Luận án Nghiên cứu khả năng sinh trưởng và tích lũy Oleanolic acid của tế bào đinh lăng (polyscias fruticosa (l.) harms) nuôi cấy in vitro

chất được xác định với sự tổng hợp tương đối ổn định trong 
quá trình nuôi cấy tế bào và không thể đạt được bằng sản xuất từ cây trồng tự 
nhiên [56]. 
Tại Việt Nam, Phạm Văn Lộc và cs (2014) đã nghiên cứu tạo rễ bất định 
cây đinh lăng lá nhỏ bằng phương pháp nuôi cấy in vitro. Mẫu lá được cấy 
vào môi trường MS có bổ sung 2,4-D để cảm ứng tạo callus. Callus được cấy 
chuyền sang môi trường MS có bổ sung các chất điều hòa sinh trưởng thực 
vật để cảm ứng tạo rễ. Kết quả cho thấy, bổ sung 2 mg/L 2,4-D cho tỷ lệ tạo 
callus 100%. Bổ sung 0,1 mg/L NAA và 1 mg/L IBA cho tỉ lệ tạo rễ cao và số 
lượng rễ tạo ra nhiều. Kết quả này mở ra triển vọng trong nghiên cứu nuôi cấy 
rễ cây đinh lăng lá nhỏ nhằm mục đích thu nhận saponin ở quy mô lớn hơn 
[9]. Sự phát sinh cơ quan từ nuôi cấy callus đinh lăng lá nhỏ cũng được 
Trương Thị Bích Phượng và cs (2017) nghiên cứu. Callus 8 tuần tuổi hình 
thành từ gốc của bẹ lá trên môi trường MS bổ sung 30 g/L sucrose, 8 g/L 
agar, 1 mg/L 2,4-D được sử dụng làm nguồn nguyên liệu cho nuôi cấy huyền 
phù. Môi trường MS bổ sung 30 g/L sucrose, 1,5 mg/L 2,4-D là thích hợp 
nhất cho việc nhân sinh khối tế bào. Sự hình thành phôi và rễ tốt nhất trên môi 
trường MS bổ sung 30 g/L sucrose, 1,5 mg/L NAA [17]. 
1.4.3. Sản xuất oleanolic acid từ nuôi cấy tế bào đinh lăng lá nhỏ 
Hiện nay, đã có một số công trình nghiên cứu tách chiết và sản xuất 
oleanolic acid từ nuôi cấy các loài đinh lăng lá nhỏ trong nước và trên thế 
 41 
giới. Nguyễn Trung Hậu và cs (2015) đã nuôi cấy mô lá đinh lăng lá nhỏ tạo 
rễ tơ và nhận biết hoạt chất saponin tích lũy. Theo đó, mẫu lá được khử trùng 
bằng dung dịch Javel nồng độ 50%, trong 10 phút, cho tỷ lệ mẫu mô vô trùng 
đạt 96,3% sau 2 tuần nuôi cấy. Môi trường MS bổ sung NAA 1 mg/L thích 
hợp cho nuôi cấy mô lá tạo rễ tơ (0,322 g/cụm). Sự tăng sinh rễ tơ tốt nhất 
trên môi trường MS bổ sung NAA 0,5 mg/L là 2,018 g/cụm. Định lượng bằng 
HPLC cho thấy, rễ tơ in vitro tạo ra từ môi trường nuôi cấy tăng sinh có chứa 
hợp chất oleanolic acid 40,1 µg/g và saponin 396,2 µg/g [3]. 
Việc sản xuất oleanolic acid từ thực vật nói chung và từ cây đinh lăng lá 
nhỏ nói riêng cũng đã được nghiên cứu. Tuy nhiên, ứng dụng elicitor để cải 
thiện khả năng tích lũy oleanolic acid trong nuôi cấy tế bào huyền phù cây 
đinh lăng lá nhỏ chưa được công bố, do đó các nghiên cứu theo hướng này sẽ 
đảm bảo được tính mới của đề tài. 
