Luận án Nghiên cứu hệ gen phiên mã (transcriptome) của tôm sú (penaeus monodon) nhằm sàng lọc các chỉ thị phân tử phục vụ công tác chọn giống

trưởng từ nhĩm tơm sú 
gia hĩa tăng trưởng nhanh và tăng trưởng chậm. 
2.5. PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 
 Để thực hiện luận án này, tiến trình nghiên cứu được thể hiện ở sở đồ 
Hình 2.2, với các phương pháp được trình bày chi tiết dưới đây. 
Hình 2.2: Sơ đồ nghiên cứu 
Mẫu tơm sú tự nhiên 
Tách chiết và tinh sạch mRNA 
Chuẩn bị thư viện cDNA 
Giải trình tự hệ phiên mã bằng 
máy giải trình tự gen thế hệ mới 
Illumina Mi-Seq 
Đánh giá và tiền xử lý dữ liệu đọc 
trình tự thơ 
Lắp ráp và chú giải chức năng hệ 
gen phiên mã 
Xây dựng bộ cơ sở dữ liệu hệ phiên mã 
(transcriptome) tơm sú Penaeus monodon 
Mẫu tơm sú gia hĩa 
Tách chiết RNA tổng số 
Sàng lọc các unigene 
liên quan đến tính trạng 
tăng trưởng 
Sàng lọc các SNPs 
liên quan đến tính 
trạng tăng trưởng 
Unigene SNP 
 48 
2.5.1. Phương pháp tách riêng rẽ các mơ nghiên cứu 
30 mẫu tơm sú tự nhiên cịn sống tiến hành tách riêng các mơ gồm mơ 
tim, mơ cơ, mơ gan tụy và mơ gốc mắt với vị trí lấy mẫu như Hình 2.3. Mẫu 
được bảo quản lạnh ngay, tránh sự phân hủy đặc biệt đối với mơ gan tụy. Mẫu 
mơ cơ nghiên cứu được lấy ở phần cơ gần đuơi. 
2.5.2. Tách chiết RNA tổng số từ mơ tơm bằng Trizol 
Các mơ sau khi tách riêng rẽ, bảo quản đúng điều kiện, được sử dụng để 
tách chiết RNA tổng số sử dụng Trizol theo hướng dẫn của nhà sản xuất 
Invitrogen, Mỹ. Qui trình tách chiết gồm các bước như sau (1) Nghiền mơ trong 
Nitơ lỏng và đồng nhất mẫu với Trizol, (2) Phân tách các lớp chứa RNA bằng 
Chloroform, (3) Kết tủa RNA với Isopropanol, (4) Rửa kết tủa bằng Ethanol 
70%, (5) Hịa lại kết tủa với nước được xử lý DEPC (Water treated DEPC). 
Hình 2.3: Tơm sú và hình ảnh giải phẫu 
 49 
2.5.3. Tách và tinh sạch mRNA 
mRNA được tinh chế sử dụng bộ kit Dynabeads mRNA purification 
(Thermoscientific) dựa trên nguyên tắc liên kết ái lực giữa đuơi poly A ở đầu 
3’ của mRNA và đuơi polyT trên bề mặt hạt Dynabeads. Những loại RNA 
khơng cĩ đuơi poly A sẽ khơng liên kết với hạt từ và bị rửa trơi. Các bước tiến 
hànhtheo hướng dẫn của nhà sản xuất, cụ thể như sau: 
- Chuẩn bị RNA: 75 µg RNA tổng số được hịa trong 100 µl nước khử 
DEPC, ủ 65oC trong 2 phút, để lên đá. 
- Chuẩn bị Dynabeads: 
+ Hút 200 µl (1mg) hạt từ vào ống Eppendorf 1,5 ml và để lên giá từ 30 
giây hoặc cho đến khi các hạt từ bám hồn tồn lên thành ống. 
+ Hút loại bỏ dịch, bỏ ống ra khỏi giá từ và bổ sung 100 µl Binding 
buffer. Đặt lên giá từ và loại dịch. Bỏ ống ra khỏi giá từ 
+ Bổ sung 100 µl Binding buffer 
- Tinh chế mRNA 
+ Bổ sung RNA tổng số và ống Eppendorf chuẩn bị phía trên 
(Dynabead/binding buffer), đảo lên xuống 3-5 phút ở nhiệt độ phịng, để 
mRNA gắn với oligo (dT) 25 trên bề mặt hạt từ. 
