Luận án Nghiên cứu khả năng loại màu thuốc nhuộm hoạt tính và phân hủy chất diệt cỏ/dioxin của vi sinh vật sinh enzyme laccase

hiên để làm rõ thêm các kết quả phân loại truyền 
thống, việc xác định và so sánh sự tương đồng giữa trình tự vùng ITS1-5,8S-ITS2 
của chủng này và các chủng đại diện trên GenBank đã được tiến hành và đã được 
đăng ký trình tự trên GenBank với mã số MG243365. Trên cơ sở đặc điểm mẫu, 
hình thái khuẩn lạc, bào tử và trình tự vùng ITS1-5,8S-ITS2 chủng nấm FBV40 được 
xét vào chi Rigidoporus và được định danh là Rigidoporus sp. FBV40. Từ vị trí của 
chủng FBV40 trên cây phát sinh chủng loại cho thấy chủng này gần gũi nhất với chi 
Rigidoporus cụ thể là tương đồng đến 99% với các chủng là R. Vinctus C1-9 được 
phân lập từ rặng san hô của vùng biển Phúc Kiến và R. Vinctus FRIM 142 được phân 
lập từ rừng nhiệt đới ở Malaysia ( Hiện có rất ít thông 
tin về những chủng nấm trên, đặc biệt thông tin về đặc điểm hình thái cũng như khả 
năng sinh tổng hợp laccase của các chủng nấm trên. 
Hình 3.2. Cây phát sinh chủng loại của chủng nấm FBV40 
3.1.2. Phân lập và phân loại xạ khuẩn 
3.1.2.1. Phân lập xạ khuẩn 
 Từ nguồn đất ở 2 khu vực đã mô tả trong phần vật liệu và phương pháp nghiên 
cứu, 8 chủng xạ khuẩn đã được phân lập trong đó có 2 chủng là XKBHN1, XKBHN2 
từ đất khu vực Tây - Nam và 6 chủng là XKBiR1, XKBiR2, XKBiR3, XKBiR4, 
61 
XKBiR929 và XKBiR930 từ đất nguyên thủy (trước khi xử lý khu vực Z1) ô nhiễm 
chất diệt cỏ chứa dioxin tại sân bay Biên Hòa. Các chủng này có dạng khuẩn lạc tròn, 
bông mịn, khác nhau chủ yếu ở màu sắc và sắc tố giọt tiết tạo ra. Đây là những nguyên 
liệu đầu vào để tiếp tục nghiên cứu khả năng sinh tổng hợp laccase-like và từ đó lựa 
chọn các chủng có hoạt tính cao để tiếp tục nghiên cứu. Hai chủng XKBHN1 và 
XKBiR929 là đại diện 2 khu vực của sân bay Biên Hòa đã được chọn để phân loại bởi 
chúng có khả năng sinh tổng hợp laccase-like nằm trong khoảng khá rộng và hoạt tính 
cao nhất lần lượt là 200 và 720 U/L (Bảng 3.2). 
Bảng 3.2. Hoạt tính laccase-like của các chủng xạ khuẩn 
STT Chủng Nguồn phân lập Hoạt tính (U/L) 
1 XKBHN1 Đất khu vực ô nhiễm Tây-Nam 
sân bay Biên Hòa 
200 
2 XKBHN2 - 
3 XKBiR1 
Đất khu vực ô nhiễm Z1 sân bay 
Biên Hòa 
7,15 
4 XKBiR2 0,97 
5 XKBiR3 - 
6 XKBiR4 1,18 
7 XKBiR929 720 
8 XKBiR930 606 
 Chú thích: (-) không xác định được 
3.1.2.2. Phân loại chủng xạ khuẩn XKBHN1 và XKBiR929 
 Hai chủng xạ khuẩn được nuôi cấy và sau 4 ngày trên môi trường muối 
khoáng Gause M chứa DCĐ (môi trường có màu vàng nhạt), các đặc điểm hình thái, 
khuẩn lạc và hình thái bào tử của chúng được trình bày ở Bảng 3.3 và Hình 3.3. 
