quả ở Bảng 3.1 cho thấy cả bốn chủng vi khuẩn V. parahaemolyticus đều 
có khả năng oxy hoá và lên men trong môi trƣờng O/F glucose, không sinh H2S và 
dƣơng tính với các phản ứng oxidase, catalase, lysine decarboxylase, ornithine 
decarboxylase, gelatinase, indole, nhạy với Vibriostat O/129 (150 µg). Ngoài ra, 
60 
hầu hết các chủng đều có khả năng phân giải protein, lipid và một số loại đƣờng bởi 
sự có mặt của các enzyme đặc trƣng có liên quan chặt chẽ đến khả năng gây bệnh 
của chúng trên vật chủ. 
Bảng 3.1: Đặc điểm hình thái, sinh hóa, sinh lý của 4 chủng vi khuẩn 
 Vibrio parahaemolyticus 
Đặc điểm V1 V2 V3 A 
Các đặc điểm hình thái, sinh lý 
Hình dạng tế bào 
Gram 
Di động 
Hoạt tính hemolysin 
Màu sắc khuẩn lạc trên TCBS 
Khả năng chịu mặn (% NaCl): 
0 
3 
6 
8 
10 
Que ngắn 
- 
+ 
+/α 
Xanh 
- 
+ 
+ 
+ 
- 
Que ngắn 
- 
+ 
V/α 
Xanh 
 - 
+ 
+ 
V 
- 
Que ngắn 
- 
+ 
+/β 
Xanh 
- 
+ 
+ 
+ 
- 
Que ngắn 
- 
+ 
+/α 
Xanh 
- 
+ 
+ 
+ 
- 
Các đặc điểm sinh hóa 
Cytochrom-Oxidase 
Catalase 
O/129 (150 μg) 
O/F Glucose 
β-galactosidase (ONPG test) 
Arginine dihydrolase 
Lysine decarboxylase 
Ornithine decarboxylase 
Citrate 
H2S 
Urease 
Tryptophan deaminase 
Indole 
+ 
+ 
+ 
+/+ 
- 
- 
+ 
+ 
+ 
- 
- 
- 
+ 
+ 
+ 
+ 
+/+ 
- 
- 
+ 
+ 
V 
- 
- 
- 
+ 
+ 
+ 
+ 
+/+ 
- 
- 
+ 
+ 
V 
- 
- 
- 
+ 
+ 
+ 
+ 
+/+ 
- 
- 
+ 
V 
+ 
- 
- 
- 
+ 
61 
Voges Proskauer 
Gelatinase 
Glucose 
Mannitol 
Inositol 
Sorbitol 
Rhamnose 
Sucrose 
Melibiose 
Amygdalin 
Arabinose 
Khử NO2 
Phosphatase alcaline 
Esterase (C4) 
Esterase lipase (C8) 
Lipase (C14) 
Leucine arylamidase 
Valine arylamidase 
Cystine arylamidase 
Trypsin 
Chymotrypsin 
Phosphatase acid 
Naphthol-AS-B1-phosphohydrolase 
α-galactosidase 
β-galactosidase 
β-glucuronidase 
α-glucosidase 
β-glucosidase 
β-N-acetyl-glucosaminidase 
α-mannosidase 
α-fucosidase 
- 
+ 
+ 
+ 
- 
- 
- 
- 
- 
+ 
- 
+ 
+ 
+ 
+ 
- 
+ 
- 
- 
+ 
+ 
+ 
 - 
- 
- 
- 
- 
- 
- 
- 
- 
- 
+ 
+ 
+ 
- 
- 
- 
- 
- 
V 
- 
+ 
+ 
+ 
+ 
- 
+ 
- 
- 
+ 
+ 
+ 
- 
- 
- 
- 
- 
- 
- 
- 
- 
- 
+ 
+ 
+ 
- 
- 
- 
- 
- 
V 
- 
+ 
+ 
+ 
+ 
- 
+ 
- 
- 
+ 
+ 
+ 
- 
- 
- 
- 
- 
- 
- 
- 
- 
- 
+ 
+ 
+ 
- 
- 
- 
- 
- 
V 
- 
+ 
+ 
+ 
+ 
- 
+ 
- 
- 
+ 
- 
+ 
- 
- 
- 
- 
- 
- 
- 
- 
- 
Ghi chú: + ( ≥ 90 % dương tính), - ( ≥ 90 % âm tính), V ( variable, không ổn định 
giữa các lần thử) 
62 
Ngoài ra, kết quả kiểm tra hoạt tính hemolysin của 4 chủng vi khuẩn nghiên 
cứu cho thấy chúng đều có khả năng dung huyết máu thỏ trên môi trƣờng thạch. 
Trong đó, chủng V3 cho kiểu dung huyết β trong khi 3 chủng còn lại có kiểu dung 
huyết α (Hình 3.2). 
Hình 3.2: Vibrio parahaemolyticus trên môi trƣờng thạch máu 
Từ kết quả trên có thể thấy rằng, ngoài một vài điểm khác biệt nhƣ khả năng 
chịu mặn, phân giải đƣờng Amygdalin, Citrate và Ornithine decarboxylase, các 
chủng V1, V2, V3 đều có hầu hết đặc điểm hình thái, sinh hóa, sinh lý khá tƣơng 
đồng với chủng chuẩn ATCC 17802 và đƣợc định danh là vi khuẩn V. 
parahaemolyticus theo khóa phân loại của Bergey. 