+ Đặt ống Eppendorf lên giá từ và loại dịch 
+ Bỏ ống ra khỏi giá từ, rửa phức hợp mRNA-bead 2 lần bằng 200 µl 
Washing buffer. 
+ Thu nhận lại mRNA bằng cách bổ sung 10 µl 10mM Tris-HCl pH7,5, 
ủ 70oC trong2 phút, để ngay lập tức lên giá từ. 
+ Chuyển mRNA sang ống Eppendorf mới. 
 50 
2.5.4. Thiết lập thư viện cDNA 
Thư viện cDNA được chuẩn bị với bộ sinh phẩm TruSeq Strand mRNA 
LT theo hướng dẫn của nhà sản xuất Illumina (Chi tiết tại phụ lục 2), với các 
bước như sau: (1) Tổng hợp cDNA sợi đơn, (2) Tổng hợp cDNA sợi đơi, (3) 
Gắn Adenyle vào đầu 3’, (4) Nối adapter, (5) Làm giàu các đoạn DNA. 
2.5.5. Phương pháp tiền xử lý dữ liệu 
Dữ liệu trình tự đọc thơ được đánh giá chất lượng bằng phần mềm 
FastQC ( và tiền 
xử lý bằng phần mềm Trimmomatic (Ashburner và cs., 2000) (parameters: 
ILLUMINACLIP:2:30:10 LEADING:3 TRAILING:3 
SLIDINGWINDOW:4:15 MINLEN:70) để thu được bộ dữ liệu trình tự đọc 
tinh sạch. Sau quá trình tiền xử lý, tiếp tục sử dụng FastQC để đánh giá lại 
chất lượng và kiểm tra khả năng tiền xử lý. 
Dữ liệu giải trình tự được xử lý bởi phần mềm FastQC, kết quả đánh giá 
được xuất ra các đồ thị và bảng biểu tổng kết. Dữ liệu đầu vào là tệp tin 
FASTQ và được thống kê, đánh giá chất lượng của dữ liệu trình tự dựa trên 
các tiêu chí như sau: 
- Chất lượng trình tự theo vị trí base: Tiêu chí này cho biết tính chính xác 
của việc đọc base thơng qua việc thống kê chất lượng của các base tại mỗi vị 
trí trên tất cả các trình tự và tạo ra một biểu đồ Box-Whisker tại vị trí đĩ để 
mơ tả sự phân bố chất lượng base giữa các vị trí. 
- Chất lượng theo đoạn trình tự: Tiêu chí này báo cáo dựa vào chất lượng 
trung bình của từng trình tự và lập thành một đồ thị tích lũy. 
Cơng đoạn làm sạch dữ liệu được thực hiện với cơng cụ Trimmomatic. 
Bộ cơng cụ Trimmomatic được sử dụng để xử lý các trình tự chất lượng thấp, 
kích thước ngắn. Mục tiêu của nghiên cứu là giảm xác suất xảy ra lỗi đọc 
 51 
trình tự xuống dưới 1:1000 và chỉ sử dụng trình tự cĩ độ dài từ 70bp trở lên. 
Do đĩ, các thơng số được sử dụng như sau: kích thước tối thiểu 70bp, điểm 
chất lượng trình tự tối thiểu 30 (tương đương với xác suất lỗi 1:1000), kích 
thước khung cắt 4bp. 