Bảng 3.3. Đặc điểm hình thái khuẩn lạc của hai chủng xạ khuẩn XKBHN1 
và XKBiR929 
Đặc điểm Chủng XKBHN1 Chủng XKBiR929 
Hình thái 
Bề mặt bông xốp, khuẩn lạc 
đều nhô cao, nhăn ở tâm, khuẩn 
ty khí sinh phát triển tốt, 
Bề mặt bông xốp, khuẩn lạc 
đều nhô cao, nhăn ở tâm, khuẩn 
ty khí sinh phát triển tốt 
Kích thước Đường kính khuẩn lạc 4-5 mm Đường kính khuẩn lạc 3-4 mm 
Màu sắc 
Khuẩn ty khí sinh có màu hồng 
nhạt, khuẩn ty cơ chất có màu 
cam nâu nhạt 
Khuẩn ty khí sinh có màu nâu, 
khuẩn ty cơ chất không có màu. 
Bào tử 
Bào tử trần, hình trứng kết dính 
với nhau tạo thành các chuỗi 
dạng xoắn móc đường kính 0,6 
- 0,9 µm 
Bào tử hình trứng, có gai, kết 
dính với nhau tạo thành hình 
xoắn móc, đường kính 1 đến 
1,16 µm 
 Hình thái khuẩn lạc và hình thái bào tử của 2 chủng nghiên cứu cho thấy 
chúng hoàn toàn khác nhau. Giải trình tự gene mã hóa 16S rRNA đã được tiến hành. 
62 
Trên cơ sở đó, cây phát sinh chủng loại của XKBHN1 và XKBiR929 đã được xây 
dựng (Hình 3.5). Từ vị trí của 2 chủng trên cây phát sinh chủng loại cho thấy chúng 
không gần gũi nhau về mặt di truyền. Khi so sánh trình tự đoạn gene mã hóa 16S 
rRNA của XKBHN1 và XKBiR929 cho thấy chúng không có quan hệ gần gũi nhau 
với trình tự gene 16S rRNA của chúng có độ tương đồng là 98%. Dựa trên các đặc 
điểm hình thái khuẩn lạc, bào tử và so sánh trình tự đoạn gene mã hóa 16S rRNA, 
chủng XKBHN1, XKBiR929 được xếp vào chi Streptomyces và được định danh 
Streptomyces sp. XKBHN1 và Streptomyces sp. XKBiR929. 
(A) 
(B) 
(C) 
(D) 
Hình 3.3. Hình thái khuẩn lạc và cuống sinh bào tử chủng XKBHN1 (A, C) và 
chủng XKBiR929 (B, D) 
 Trình tự đoạn gene 16S rRNA của chủng XKBHN1 và chủng XKBiR929 được 
so sánh với các trình tự gene tương ứng của các vi sinh vật nhân sơ đã được công bố trên 
GenBank. Chủng xạ khuẩn XKBHN1 tương đồng 99% với Streptomyces coelicoflavus 
AHI2, S. diastaticus BKH2, S. fradiae S81 và tương đồng trên 94% với nhiều đại diện 
khác thuộc chi Streptomyces. Hiện chưa có nhiều thông tin nghiên cứu công bố về nguồn 
gốc cũng như đặc điểm sinh học của các chủng trên. 
 Chủng xạ khuẩn XKBiR929 có mức độ tương đồng 99% với loài xạ khuẩn S. 
albogriseolus NBE40, đây là chủng được phân lập từ đất ô nhiễm của khu vực nhà 
63 
máy sản xuất giấy ở Ấn Độ [153]. Tương đồng 99% với chủng S. albogriseolus 
NRRL B-1305T được phân lập từ trong đất và chủng này có khả năng sinh tổng hợp 
enzym cellulase, 97% với chủng xạ khuẩn S. sp. C39 được phân lập từ đất ô nhiễm 
các thuốc trừ sâu ở Argentina và chủng có khả năng sinh trưởng và phát triển trên 
môi trường chứa lindan và methoxychlor, 97% với chủng S. albogriseolus GhS-A9-1 
chủng này được phân lập từ trầm tích rừng ngập mặn ở Hải Nam, Trung Quốc chủng 
này có khả năng sinh hoạt tính để giết các loại giun sán có hại và 97% tương đồng với 
chủng S. albogriseolus NBE40 hiện nay chủng này chưa có nhiều thông tin về nguồn 
gốc phân lập cũng như đặc tính sinh học của các chủng đã đề cập ở trên. 