1.4.4. Xây dựng quy trình thu nhận hợp chất thứ cấp từ cây đinh lăng lá 
nhỏ 
Bên cạnh các công trình nghiên cứu về sản xuất hợp chất thứ cấp từ nuôi 
cấy tế bào cây đinh lăng, các nghiên cứu để xây dựng quy trình thu nhận các 
hợp chất này cũng đã được nghiên cứu và công bố. Huỳnh Thị Mai Duyên và 
cs (2018) đã sử dụng phương pháp trích ly saponin triterpenoid bằng dung 
môi nhằm xác định ảnh hưởng của kích thước nguyên liệu (<0,3-1 mm), loại 
dung môi (ethanol, nước, n-butanol), tỷ lệ nguyên liệu: dung môi (1:10 - 
1:35), nhiệt độ trích ly (30-90oC) và thời gian trích ly (1-6 giờ) đến hàm 
lượng saponin triterpenoid và khả năng ức chế amylase của dịch trích lá đinh 
lăng lá nhỏ. Kết quả cho thấy, các thông số phù hợp cho quá trình trích ly là 
kích thước nguyên liệu bé hơn 0,3 mm, dung môi sử dụng ethanol với tỉ lệ 
nguyên liệu: dung môi 1:25, nhiệt độ 70oC và thời gian trích ly 4 giờ. Tại điều 
kiện này, hàm lượng saponin triterpenoid thu được là 1,60 mg/g và khả năng 
ức chế amylase 72,19% [2]. 
 42 
Ngoài dung môi, phá vỡ tế bào cũng là một yếu tố quan trọng trong quá 
trình ly trích saponin. Hà Thị Thanh Nga và cs (2019) đã nghiên cứu quá trình 
ly trích saponin triterpenoid tổng từ lá đinh lăng lá nhỏ với sự hỗ trợ của kỹ 
thuật siêu âm. Tác giả đã tiến hành khảo sát ảnh hưởng của tỉ lệ nguyên liệu: 
nước, công suất siêu âm và thời gian siêu âm tới quá trình tríchly saponin 
triterpenoid tổng từ lá. Kết quả cho thấy cả 3 yếu tố đều có tác động đến hàm 
lượng saponintriterpenoid tổng thu được theo quy luật hàm bậc hai. Quá trình 
tối ưu hóa bằng phương pháp đáp ứng bề mặt đã thu được thông số tối ưu như 
thời gian siêu âm 20,75 phút, công suất siêu âm 221,32 W/g, với tỉ lệ nước: 
nguyên liệu là 29,50; lúc này hàm lượng saponin triterpenoid tổng thu được 
cao gấp xấp xỉ 2,5 lần so với mẫu không được xử lý siêu âm [16]. 
Sau khi ly trích, bảo quản cũng là một vấn đề cần được nghiên cứu, 
Nguyễn Hồng Anh và cs (2018) đã nghiên cứu ảnh hưởng nhiệt độ bảo quản 
(5oC, 30oC, 60oC) đến hàm lượng saponin triterpenoid tổng, polyphenol tổng 
và hoạt tính kháng oxy hóa của cao chiết ethanol-lá đinh lăng lá nhỏ trong 30 
ngày bảo quản. Nghiên cứu cho thấy 3 yếu tố này có mối tương quan thuận, 
chặt chẽ với nhau. Sau 30 ngày bảo quản, nhiệt độ 5oC có sự hao hụt về hàm 
lượng các chỉ tiêu thấp nhất trong tất cả các điều kiện bảo quản với sự tổn thất 
về hàm lượng saponin triterpenoid tổng, polyphenol tổng và khả năng kháng 
oxy hóa (bao gồm khả năng bắt gốc tự do DPPH và khả năng khử Fe3+) lần 
lượt là 9,55%, 19,81%, 4,18% và 34,6%. Kết quả nghiên cứu cho thấy, việc 
bảo quản ở điều kiện nhiệt độ thấp (khuyến cáo 5oC) giúp hạn chế tối đa sự 
hao tổn các hợp chất có hoạt tính sinh học [1]. 
 43 
Chương 2 
ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 
2.1. ĐỐI TƯỢNG NGHIÊN CỨU 
2.1.1. Đối tượng nghiên cứu 
Đối tượng nghiên cứu là cây đinh lăng lá nhỏ (Polyscias fruticosa (L.) 
Harms). 
Hình 2.1. Cây đinh lăng lá nhỏ tự nhiên. 
2.1.2. Nguyên liệu nghiên cứu 
Nguyên liệu nghiên cứu là callus từ các bộ phận khác nhau của cây đinh 
lăng lá nhỏ in vitro do Phòng thí nghiệm nuôi cấy mô của Bộ môn Công nghệ 
sinh học, Khoa Sinh học, Trường Đại học Khoa học, Đại học Huế cung cấp. 