2.5.6. Phương pháp lắp ráp de novo hệ gen phiên mã 
Dữ liệu tiền xử lý được lắp ráp de novo bằng phần mềm Trinity phiên 
bản trinityrnaseq_r20140717 (Haas và cs., 2013) với tham số mặc định (kmer = 
25-mers) thu được hệ phiên mã thơ. Để cĩ thể loại bỏ tối đa những trình tự cĩ 
chất lượng lắp ráp khơng tốt, tiến hành ánh xạ dữ liệu trình tự đọc tinh sạch 
vào hệ phiên mã thơ bằng phần mềm RSEM 1.2.15 được tích hợp vào Trinity 
script align_and_estimate_abundance.pl ( từ đĩ 
tính tốn được số lượng trình tự đọc sử dụng để lắp ráp nên mỗi transcript 
trong hệ phiên mã thơ theo điểm số FPKM (Fragments Per Kilobase of Exon 
Per Million Fragments Mapped) (Li và Dewey, 2011). Những transcript cĩ 
điểm số FPKM nhỏ hơn 1 bị loại bỏ khỏi kết quả lắp ráp. Một vấn đề khác cĩ 
trong dữ liệu hệ phiên mã là cĩ rất nhiều transcript giống nhau, gây nên sự dư 
thừa dữ liệu. Do đĩ, nghiên cứu sử dụng đoạn mã Perl 
(https://namason.com/code/) để gộp transcript dài nhất trong mỗi nhĩm 
(cluster) transcript định nghĩa bởi Trinity (c*g*), transcript dài nhất này được 
gọi là unigene. Thơng qua 2 bước tinh sạch này, thu được hệ phiên mã tinh 
sạch bao gồm tồn bộ unigene để sử dụng cho các phân tích tiếp theo. 
2.5.7. Phương pháp đánh giá chất lượng lắp ráp hệ phiên mã 
Tỷ lệ đoạn trình tự giĩng hàng lại với hệ phiên mã vừa lắp ráp là một chỉ 
số quan trọng để đánh giá chất lượng lắp ráp. Nếu tỷ lệ cao các đoạn trình tự 
ánh xạ ngược lại hệ phiên mã, điều này cĩ nghĩa mức độ tin cậy của bản lắp 
ráp càng cao và ngược lại. Trong thí nghiệm này, nhằm đánh giá chất lượng 
 52 
hệ phiên mã được lắp ráp de novo bằng phần mềm Trinity, tiến hành giĩng 
hàng dữ liệu trình tự đọc đã tinh sạch vào tập unigene cuối cùng bằng phần 
mềm Bowtie2 (Langmead và Salzberg, 2012). Sau đĩ kết quả chi tiết về số 
lượng đoạn trình tự giĩng hàng được tính tốn sử dụng phần mềm SAMtools 
(Li và cs., 2009). 
Các bản lắp ráp được thống kê sử dụng cơng cụ TrinityStat.pl được tích 
hợp trong phần mềm Trinity (Haas và cs., 2013). Phần mềm nhận đầu vào là 
tệp tin Fasta lắp ráp được, sau đĩ thống kê và đánh giá chất lượng của dữ liệu 
trình tự dựa trên một số tiêu chí như sau: 
- Số lượng contig: TrinityStat.pl thống kê số lượng theo 2 mức: mức độ 
transcript và unigene. 
- Tổng độ dài của các transcript và unigene: Tương tự như số lượng 
contig, kết quả đầu ra thống kê tổng độ dài transcript và unigene. 
- N50: Trên một tập contig đã được sắp xếp theo thứ tự độ dài giảm dần, 
N50 được định nghĩa bởi độ dài của contig mà tại đĩ chia tập contig thành 2 
phần, trong đĩ các contig ở phần thứ nhất cĩ tổng độ dài đạt ít nhất một nửa 
tổng độ dài của tồn bộ tập contig. N50 được sử dụng phổ biến để đánh giá 
các bản lắp ráp, với giá trị N50 càng lớn tương đương với khả năng chất 
lượng của bản lắp ráp càng cao. 
 Trong ví dụ ở hình 2.3, t
+ 70K + 65K + 50K + 35K + 18K + 12K + 3K = 703K. 50% t
contig là 351,5K. Vì 200K + 140K + 110K > 351,5K, v
2.5.8. Phương pháp chú gi
mã 
Các trình tự unigene tơm sú 
novo từ dữ liệu giải trình t
đồng trên ngân hàng cơ s
với phần mềm BLASTx (tham s
sử dụng BLASTx (E-value < 1e
dữ liệu protein khác nhau như Swiss
Orthologous Groups (COG) 
năng từ cơ sở dữ liệu Nr
Blast2GOđể dự đốn m
chức năng phân tử 
component) và quá trình sinh h
2000; Conesa và Gưtz, 2008)
GO cho các trình tự unigene, s
53 
Hình 2.4:Cách tính N50. 
ổng độ dài của các contig là: 200K + 140K + 110K 
ổ
ậy chỉ số N50 là 110K.