Hình 3.4. Cây phát sinh chủng loại 2 chủng XKBHN1 và XKBiR929 
 Chi Streptomyces là chi chiếm số lượng lớn trong đất và có vai trò quan 
trọng đối với hệ sinh thái đất. Một số chủng thuộc chi Streptomyces có khả năng 
sinh laccase-like đồng thời có khả năng sinh trưởng trên các môi trường chứa chất 
diệt cỏ/dioxin. Chủng Streptomyces sp. XKDN12 đã được Nguyễn Bá Hữu và cộng 
sự nghiên cứu từ mẫu đất ô nhiễm chất diệt cỏ/dioxin ở Đà Nẵng. Chủng này có khả 
năng sinh laccase-like và có khả năng sinh trưởng tốt trên môi trường chứa các chất 
đa vòng thơm sau 7 ngày nuôi cấy và phân hủy được 32,72% phenanthrane, 39,01% 
antharacen [103]. Một số chủng Streptomyces khác như Streptomyces sp. XKBH1, 
Streptomyces sp. XKBH13, Streptomyces sp.XKDN12 đều được phân lập tại các 
khu vực bị ô nhiễm chất diệt cỏ/dioxin tại sân bay Biên Hoà và Đà Nẵng cũng có 
khả năng sinh tổng hợp laccase-like [105]. Như vậy, chủng XKBHN1, XKBiR929 
64 
phân lập được trong nghiên cứu này từ mẫu đất ô nhiễm chất diệt cỏ/dioxin tại khu 
vực ô nhiễm mới được phát hiện và đất đã được khử độc của sân bay Biên Hòa lại 
càng khẳng định các chủng xạ khuẩn thuộc chi Streptomyces có khả năng phân bố 
rộng và chúng có thể tham gia vào quá trình phân hủy và chuyển hóa các chất diệt 
cỏ/dioxin cũng như các hợp chất đa vòng thơm khác. Ngoài ra, những chủng này 
còn có khả năng sinh laccase-like trong đất ô nhiễm nặng chất diệt cỏ /dioxin là đặc 
tính mang nhiều ý nghĩa ứng dụng trong phân hủy sinh học. Kết quả nghiên cứu 
một lần nữa xác định sự phân bố của các nhóm vi sinh vật ở lô xử lý khử độc đất ô 
nhiễm chất diệt cỏ/dioxin tại sân bay Biên Hòa, xạ khuẩn vẫn luôn có mặt ở hầu hết 
các mẫu trên toàn bộ diện tích khu vực xử lý. Theo các nghiên cứu của Đặng Thị 
Cẩm Hà và cộng sự cho thấy laccase-like được tổng hợp không phải là protein vì 
sau khi đun sôi dịch sau nuôi cấy các chủng xạ khuẩn vài giờ thì nó vẫn có thể loại 
bỏ được gần 60% hydrocacbon đa vòng thơm. Đây có thể là chất trao đổi có khả 
năng tham gia phản ứng oxy hóa vòng thơm. Chính vì vậy, cần rất nhiều nghiên cứu 
chi tiết về phát hiện lý thú này. Tóm lại đây là một trong các lợi thế mà các nhà 
nghiên cứu khoa học có thể khai thác để xử lý chất ô nhiễm đa vòng thơm. Trong 
nghiên cứu này sẽ tiếp tục tìm hiểu về phát hiện lý thú đã đề cập trên. 