Trong nghiên cứu này, có 3 loại callus được sử dụng để khảo sát nuôi 
cấy ban đầu, bao gồm callus có nguồn gốc từ lá, từ thân và từ rễ. Callus sử 
dụng trong nghiên cứu là callus 4 tuần tuổi và đã được cấy chuyển 3-4 lần. 
 44 
Hình 2.2. Callus có nguồn gốc từ lá sau 5 tuần nuôi cấy (bar = 1 cm). 
Hình 2.3. Callus có nguồn gốc từ thân sau 5 tuần nuôi cấy (bar = 1 cm). 
Hình 2.4. Callus có nguồn gốc từ rễ sau 5 tuần nuôi cấy (bar = 1 cm). 
Các mẫu callus này được nuôi trong các bình tam giác có thể tích 250 
mL (hoặc bình serum) chứa 50 mL môi trường rắn, đặt trong phòng nuôi cấy 
 45 
có nhiệt độ 25±2oC, cường độ chiếu sáng 2.000 lux, thời gian chiếu sáng 16 
giờ/ngày. Môi trường nuôi cấy là môi trường cơ bản MS có bổ sung chất điều 
hòa sinh trưởng theo kết quả thăm dò sơ bộ trong các nghiên cứu trước đó. 
2.2. PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 
Các bước thực hiện thí nghiệm của luận án này được trình bày tóm tắt ở 
hình 2.5. 
2.2.1. Hóa chất và môi trường nuôi cấy 
Các hóa chất sử dụng trong nghiên cứu đều đảm bảo tiêu chuẩn nghiên 
cứu, được trình bày cụ thể ở bảng 2.1. 
Bảng 2.1. Các hóa chất chính sử dụng trong nghiên cứu 
STT Tên hóa chất Hãng sản xuất Nước sản xuất 
1 BAP Nacalai tesque Nhật Bản 
2 2,4-D Nacalai tesque Nhật Bản 
3 KIN Himedia Ấn Độ 
4 Tryptone Himedia Ấn Độ 
5 Casamino acids Sigma-Aldrich Đức 
6 Sucrose Daejung Hàn Quốc 
7 Glucose Merck Đức 
8 Fructose Himedia Ấn Độ 
9 YE Bio-rad Mỹ 
10 MeJA Sigma-Aldrich Đức 
11 Methanol for liquid 
chromatography 
Merck Đức 
12 Oleanolic acid Sigma-Aldrich Đức 
Môi trường dinh dưỡng được sử dụng là MS cơ bản [80] có 30 g/L 
sucrose, 9 g/L agar, pH 5,8 được bổ sung các chất điều hòa sinh trưởng khác 
nhau tùy theo mục đích của từng thí nghiệm. Môi trường được khử trùng ở 
121oC trong 20 phút [67]. 
 46 
2.2.2. Nghiên cứu ảnh hưởng của môi trường nuôi cấy lên khả năng sinh 
trưởng của callus 
2.2.2.1. Ảnh hưởng của 2,4-D và KIN 
Callus (0,3 × 0,3 cm) có nguồn gốc từ lá, thân và rễ của cây đinh lăng lá 
nhỏ in vitro được nuôi trên môi trường cơ bản MS bổ sung 2,4-D có nồng độ 
từ 0,5-3 mg/L và 0,5 mg/L KIN để thăm dò khả năng sinh trưởng của callus 
[17, 21]. Đối chứng là công thức nuôi cấy không bổ sung KIN và 2,4-D. Số 
liệu được thu sau 5 tuần nuôi cấy, từ đó rút ra nồng độ 2,4-D và KIN tối ưu 
cho các nghiên cứu tiếp theo. 
Mẫu thí nghiệm được cấy trong các bình tam giác có thể tích 250 mL 
(hoặc bình serum) chứa 50 mL môi trường rắn, đặt trong phòng nuôi cấy có 
nhiệt độ 25±2oC, cường độ chiếu sáng 2.000 lux, thời gian chiếu sáng 16 
giờ/ngày [67]. Số lượng callus/bình dao động từ 10-12 mẫu. 