ải chức năng của unigene trong h
Penaeus monodon sau khi đư
ự thế hệ mới Illumina MiSeq được tìm ki
ở dữ liệu protein NCBI non-redundant (Nr
ố E-value là 1e-6). Bên cạnh đĩ c
-6) để ánh xạ trình tự unigene lên các cơ s
-Prot (Release 2015_06) và Clusters of 
(Tatusov và cs., 2001). Dữ liệu chú gi
-NCBI được trích xuất trực tiếp vào ph
ã thẻ chức năng Gene Ontology (GO) liên quan đ
(molecular function), thành phần tế 
ọc (biological process) (Ashburner
. Sau khi thu nhận được các mã th
ử dụng phần mềm WEGO để phân lo
ng độ dài các 
ệ gen phiên 
ợc lắp ráp de 
ếm tương 
-NCBI) 
ũng tiếp tục 
ở 
ải chức 
ần mềm 
ến 
bào (cellular 
 và cs., 
ẻ chức năng 
ại các mã 
 54 
thẻ GO cũng như hiểu được mơ hình phân bố của chức năng gen trong tơm sú 
(Ye và cs., 2006). Cuối cùng, sử dụng phần mềm chú giải tự động các con 
đường trao đổi chất KAAS trên ngân hàng KEGG (The Kyoto Encyclopedia 
of Genes and Genomes Automatic Annotation Server, 
 để thu được các bản 
đồ con đường trao đổi chất KEGG liên quan đến tơm sú (tham số sử dụng là 
BHH - bi-directional best hit) (Kanehisa và Goto, 2000). 
2.5.9. Phương pháp phân tích biểu hiện hệ gen phiên mã 
Sử dụng phần mềm RSEM (RNA-seq by expectation maximization) để tiến 
hành ước lượng số lượng unigene biểu hiện theo từng mơ (Li và Dewey, 2011). 
Trình tự đọc từ mỗi thư viện giải trình tự được ánh xạ ngược trở lại vào bộ dữ 
liệu unigene tinh sạch bằng script run_RSEM_align_n_estimate.pl với tham số 
mặc định, sau đĩ tính tốn điểm số biểu hiện cho mỗi thư viện giải trình tự bằng 
script merge_RSEM_frag_counts_single_table.pl. Bước cuối cùng, sử dụng câu 
lệnh run_DE_analysis.pl được tích hợp sẵn trong gĩi cơng cụ EdgeR và được 
thực thi trên mơi trường ngơn ngữ thống kê R để tiến hành phân tích biểu hiện 
khác biệt (Robinson và cs., 2010). Tham số độ tin cậy FDR (False discovery 
rate) được cài đặt là FDR ≤ 0,001 và giá trị tuyệt đối |log2(Độ sai khác)| ≥ 2 là 
những tham số được sử dụng để xác định mức độ biểu hiện giữa các thư viện 
trình tự đọc. Tồn bộ những câu lệnh và script được sử dụng ở trên đều được tích 
hợp trong bộ phần mềm Trinity (Haas và cs., 2013). 
2.5.10. Xác định các SNP trong ngân hàng unigene 
Kết quảphân tích dữ liệu giải mã và lắp ráp các đoạn trình tự đọc (reads) 
đã tạo ra được các đoạn liền kề (contigs). Nối các đoạn liền kề thì tạo ra được 
các unigene và hình thành ngân hàng unigene, bao gồm tất cả các unigene thu 
được sau khi lắp ráp. Đây chính là hệ gen phiên mã tham chiếu, rất cần thiết 
 55 
cho các phân tích tiếp theo vì tơm sú chưa cĩ hệ gen tham chiếu. Để cĩ thể 
tìm kiếm các SNP trong ngân hàng unigene, các trình tự đọc được ánh xạ 
ngược trở lại vào hệ gen phiên mã tham chiếu bằng phần mềm Bowtie2. Kết 
quả ánh xạ sẽ được 2 cơng cụ SAMtools và VarScan 
( (Koboldt và cs., 2013) xử lý để tìm ra các 
locus tiềm năng cĩ thể chứa nucleotide đã bị thay đổi (SNP). Để cĩ thể loại 
bỏ kết quả dương tính giả do lỗi giải trình tự hoặc mẫu nhiễm trình tự lạ, đãáp 
dụng các tham số sau: chỉ lấy những trình tự đọc cĩ chất lượng ánh xạ lớn 
hơn 20, tần số alen của biến dị phải lớn hơn 0,1 và độ sâu tối thiểu của alen 
biến dị phải lớn hơn 10. 