3.1.3. Môi trường thích hợp để chủng nấm, chủng xạ khuẩn sinh tổng hợp 
laccase, laccase-like 
3.1.3.1. Môi trường thích hợp để chủng nấm FBV40 sinh tổng hợp laccase 
 Môi trường nuôi cấy vi sinh vật có vai trò quan trọng để các chủng VSV có thể sinh tổng 
hợp các loại enzyme khác nhau, đặc biệt là các chủng nấm. Để có môi trường thích hợp để nấm 
đảm FBV40 sinh tổng hợp laccase cao nhất, nghiên cứu khảo sát khả năng sinh tổng hợp trên 
các loại môi trường nuôi cấy nấm phổ biến được sử dụng tại phòng thí nghiệm Công nghệ sinh 
học tái tạo môi trường/Viện công nghệ sinh học, các chủng được nuôi cấy ở điều kiện nuôi lắc 
120 vòng/phút, nhiệt độ 300C. Kết quả được thể hiện ở Hình 3.5. Môi trường để chủng nấm 
FBV40 sinh tổng hợp hoạt tính laccase cao nhất là TSH1, sau 8 ngày hoạt tính laccase đạt được 
là 107.708 U/L, hoạt tính trên môi trường PDB bổ sung 1% bột đậu tương là 41.431 U/L sau 6 
ngày nuôi cấy, còn trên môi trường PDB hoạt tính là 6.134 U/L sau 9 ngày và hoạt tính thấp nhất 
trên môi trường Czapeck chỉ xác định được trên 5 U/L. Như vậy, số liệu thu được cho thấy môi 
trường TSH1 là phù hợp nhất để chủng nấm FBV40 sinh tổng hợp laccase cao và được lựa chọn 
làm môi trường nuôi cấy để tiếp tục các nội dung nghiên cứu khác. 
65 
Hình 3.5. Hoạt tính laccase thô chủng FBV40 ở các môi trường nuôi cấy 
 Theo nghiên cứu của Praveen và cộng sự chỉ ra rằng laccase cao không phụ 
thuộc vào sinh khối của chủng nấm. Nhưng sản phẩm laccase được chứng minh có 
liên quan mật thiết với điều kiện và môi trường nuôi cấy, sinh khối cao không hẳn 
sẽ cho hoạt tính laccase cao [122]. Buswell và cộng sự đã chỉ ra rằng sản phẩm 
laccase bị ảnh hưởng lớn bởi hàm lượng dinh dưỡng, đặc biệt là các yếu tố vi lượng 
và hàm lượng nitơ trong môi trường nuôi cấy. Nhìn chung laccase được tạo ra với 
hoạt tính thấp, muốn nâng cao hoạt tính chỉ bằng cách bổ sung các chất cảm ứng, hệ 
chất gắn kết và quan trong là chọn được các yếu tố dinh dưỡng, pH, nhiệt độ, thời 
gian nuôi cấy phù hợp cho chủng sinh trưởng [11]. 
 Như vậy, kết quả khảo sát điều kiện môi trường nuôi cấy sinh tổng hợp 
laccase đối với chủng nấm FBV40 một lần nữa khẳng định vai trò của các thành phần 
môi trường có ảnh hưởng rất lớn tới khả năng sinh tổng hợp laccase. Trên cơ sở đó đã 
xác định được môi trường TSH1 từ 7 môi trường đã khảo sát với điều kiện nuôi cấy 
pH là 6,5, nhiệt độ 30oC, lắc liên túc 120 vòng/phút khi đó chủng FBV40 sinh tổng 
hợp laccase thô có hoạt tính rất cao là 107.708 U/L sau 8 ngày nuôi cấy, với giá trị 
này, hoạt tính laccase của chủng FBV40 được xếp vào hạng rất cao. Sản phẩm 
laccase được thu và bảo quản lạnh ở 40C để phục vụ cho các nghiên cứu tiếp theo. 
3.1.3.2. Khả năng sinh tổng hợp laccase-like của XKBHN1 và XKBiR929 trên môi 
trường chứa các chất hữu cơ clo khác nhau 
 Ngoài nguồn nấm đảm đã được phân lập từ rừng Quốc gia Ba Vì và các vùng 
lân cận thì nguồn xạ khuẩn sinh laccase-like từ chính nơi đất ô nhiễm nặng chất diệt 
0
20000
40000
60000
80000
100000
120000
2ngày 3ngày 4ngày 5ngày 6ngày 7ngày 8 ngày 9ngày 10ngày
H
o
ạt
 t
ín
h
 (
U
/l
)
Thời gian 
PDB
Czapeck
Dịch KT
MEG
Vis
TSH1
PDB-1%BDT
66 
cỏ/dioxin, đất đang được xử lý khử độc bằng công nghệ phân hủy sinh học tại sân bay 
Biên Hòa cũng đã được chọn. Sau 7 ngày nuôi cấy ở nhiệt độ 30ºC, lắc với tốc độ 
120 vòng/phút, 2 chủng XKBHN1 và XKBiR929 đều có khả năng sinh trưởng mạnh 
trên môi trường Gauss M chứa các chất ô nhiễm DCĐ, 2,4,5-T; 2,4-D; DBF và 
PAHs. Kết quả được thể hiện ở Hình 3.6. 