Sinh trưởng của callus được đánh giá dựa trên kích thước khối callus 
(đường kính), khối lượng tươi và khối lượng khô. Trạng thái vật lý của callus 
được xác định bằng đánh giá cảm quan. Callus sinh trưởng tốt nhất được dùng 
làm nguyên liệu cho các thí nghiệm nuôi cấy huyền phù. 
Đường kính callus: được đo bằng thước kẹp. 
Khối lượng tươi (FW): Khối callus được loại bỏ agar, cân để xác định 
khối lượng tươi. 
Khối lượng khô (DW): Sau khi cân khối lượng tươi, callus được sấy khô 
ở 50oC đến khối lượng không đổi, cân để xác định khối lượng khô [67]. 
Chỉ số sinh trưởng (GI) được tính bằng tỷ lệ giữa khối lượng tươi sau 
một thời gian nuôi cấy (g) và khối lượng tươi lúc đưa vào nuôi cấy (g). 
2.2.2.2. Ảnh hưởng của nguồn nitơ 
Trong 3 loại callus nghiên cứu, loại callus có khả năng sinh trưởng tốt 
 47 
nhất, có các đặc điểm hình thái thích hợp để nuôi cấy tế bào huyền phù sẽ 
được lựa chọn cho các nghiên cứu tiếp theo. 
Mẫu callus (0,3 × 0,3 cm) được cấy lên môi trường cơ bản MS chứa các 
chất điều hòa sinh trưởng ở điều kiện tối ưu, bổ sung dịch tryptone (0,2-1,6 
g/L) hoặc casamino acids (0,2-1,6 g/L) để thăm dò khả năng sinh trưởng của 
callus [21]. Số lượng callus/bình dao động từ 10-12 mẫu. Đối chứng là công 
thức nuôi cấy không bổ sung tryptone hoặc casamino acids. Số liệu được thu 
sau 5 tuần nuôi cấy. 
2.2.3. Nghiên cứu ảnh hưởng của môi trường nuôi cấy lên khả năng sinh 
trưởng của tế bào 
Callus có màu vàng, rời rạc, 30 ngày tuổi từ công thức nuôi cấy tốt nhất 
được sử dụng cho các nghiên cứu nuôi cấy huyền phù tế bào. Mẫu thí nghiệm 
được cấy trong các bình tam giác có thể tích 250 mL chứa 50 mL môi trường 
lỏng, đặt trong phòng nuôi cấy có nhiệt độ 25±2oC, cường độ chiếu sáng 500 
lux, tốc độ lắc 120 vòng/phút và thời gian chiếu sáng 16 giờ/ngày [67]. Mỗi 
công thức thí nghiệm gồm 5 bình. 
* Xây dựng đường cong sinh trưởng của tế bào: 2 g callus được cấy 
chuyển và nuôi trong bình tam giác chứa môi trường cơ bản MS lỏng (môi 
trường nuôi cấy tạo callus tốt nhất nhưng không có agar) với 30 g/L sucrose. 
Tế bào được thu liên tục 2 ngày/lần trong thời gian từ 2-22 ngày, khả năng 
sinh trưởng của tế bào được xác định qua khối lượng tươi, khối lượng khô và 
chỉ số sinh trưởng của tế bào [86]. 
Thu mẫu: dịch nuôi cấy tế bào huyền phù được lọc chân không, rửa sạch 
sinh khối bằng nước cất 2-3 lần sau đó được sử dụng làm nguyên liệu để đánh 
giá các chỉ tiêu liên quan. 
Khối lượng tươi (FW): toàn bộ tế bào trong mỗi bình nuôi cấy được lọc 
 48 
bằng giấy lọc, rửa bằng nước cất và cân để xác định khối lượng tươi. 
Khối lượng khô (DW): callus được sấy khô ở 50oC đến khối lượng 
không đổi, cân để xác định khối lượng khô [67]. 
Chỉ số sinh trưởng (GI) được tính bằng tỷ lệ giữa khối lượng tươi sau 
một thời gian nuôi cấy (g) và khối lượng tươi lúc đưa vào nuôi cấy (g). 
* Khảo sát ảnh hưởng của nguồn carbon lên khả năng sinh trưởng của tế 
bào: trong thí nghiệm này sucrose được thay thế bằng đường glusose và 
fructose với các nồng độ 20-40 g/L, các điều kiện nuôi cây và các chỉ tiêu 
đánh giá được thiết lập dựa trên kết quả nghiên cứu tốt nhất thu được từ thí 
nghiệm trước đó. Đối chứng là công thức sử dụng 30 g/L sucrose. 