2.5.11. Xác định các microsatellite trong ngân hàng unigene 
Microsatellite hoặc SSR được xác định bằng cơng cụ MISA ngơn ngữ 
Perl ( (Beier và cs., 2017). Sử dụng cơng 
cụ MISA để tìm kiểm các đoạn lặp trong ngân hàng unigene đã thiết lập. Để 
cĩ thể tìm kiếm được các microsatellite, sử dụng phần mềm MISA, đặt mặc 
định để tìm kiếm các microsatellite đáp ứng các tiêu chí sau: Số lượng lặp nhỏ 
nhất là 6 đối với các lặp chứa 2 nucleotide (dinucleotide SSR); số lượng lặp 
nhỏ nhất là 5 đối với các lặp chứa 3 (trinucleotide SSR) hoặc 4 
nucleotide(tetranucleotide SSR) và số lượng lặp nhỏ nhất là 4 đối với các lặp 
chứa 5 (pentanucleotide SSR) hoặc 6 nucleotide (hexanucleotide SSR). Kích 
thước khác biệt lớn nhất trong microsatellite là 100 bp. 
2.5.12. Phát hiện SNP liên quan đến tính trạng tăng trưởng 
Để cĩ thể từng bước xây dựng được bộ SNP nhằm phát triển các SNP 
array sử dụng trong phân tích tính trạng tăng trưởng ở tơm sú bằng phương 
pháp “Nghiên cứu tương quan tồn bộ hệ gen” - Genome wide association 
study (GWAS), chúng tơi ràng lọc các SNP liên quan đến tính trạng tăng 
 56 
trưởng dựa trên 2 tiêu chí: i) sàng lọc các SNP chỉ nằm trên các unigene đã 
được chứng minh là liên quan tới tính trạng tăng trưởng ở các lồi giáp xác 
(Jung và cs., 2013); ii) sàng lọc các SNPchỉ cĩ ở tơm tăng trưởng nhanh. Đối 
với tiêu chí i), giải mã phân tích hệ gen phiên mã tơm tự nhiên, tiến hành Blast 
các trình tự unigene lên ngân hàng Nr-NCBI bằng phần mềm Blast2GO và 
phân tích thống kê với cơng cụ Microsoft Excel, dùng bộ lọc Filter và hàm 
VLOOKUP thống kê số lượng gen liên quan tới tính trạng tăng trưởng, các gen 
tăng trưởng chứa SNP, vị trí SNP trên hệ gen tham chiếu. Từ đây lọc ra những 
chỉ thị SNP liên quan tới tính trạng tăng trưởng ở lồi tơm sú. Đối với tiêu chí 
ii) giải mã phân tích hệ gen phiên mã tơm gia hĩa thế hệ G1 ở tơm lớn nhanh 
và tơm lớn chậm như đã tiến hành ở tơm tự nhiên, sàng lọc các SNP chỉ cĩ ở 
tơm lớn nhanh, gộp i) và ii) để được bộ SNP liên quan đến tính trạng tăng 
trưởng đến thế hệ G1. 
2.5.13. Phương pháp định lượng Real-time PCR (qPCR) 
RNA tổng số được tách chiết sử dụng Trizol. cDNA được tổng hợp bởi 
bộ sinh phẩm Superscript TM III First-Strand Synthesis System (Invitrogen, 
USA) theo hướng dẫn của nhà sản xuất. Phản ứng Real-time PCR được thực 
hiện với cặp mồi đặc hiệu đối với các unigene. Mức độ biểu hiện của gen đích 
trong mỗi mẫu thí nghiệm được tính tốn sử dụng phương pháp 2-ΔΔCt. 