 Cả hai chủng XKBHN1 và XKBiR929 đều có khả năng sinh trưởng và sinh 
tổng hợp laccase-like trên môi trường Gause M có chứa từ 4% đến 16% theo thể tích 
DCĐ. Hoạt tính laccase-like cao nhất tạo ra bởi XKBHN1 là 420 U/l ở ngày thứ 3 với 
thể tích DCĐ bổ sung là 8%, còn ở thể tích DCĐ là 4% thì hoạt tính laccase-like là 384 
U/l và giảm dần ở thể tích DCĐ bổ sung là 12% và 16%. 
 Chủng XKBiR929 sinh tổng hợp laccase-like với hoạt tính cao nhất là 803 U/l ở 
ngày thứ 13 với thể tích DCĐ là 8% và cũng giảm dần ở các tỷ lệ bổ sung là 12 và 16% 
trong môi trường nuôi cấy. Sau 4 ngày nuôi cấy, XKBHN1 sinh tổng hợp laccase-
like với hoạt tính cao đạt 227 U/l với 100 ppm 2,4,5-T trong môi trường nuôi cấy. 
Hoạt tính laccase-like giảm dần khi nồng độ 2,4,5-T tăng từ 200 đến 400 ppm. Tuy 
nhiên, chủng XKBiR929 sinh tổng hợp laccase-like với hoạt tính cao nhất là 803 
U/l ở nồng độ 200 ppm 2,4,5-T sau 13 ngày nuôi cấy và cao gấp gần 4 lần chủng 
XKBHN1, đặc biệt là hoạt tính cũng giảm dần khi nồng độ 2,4,5-T tăng dần. Chủng 
XKBHN1 sinh tổng hợp laccase-like với hoạt tính cao nhất là 231 U/l sau 3 ngày 
trong khi chủng XKBiR929 lại có hoạt tính cao nhất là 566 U/l sau 13 ngày nuôi 
cấy ở 100 ppm và 200 ppm 2,4-D trong môi trường. Hoạt tính laccase-like giảm dần 
theo thời gian khi nồng độ 2,4-D là 300 và 400 ppm. Trên môi trường Gauss M 
chứa DBF, hoạt tính laccase-like do XKBHN1 và XKBiR929 sinh tổng hợp cao 
nhất lần lượt là 398 U/l và 814 U/l ở nồng độ tương ứng là 300 ppm và 200 ppm với 
thời gian nuôi cấy là 5 và 15 ngày. Trên môi trường Gauss M chứa 200 ppm PAHs, 
hoạt tính laccase-like cao nhất thu được đối với XKBiR929 là 867 U/l sau 15 ngày nuôi 
cấy, trong khi XKBHN1 sinh tổng hợp laccase-like với hoạt tính cao nhất là 379U/l 
sau 5 ngày nuôi cấy. 