* Khảo sát ảnh hưởng của chất điều hòa sinh trưởng lên sự phát triển của 
tế bào: môi trường cơ bản MS chứa nguồn carbon thích hợp từ thí nghiệm 
trước đã được sử dụng cho thí nghiệm này, các chất điều hòa sinh trưởng 
được sử dụng (cytokinin và auxin) gồm BAP (0,5-1,5 mg/L) hoặc KIN (0,5-
1,5 mg/L) kết hợp với 2,4-D (0,5-1 mg/L), các điều kiện nuôi cây và các chỉ 
tiêu đánh giá được thiết lập dựa trên kết quả nghiên cứu tốt nhất thu được từ 
thí nghiệm trước đó. 
2.2.4. Xử lý elicitor 
Môi trường tích lũy sinh khối và oleanolic acid tốt nhất từ các thí 
nghiệm trên được sử dụng để nghiên cứu khả năng sản xuất eloanolic acid từ 
tế bào có sử dụng các elicitor. 
Thí nghiệm nuôi cấy được tiến hành tương tự như đối với các thí 
nghiệm nuôi cấy tế bào huyền phù. Ảnh hưởng của các loại elicitor là YE và 
MeJA được đánh giá bằng cách bổ sung vào môi trường với các nồng độ 
elicitor khác nhau tại các thời điểm khác nhau (thời điểm ban đầu và sau 3, 6, 
9 ngày nuôi cấy). Trong đó, MeJA có nồng độ từ 10-100 µM, YE từ 1-3 g/L. 
 49 
Mẫu thí nghiệm được cấy trong các bình tam giác có thể tích 250 mL 
chứa 50 mL môi trường lỏng, đặt trong phòng nuôi cấy có nhiệt độ 25±2oC, 
cường độ chiếu sáng 500 lux, tốc độ lắc 120 vòng/phút và thời gian chiếu 
sáng 16 giờ/ngày [67]. Mỗi công thức thí nghiệm gồm 5 bình. 
Sinh khối tế bào được thu hoạch sau 16 ngày nuôi để xác định khối 
lượng tươi, khối lượng khô và hàm lượng oleanolic acid. Trong thí nghiệm 
xác định ảnh hưởng của nồng độ elicitor, đối chứng là công thức không bổ 
sung elicitor. Trong thí nghiệm xác định ảnh hưởng của thời gian xử lý 
elicitor, đối chứng là công thức xử lý elicitor ở nồng độ tốt nhất vào thời 
điểm bắt đầu nuôi cấy (ngày 0). 
2.2.5. Định lượng oleanolic acid 
2.2.5.1. Tách chiết oleanolic acid 
Mẫu (mẫu tự nhiên, tế bào huyền phù) sau khi xác định khối lượng tươi 
được sấy khô ở 50oC đến khối lượng không đổi, sau đó cân để xác định khối 
lượng khô [86]. Mẫu khô sau đó được nghiền mịn và chiết với methanol 
(Merck, Đức) theo tỷ lệ 1 g bột mẫu: 5 mL methanol. Hỗn hợp chiết được 
trộn đều và ủ ở 37oC trong 10 phút. Hỗn hợp được phân làm hai lớp sau khi ủ, 
hút cẩn thận lấy dịch nổi phía trên, lặp lại 3 lần để thu dịch chiết tế bào. Mẫu 
chiết được đem sấy ở 50oC qua đêm đến khi methanol bay hơi hết. Tiếp theo bổ 
sung methanol với thể tích tương đương ban đầu để tái hòa tan oleanolic acid. 
Dịch chiết oleanolic acid của tế bào thân đinh lăng lá nhỏ được lọc qua màng lọc 
0,45 µm, bảo quản ở 4oC để sử dụng cho phân tích HPLC sau này. 
2.2.5.2. Phân tích HPLC 
Hàm lượng oleanolic acid được xác định bằng máy sắc ký lỏng hiệu 
năng cao (HPLC) theo Kochkin và cs (2014) [56]. 