Bảng 2.3: Cặp mồi sử dụng cho qPCR 
Annotation Sequence_ID Primer Sequence 
Myosin-
heavy chain 
comp123891_c2_seq2 
Forward 
Reverse 
5'- GTGTCCTACAACCTGACTGG -3' 
5’- TCCCTTTCCTTTGCCACCAC-3’ 
Ecdysteroid comp93369_c1_seq1 
Forward 
Reverse 
5’- CTCCACACCTTAGACAGACC -3’ 
5’- GGAGGTCTACGTGCTAAAGG -3’ 
Cathepsin L comp123524_c1_seq2 
Forward 
Reverse 
5’- AGCAGTGGTCGTCATGGTAC -3’ 
5'- GGACGGTAAGTGTCGCTTCG-3' 
Alpha-
amylase 
comp200235_c1_seq1 
Forward 
Reverse 
5’- CGTCCGACAGATCACAGTTTGG-3’ 
5’- GGATCTGAAGGAGACGCTGC-3’ 
 57 
CHƯƠNG III. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 
3.1. XÂY DỰNG BỘ CƠ SỞ DỮ LIỆU HỆ GEN PHIÊN MÃ 
(TRANSCRIPTOME) TƠM SÚ (PENAEUS MONODON) 
3.1.1. Sàng lọc mẫu tơm sạch bệnh 
Để chuẩn bị cho việc giải trình tự hệ phiên mã tơm sú Penaeus monodon, 
các mẫu tơm đều được xác định đảm bảo khơng nhiễm các bệnh thường gặp ở 
tơm, để đánh giá mức độ biểu hiện thực của các gen, nhằm sàng lọc được các 
gen mang tính trạng tốt như tăng trưởng nhanh, sức sinh sản cao, kháng 
bệnhTheo cơng bố của tổ chức sức khỏe động vật thế giới (World 
Organisation for Animal Health – OIE), bệnh đốm trắng (White spot 
syndrome virus - WSSV), bệnh cịi (Monodon baculovirus - MBV), bệnh đầu 
vàng (Yellow head virus - YHV), bệnh hoại tử cơ quan tạo máu và cơ quan 
lập biểu mơ (Infectious hypothermal and hemotopoietic necrosis - IHHNV) và 
bệnh Taura (Taura syndrome virus - TSV) là các bệnh chủ yếu trên tơm, trong 
đĩ bệnh đốm trắng (WSSV) và bệnh cịi (MBV) là 2 bệnh thường gặp nhất, 
và gây thiệt hại lớn đối với ngành nuơi tơm. Trong khuơn khổ luận án và nội 
dung thực hiện đề tài “Lập bản đồ bộ gen tơm sú (P. monodon)”, mã số 
NVQG-2011/24 do PGS.TS. Đinh Duy Kháng làm chủ nhiệm,đã thiết kế cặp 
mồi đặc hiệu để chẩn đốn WSSV và MBV bằng phương pháp PCR thơng 
qua việc đánh giá mức độ nhiễm WSSV và MBV trên các mẫu tơm sú thu 
nhận từ một số tỉnh miền Bắc Việt Nam (Quảng Ninh, Hải Phịng và Nam 
Định). Với 24/143 mẫu dương tính MBV và 35/143 mẫu dương tính với 
WSSV, đề tài đã tiến hành giải trình tự sản phẩm PCR và so sánh trong 
GenBank sử dụng phần mềm Blast của NCBI. Kết quả cho thấy đoạn gen 
được khuếch đại trong phản ứng Nested-PCR phát hiện WSSV cĩ độ tương 
 58 
đồng 99,5% so với trình tự nucleotide đoạn gen đặc trưng của WSSV với các 
số đăng ký (ACCESSION): KF981443, AF332093, KJ773998, KJ719075, 
KJ719075,KF032716, JX564899, AY850066 v.v... Trong số 641 nucleotide 
của đoạn gen khuếch đại, chỉ cĩ 3 nucleotide sai khác ở các vị trí G544A, 
T621C và T629C. Đoạn gen khuếch đại được xác định thuộc gen mã hĩa 
WSSV419-like protein (WSSV419-like protein gene). Tương tự như vậy, 
đoạn gen khuếch đại MBV cĩ độ tương đồng đạt 99,7% so với trình tự 
nucleotide đoạn gen đặc trưng MBV với các số đăng ký (ACCESSION): 
EU251062, KJ184318, JQ751059, JX091340, JN604546 v.v. Trong số 688 
nucleotide của đoạn khuếch đại, chỉ cĩ 2 nucleotide sau khác ở vị trí G70A và 
T160C. Đoạn gen khuếch đại được xác định thuộc gen mã hĩa polyherin của 
MBV (MBV polyherin gene). Như vậy, cặp mồi thiết kế để phát hiện WSSV 
và MBV cĩ tính đặc hiệu cao.Các mẫu tơm được kiểm tra sạch bệnh cho 
nghiên cứu xây dựng ngân hàng transcriptome. Kết quả cho thấy, cả 30 con 
tơm sú được thu thập tại vùng biển Việt Nam đều khơng mang các bệnh trên, 
đảm bảo sạch cho các nghiên cứu tiếp theo. 