67 
Hình 3.6. Khả năng sinh tổng hợp laccase-like theo thời gian, của chủng XKBHN1 
trên môi trường chứa DCĐ (A); DBF (B); 2,4,5-T (C); 2,4-D (D); PAHs (E) và của 
chủng XKBiR929 trên môi trường chứa DCĐ (F); DBF (G); 2,4,5-T (H); 2,4-D (I); 
PAHs (K) 
0
50
100
150
200
250
300
350
400
450
1 2 3 4 5 6 7
H
o
ạt
 t
ín
h
 (
U
/l
)
Thời gian (ngày)
(A) 4%
8%
12%
16%
0
100
200
300
400
500
600
700
800
900
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16
H
o
ạt
 t
ín
h
 (
U
/l
)
Thời gian (ngày)
(F)
4%
8%
12%l
16%l
0
50
100
150
200
250
300
350
400
450
1 2 3 4 5 6 7
H
o
ạt
 t
ín
h
 (
U
/l
)
Thời gian(ngày)
(B)
100 ppm
200 ppm
300 ppm
400 ppm
0
100
200
300
400
500
600
700
800
900
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16
H
o
ạt
 t
ín
h
 (
U
/l
)
Thời gian (ngày)
(G)100 ppm
200 ppm
300 ppm
400 ppm
0
50
100
150
200
250
1 2 3 4 5 6 7
H
o
ạt
 t
ín
h
 (
U
/l
)
Thời gian (ngày)
(C)
100 ppm
200 ppm
300 ppm
400 ppm
0
100
200
300
400
500
600
700
800
900
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16
H
o
ạt
 t
ín
h
 (
U
/l
)
Thời gian (ngày)
(H)
100 ppm
200 ppm
300 ppm
400 ppm
0
50
100
150
200
250
1 2 3 4 5 6 7
H
o
ạt
 t
ín
h
 (
U
/l
)
Thời gian (ngày)
(D)
100 ppm 200 ppm
300 ppm 400 ppm
0
100
200
300
400
500
600
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16
H
o
ạt
 t
ín
h
 (
U
/l
)
Thời gian (ngày)
(I)100 ppm
200 ppm
300 ppm
400 ppm
0
50
100
150
200
250
300
350
400
1 2 3 4 5 6 7
H
o
ạt
 t
ín
h
 (
U
/l
)
Thời gian (ngày)
(E)
100 ppm
200 ppm
300 ppm
400 ppm
0
100
200
300
400
500
600
700
800
900
1000
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16
H
o
ạt
 t
ín
h
 (
U
/l
)
Thời gian (ngày)
(K)
100 ppm
200 ppm
300 ppm
400 ppm
68 
 Theo nghiên cứu nghiên cứu trước đây chủng xạ khuẩn XKDNR1 được phân lập 
từ biorector xử lý chất diệt cỏ/dioxin trong đất tại "điểm nóng" Đà Nẵng nuôi cấy trên môi 
trường có DCĐ, hoạt tính laccase-like cao nhất là 21,53 U/l sau 4 ngày nuôi cấy [103]. 
 Như vậy có thể thấy rằng cả 2 chủng XKBHN1 và XKBiR929 đều có khả năng 
sinh tổng hợp laccase-like với hoạt tính khá cao, tuy nhiên cần phải tiếp tục khảo sát các 
điều kiện nuôi cấy phù hợp như nhiệt độ, chất cảm ứng, pH và các nguồn cơ chất bổ 
sung khác v.v để thu được laccase-like với hoạt tính được nâng cao hơn. Bên cạnh đó, 
nghiên cứu khả năng ứng dụng các chủng xạ khuẩn này trong phân hủy, chuyển hóa các 
chất ô nhiễm hữu cơ chứa clo trong môi trường cũng cần được tiếp tục quan tâm. 
 Nhận xét: 
 Cho đến nay, chưa có nhiều nghiên cứu đề cập đến khả năng sinh tổng hợp 
laccase-like, cũng như khả năng xúc tác phân hủy chuyển hóa của laccase-like từ 
các đại diện thuộc vi khuẩn, xạ khuẩn và đặc biệt là đại diện thuộc chi Streptomyces 
trong môi trường chứa các hợp chất ô nhiễm vòng thơm, quan trọng hơn cả là các 
chất diệt cỏ/dioxin như đã được sử dụng trong nghiên cứu này. bên cạnh đó, nghiên 
cứu tinh sạch và tìm hiểu đặc tính của laccase-like mà các chủng xạ khuẩn phân lập 
được từ khu vực ô nhiễm nặng chất diệt cỏ/dioxin sinh tổng hợp được là một đối 
tượng nghiên cứu mới của luận án này. Chính vì vậy, nghiên cứu tiếp theo của luận 
án sẽ tập trung vào đánh giá khả năng tinh sạch và tìm hiểu đặc tính hóa-lý của hoạt 
chất sinh học này với các nội dung như laccase-like có khả năng tinh sạch không? 
nó có bản chất protein? Các đặc tính riêng khác lần lượt cũng sẽ được làm rõ ở các 
phần sau. Để dễ theo dõi NCS vẫn sẽ sử dụng các danh từ chung cho enzyme để thể 
hiện các nghiên cứu thuộc nội dung nghiên cứu đã được đề cập trên. 