Phân tích HPLC được thực hiện với pha động bao gồm 2% acetonitrile 
 50 
và 0,1% acetic acid, với cột C18 (InertSustain C18 5 µm, 4,6×250 mm), nhiệt 
độ cột 24oC, tốc độ dòng 1 mL/phút, thể tích tiếp mẫu 5 µL. Oleanolic acid 
được phát hiện ở bước sóng 210 nm. Phân tích HPLC được tiến hành trên hệ 
thống sắc kí HPLC Shimadzu LC20A (Shimadzu, Nhật Bản). 
Tất cả dung môi đạt tiêu chuẩn phân tích HPLC được mua từ hãng 
Merck (Đức). Oleanolic acid của hãng Sigma được dùng làm chất chuẩn để 
xác định hàm lượng oleanolic acid (Bảng 2.1). Hàm lượng oleanolic acid 
được xác định dựa theo đường chuẩn xây dựng từ diện tích đỉnh (peak) của 
các nồng độ oleanolic acid chuẩn khác nhau trong phân tích HPLC. 
Phương trình đường chuẩn là: y = 3456x + 588,42 (R2 = 0,9966), trong 
đó: y là hàm lượng oleanolic acid (µg/mL), x là diện tích đỉnh. 
Hàm lượng oleanolic acid trong sinh khối khô được tính theo công thức: 
C (mg/g) = y.V/(m.1000), trong đó: V là thể tích mẫu chiết (mL), m là 
khối lượng mẫu để chiết (g), 1000 là đơn vị quy đổi từ mg sang µg. 
2.2.6. Xử lý thống kê 
Các thí nghiệm được bố trí hoàn toàn ngẫu nhiên. Thí nghiệm nuôi cấy 
callus được lặp lại 3 lần, mỗi lần 3 bình, mỗi bình chứa 10-12 mẫu callus. Thí 
nghiệm nuôi cấy tế bào được lặp lại 3 lần, mỗi lần 5 bình. Các thí nghiệm 
phân tích HPLC được lặp lại 3 lần. Số liệu được xử lý bằng phương pháp 
thống kê sinh học, phân tích one-way ANOVA bằng Duncan’s test theo 
chương trình SPSS 22.0 với mức xác suất có ý nghĩa p<0,05. 
 51 
Hình 2.5. Sơ đồ thí nghiệm 
Callus (từ thân, rễ, lá) 
Xác định sinh trưởng 
của tế bào 
Đường cong 
sinh trưởng 
Lựa chọn loại callus và thiết lập nuôi 
cấy tế bào huyền phù 
Đánh giá khả năng sinh trưởng của callus 
Ảnh hưởng của 
nguồn carbon 
Ảnh hưởng của 
chất ĐHST 
Sự tích lũy 
oleanolic acid 
Xử lý elicitor 
(dịch chiết nấm men và methyl jasmonate) 
Xác định sự tích lũy 
oleanolic acid 
Thu nhận oleanolic acid 
 52 
Chương 3 
KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU 
3.1. ẢNH HƯỞNG CỦA MÔI TRƯỜNG NUÔI CẤY ĐẾN SINH 
TRƯỞNG CỦA CALLUS 
3.1.1. Ảnh hưởng của 2,4-D kết hợp với KIN lên sinh trưởng của callus 
Callus có nguồn gốc từ lá, thân và rễ của cây đinh lăng lá nhỏ in vitro 
được cấy lên môi trường dinh dưỡng chứa 2,4-D và KIN để đánh giá khả 
năng sinh trưởng của callus. Sự sinh trưởng của callus sau 5 tuần nuôi cấy 
được trình bày ở bảng 3.1-3.3. 
3.1.1.1. Callus có nguồn gốc từ lá 
Callus có nguồn gốc từ mẫu lá của cây đinh lăng lá nhỏ được cấy lên 
môi trường cơ bản MS có bổ sung 2,4-D ở các nồng độ khác nhau (0-3 mg/L) 
kết hợp với 0,5 mg/L KIN để nghiên cứu khả năng sinh trưởng của callus, số 
liệu về sự sinh trưởng của callus sau 5 tuần nuôi cấy được trình bày ở bảng 
3.1. 