3.1.2. Chuẩn bị thư viện cDNA 
Mẫu tơm sú sau khi thu thập tại vùng biển Việt Nam được kiểm tra một 
số mầm bệnh đối MBV, WSSV, IHHNV, YHV và TSV bằng kỹ thuật PCR. 
Với mục tiêu là sàng lọc được các gen giả định (unigene) và các SNP liên 
quan đến tính trạng tăng trưởng ở tơm sú, các gen cĩ thể được biểu hiện ở các 
cơ quan khác nhau, trong đĩ thường được biểu hiện ở mơ cơ và mơ gan tụy 
(Jung và cs., 2013). Vì vậy, nghiên cứu này tập trungtrên 4 mơ tim, mơ cơ, 
mơ gan tụy và mơ gốc mắt để cĩ thể thu được kết quả phong phú, xây dựng 
cơ sở dữ liệu transcriptome tơm sú tham chiếu cho các nghiên cứu khác.Các 
mơ trên được tiến hành tách chiết RNA tổng số sử dụng Trizol 
(Thermoscientific, Mỹ) và tinh sạch RNA thơng tin (mRNA – Messenger 
 RNA) với bộ sinh ph
(Thermoscientific) như tr
RNA thơng tinướ
vậy, chất lượng của RNA t
quyết định tồn bộ các thí nghi
xác định nồng độ và ch
nồng độ và độ tinh sạch c
RNA HS Assay kit (Thermoscienti
quả chính xác hơn và (3) h
nguyên vẹn của RNA qua hình 
Theo khuyến cáo của Illumina Inc., RNA t
µg, thấy rõ 2 phổ của 18S và 28S trên k
thước tương ứng là 4,5 kb và 1,9 kb (
Hình 3.1: Minh họ
Bioanalyzer(https://support.illumina.com/sequencing/seq
rna_sample_prep_kit_v2/input_req.html
59 
ẩm Dynabeads mRNA purification kit 
ình bày trong phần phương pháp nghiên c
c tính chiếm khoảng 1 - 5% trong RNA t
ổng số được tách chiết là yếu tố r
ệm tiếp theo. RNA tổng số sau tách chi
ất lượng qua 3 thiết bị (1) NanoDrop: cho bi
ủa RNA, (2) Quibit: sử dụng bộ sinh ph
fic – Mỹ) xác định nồng độ 
ệ thống điện di mao quản Bioanalyzer: th
ảnh và chỉ số RIN (RNA Integrity number).
ổng số cần cĩ nồng đ
ết quả đo bằng Bioanalyzerv
Hình 3.1), chỉ số RIN ≥ 7.
a chất lượng của RNA trên kết qu
uencing_kits/truseq_
) 
ứu. 
ổng số. Vì 
ất quan trọng, 
ết được 
ết kết quả 
ẩm Quibit 
RNA, cho kết 
ể hiện độ 
ộ từ 0,1 – 4 
ới kích 
ả đo bằng 
 60 
Trong quá trình thực hiện, nghiên cứu đã cố gắng thực hiện theo khuyến 
cáo của Illumina, cũng như Macrogen – một trong những cơng ty hàng đầu về 
giải trình tự gen thế hệ mới Illumina, các mơ được tách chiết với qui trình cẩn 
thận, nghiêm ngặt, hạn chế sự đứt gãy và phân hủy RNA (do nhiễm Rnase). 
Tuy nhiên, khơng như mong muốn, chỉ số RIN thấp, cĩ những mẫu là khơng 
xác định (RIN=N/A) (Hình 3.2), đặc biệt kết quả thấp nhất là ở mơ gan tụy, 
điều này cĩ thể do mơ gan tụy dễ bị phân hủy hơn các mơ khác. 
Hình 3.2: Mẫu RNA khơng thể hiện