3.2. Đặc tính hóa - lý, hóa - sinh của laccase và laccase-like tinh sạch 
3.2.1. Tinh sạch laccase của nấm đảm Rigidoporus sp. FBV40 
 Laccase thô sau khi lọc qua màng tiếp tuyến 10 kDa đã tăng hoạt tính gấp 4,7 
lần và hoạt tính protein riêng đo được là 40,6 U/mg đạt hiệu suất 98,8%. Sau khi qua 
cột sắc ký lọc gel hoạt tính enzyme tiếp tục tăng lên 5,6 lần và hoạt tính protein riêng là 
218 U/mg với hiệu suất 40,8%. Hoạt tính laccase và hàm lượng protein của mỗi phân 
đoạn khi qua cột sắc ký lọc gel và sắc ký trao đổi ion đều được xác định sau mỗi phân 
đoạn (Hình 3.7). Phân đoạn sau quá trình sắc ký lọc gel có hoạt tính cao nhất tiếp tục 
đưa qua cột sắc ký trao đổi ion Hitrap QHP. Kết quả, ở nồng độ 0,15 M NaCl, protein 
69 
thu được có hoạt độ riêng là 1.016 U/mg gấp 25 lần so với protein laccase thô ban đầu, 
hiệu suất đạt 32,3%. 
Hình 3.7. Hoạt tính laccase tinh sạch của chủng FBV40, qua cột sắc ký lọc gel 
Sephadex G75 (A) và qua cột trao đổi ion trên hệ thống Hitrap QHP (B). 
 Trọng lượng phân tử và độ tinh sạch của laccase đã được xác định bằng điện 
di trên gel 12,5% polyacrylamide (SDS-PAGE). Từ ảnh điện di đồ cho ta thấy 
enzyme được tinh sạch có chất lượng tốt, hình thành các băng đơn đồng nhất và có 
hai băng protein thu được với kích thước 55 kDa và 60 kDa và gọi là isozyme Lac1 
và isozyme Lac2. 
 Hiện nay, có rất ít công bố về số lượng isozyme laccase của các chủng nấm 
thuộc chi Rigidoporus. Khi tinh sạch laccase chủng Rigidoporus microporus BCRC 
35318 chỉ thu được 1 băng chính với trọng lượng phân tử là 55 kDa [121]. Khi 
nghiên cứu về laccase ổn định nhiệt chủng Sporothrix carnis CPF-05 khi đã qua 
tinh sạch bằng sắc ký ion và sắc ký lọc gel, chỉ xác định được 1 băng trên gel với 
trọng lượng phân tử là 56kDa [45]. 
 Như vậy, khối lượng của hai isozyme laccase của chủng nấm thu được là 
phù hợp với khoảng khối lượng đã được công bố về laccase và kết quả nghiên cứu 
0
10000
20000
30000
40000
50000
60000
70000
80000
90000
100000
0.00
50.00
100.00
150.00
200.00
250.00
300.00
350.00
400.00
450.00
0 10 20 30 40
H
o
ạt
 t
ín
h
 (
U
/L
)
H
àm
 l
ư
ợ
n
g
 p
ro
te
in
 (
µ
g
/m
l)
Phân đoạn
protein(µg/ml) Laccase (U/L)
0.00
20.00
40.00
60.00
80.00
100.00
120.00
140.00
160.00
0
20000
40000
60000
80000
100000
120000
140000
160000
0 5 10 15 20 25 30 35
H
àm
 l
ư
ợ
n
g
 p
ro
te
in
 (
µ
g
/m
l)
H
o
ạt
 t
ín
h
 (
U
/L
)
Phân đoạn
(B)
Laccase (U/L) protein(µg/ml)
L1 L2 L3 L4 M 
Hình 3.8. Diện di protein chủng FBV40. Land 
1: laccase thô, Land 2: laccase đã qua cột lọc 
gel Sepadex G75; Land 3, Land 4 enzyme tinh 
sạch sau khi qua cột trao đổi ion, M: thang 
protein chuẩn. 
70 
của luận án đã bổ sung thêm thông tin vào bộ sưu tập isozyme laccase của chủng 
nấm thuộc chi Rigidoporus. 
3.2.2. Tinh sạch laccase-like từ xạ khuẩn Streptomycese sp. XKBiR929 
 Laccase-like là một hoạt chất sinh học đã được mô tả ở một số nghiên cứu 
trước