Ở công thức đối chứng (không có bổ sung 2,4-D và KIN), kích thước 
trung bình của callus đạt 0,59 cm, khối lượng tươi trung bình đạt 76,7 mg, 
khối lượng khô trung bình đạt 0,0063 mg, callus có màu trắng ngả vàng, dạng 
trong, ngậm nước. Khi bổ sung các chất điều hòa sinh trưởng, khả năng sinh 
trưởng của callus tăng lên ở một số công thức nhưng giảm mạnh ở các công 
thức bổ sung nồng độ cao. Môi trường cơ bản MS có bổ sung 1 mg/L 2,4-D 
kết hợp với 0,5 mg/L KIN thích hợp nhất cho khả năng sinh trưởng của 
callus, kích thước trung bình của callus đạt 0,65 cm, khối lượng tươi và khối 
lượng khô trung bình của callus cao hơn so với các môi trường còn lại (129,9 
mg và 9,3 g). Trên môi trường này callus có màu vàng tươi, dạng hạt nhỏ 
(Hình 3.1). Khi nồng độ 2,4-D tăng từ 1,5-5 mg/L thì khả năng sinh trưởng 
 53 
của callus giảm dần. Như vậy, môi trường cơ bản MS có bổ sung 1 mg/L 2,4-
D kết hợp với 0,5 mg/L KIN là môi trường tốt nhất cho khả năng sinh trưởng 
của callus lá cây đinh lăng lá nhỏ. 
Bảng 3.1. Ảnh hưởng của 2,4-D kết hợp với KIN lên khả năng sinh trưởng 
của callus lá sau 5 tuần nuôi cấy 
Chất ĐHST (mg/L) Kích thước 
(cm) 
Khối lượng 
tươi (mg) 
Khối lượng khô 
(mg) 2,4-D KIN 
0 0 0,59ab 76,7b 6,3bc 
0,5 0,5 0,63a 79,4b 8,2ab 
1,0 0,5 0,65a 129,9a 9,3a 
1,5 0,5 0,61a 76,0b 6,1bc 
2,0 0,5 0,53bc 61,3bc 5,2c 
3,0 0,5 0,50c 41,3c 4,8c 
Chú thích: Các chữ cái khác nhau trên cùng một cột chỉ ra sự sai khác có ý 
nghĩa thống kê của trung bình mẫu với p < 0,05 (Duncan’s test). 
Hình 3.1. Callus lá sinh trưởng trên môi trường có bổ sung 1 mg/L 2,4-D kết 
hợp với 0,5 mg/L KIN sau 5 tuần nuôi cấy (bar = 1 cm). 
3.1.1.2. Callus có nguồn gốc từ thân 
Các mẫu callus có nguồn gốc từ thân của cây in vitro được cấy lên môi 
trường cơ bản MS có bổ sung 2,4-D kết hợp với KIN để nghiên cứu khả năng 
 54 
sinh trưởng của callus. Kết quả thu được sau 5 tuần nuôi cấy được trình bày ở 
bảng 3.2. 
Trong các môi trường nghiên cứu, môi trường cơ bản MS có 1 mg/L 2,4-
D và 0,5 mg/L KIN cho kết quả tốt nhất, khối lượng tươi và khối lượng khô 
trung bình của callus đạt cao nhất (lần lượt là 123,9 mg và 8,8 mg). Callus có 
màu vàng tươi, dạng hạt nhỏ (Hình 3.2). 
Ở các nồng độ 2,4-D thấp hơn hoặc cao hơn 1 mg/L, sinh trưởng của 
callus đều không tốt bằng. Ở môi trường có 0,5 mg/L 2,4-D, khối lượng tươi 
chỉ đạt 107,2 mg (7,4 mg khô). Khi tăng nồng độ 2,4-D lên 1,5 mg/L, sinh 
trưởng thậm chí còn thấp hơn, khối lượng tươi chỉ đạt 79,7 mg, tương ứng với 
khối lượng khô là 6,3 mg. 
Bảng 3.2. Ảnh hưởng của 2,4-D và KIN lên khả năng sinh trưởng của callus 
thân sau 5 tuần nuôi cấy 
ĐHST (mg/L) Kích thước 
(cm) 
Khối lượng 
tươi (mg/callus) 
Khối lượng khô 
(mg/callus) 2,4-D KIN 
0 0 0,66bc 114,7b 7,1bc 
0,5 0,5 0,71ab 107,2b 7,4b 
1 0,5 0,73a 123,9a 8,8a 
1,5 0,5 0,64c 79,7c 6,3bcd 
2 0,5 0,61cd 72,9cd 5,9cd 
3 0,5 0,58d 60,8d 5,0d 
Các chữ cái khác nhau trên cùn