Bên cạnh kết quả định danh dựa trên các đặc điểm hình thái và sinh hóa truyền 
thống, phƣơng pháp định danh bằng sinh học phân tử đối với chủng V3 dựa trên phân 
tích trình tự gen 16S rDNA và so sánh với trình tự chủng chuẩn A và các chủng V. 
parahaemolyticus trên Genbank đã thể hiện mức độ tƣơng đồng đến 99 % (Trình tự 
khác biệt đƣợc trình bày chi tiết ở phụ lục 2). Phản ứng PCR cho kết quả một băng đậm 
nét ở 550 bp phù hợp với tính toán lý thuyết (Hình 3.3). 
 Dung huyết kiểu β Dung huyết kiểu α 
63 
Hình 3.3: Kết quả điện di trên gel agarose gen 16s rDNA của các chủng vi 
khuẩn Vibrio parahaemolyticus (M: DNA marker 100 bp, cột 1, 2: chủng V3; cột 
3, 4: chủng A) 
Ngoài ra, cây phát sinh loài (Hình 3.4) cho thấy chủng V. parahaemolitycus V3 
có mối quan hệ gần gũi với chủng chuẩn A và chủng V. parahaemolyticus ES05 
(Genbank) 
Hình 3.4: Cây phát sinh loài các chủng vi khuẩn Vibrio (V. parahaemolyticus 
V3: chủng V3; V. parahaemolyticus A: chủng A; các chủng V. campbelli, V. harveyi, 
Vibrio sp., Vibrio sp. My, V. parahaemolyticus ES05 là các chủng tham khảo từ 
Genbank). 
1 2 3 4 M 
 550 bp 
500 bp 
100 bp 
64 
Nhƣ vậy, dựa vào các đặc điểm hình thái, sinh lý, sinh hóa và di truyền có 
thể khẳng định chủng V3 phân lập từ cá mú chấm cam E. coioides bị bệnh lở loét 
nuôi tại Khánh Hòa là V. parahaemolyticus. Vì vậy, chủng này đƣợc sử dụng làm 
kháng nguyên trong nghiên cứu đáp ứng miễn dịch của cá mú chấm cam đối với vi 
khuẩn V. parahaemolyticus tại nghiên cứu này cùng với các chủng V1, V2 và A. 
Vi khuẩn Vibrio có mặt khắp nơi trong môi trƣờng nƣớc mặn và là một phần 
của hệ vi sinh vật nƣớc. Vi khuẩn Vibrio đầu tiên đƣợc báo cáo là tác nhân gây bệnh 
trên cá biển vào năm 1909 ở vùng biển Baltic với dấu hiệu đặc trƣng là các vết loét 
trên bề mặt cơ thể, đôi khi kèm theo hiện tƣợng xuất huyết trong cơ và nội quan của 
cá bệnh [153]. Ngày nay, nhiều nghiên cứu cho thấy vi khuẩn Vibrio gây bệnh xuất 
huyết nhiễm trùng máu ở nhiều loài cá biển nuôi có giá trị kinh tế phân bố cả ở 
vùng biển ấm và lạnh nhƣ cá chẽm (Lates calcarifer), cá hồng (Lutjanus spp.), cá 
hồi vân (Oncorhynchus spp.), cá tráp (Sparus auratus), cá chẽm Châu Âu 
(Dicentrarchus labrax), cá bơn (Scophthalmus maximus)...Tác nhân gây bệnh ở cá 
biển thuộc giống Vibrio thƣờng là các loài sau: V. parahaemolyticus, V. 
alginolyticus, V. vulnificus, V. carchariae Dấu hiệu đặc trƣng bên ngoài của bệnh 
Vibriosis bao gồm xuất huyết ở vây, miệng, hậu môn; hoại tử phần cơ tại các vết 
loét; vây mòn cụt, mắt lồi và đục. Giải phẫu nội quan cá bệnh nặng cho thấy gan, 
thận thƣờng bị xuất huyết, phù nề [26], [81], [132], [199]. 
 Ở họ cá mú Epinephelus, vi khuẩn Vibrio thƣờng gây bệnh trên các loài cá 
mú chấm xanh (Plectropomus leopardus), mú đen (Epinephelus malabaricus), mú 
chấm cam (E. coioides) và mú mè (E. bleekeri) đã gây thiệt hại kinh tế cho nghề 
nuôi cá mú ở nhiều nƣớc nhƣ Malaysia, Đài Loan, Hồng Kông, Trung Quốc, 
Indonesia, Philippines, Thái Lan [82]. 
Vi khuẩn V. parahaemolyticus đã đƣợc thông báo gây bệnh ở nhiều loài cá mú 
nuôi ở Thái Lan [45], [55]; Trung Quốc [126]; Malaysia [144]; Việt Nam [5], [8], 
[14], [148]Khả năng gây bệnh của vi khuẩn này đối với vật chủ liên quan đến khả 
65 
năng dung huyết đƣợc quy định bởi các protein độc tố và khả năng phân giải 
protein, lipid và các loại đƣờng bởi sự có mặt của các enzyme đặc trƣng [217]. 
Nhiều nghiên cứu chỉ ra rằng hoạt tính dung huyết là một trong những yếu tố gây 
độc của vi khuẩn V. parahaemolyticus đối với vật chủ, bao gồm độc tố bền nhiệt 
TDH với kiểu dung huyết β [97], [195] và độc tố không bền nhiệt TRH gây hiện 
tƣợng dung huyết kèm theo tích dịch [91] và đều có tính kháng nguyên cao [213], 
[217]. 
Một loại độc tố không bền nhiệt khác có ở V. parahaemolyticus là TLH đƣợc 
mã hóa bởi gen tlh. Chúng có khả năng dung gi