Luận án Nghiên cứu kỹ thuật nhân giống in vitro và trồng cây hoa chuông (sinningia speciosa) tại tỉnh Thừa Thiên Huế

hoa chuông màu đỏ cánh kép và màu trắng cánh đơn, để xác định được cơ quan đưa vào nuôi cấy và thời gian khử trùng tối ưu. Sau hai tuần theo dõi, kết quả được trình bày ở bảng 3.1.
Số liệu bảng 3.1 cho thấy, các cơ quan sử dụng để nuôi cấy ở cả hai giống có phản ứng rất khác nhau ở các mức thời gian khử trùng. Các mẫu lá có tỷ lệ chết cao hơn đoạn thân mang mắt ngủ và đài nụ non ở tất cả các khoảng thời gian thực nghiệm. Tỷ lệ chết của mẫu lá ở cả hai giống đều tăng tỷ lệ thuận với mức tăng về thời gian khử trùng (Bảng 3.1). Một số mẫu lá còn sống thì cũng rất yếu và khó tái sinh. Điều này có thể do lá của cây hoa chuông mềm, có rất nhiều lông tơ nên khi khử trùng bằng HgCl2 nồng độ 0,1% thì các tế bào mô lá bị tổn thương (bầm dập, biến màu) và rất khó để loại bỏ các vi sinh vật bám trên bề mặt lá. Như vậy, việc sử dụng cơ quan sinh dưỡng là lá để tạo nguồn vật liệu khởi đầu thì hầu như không có kết quả đối với cả hai giống hoa đỏ và hoa trắng.
Khi tăng thời gian khử trùng lên 10 phút thì hiệu lực diệt vi sinh vật ở các mẫu được cải thiện rõ rệt. Cụ thể, tỷ lệ mẫu nhiễm ở tất cả các cơ quan đưa vào nuôi cấy đều giảm và tỷ lệ mẫu sống tăng, đạt giá trị cao nhất ở đoạn thân mang mắt ngủ là 43,33% (hoa đỏ) và 53,33% (hoa trắng). Thời gian khử trùng tăng lên 15 phút thì tỷ lệ mẫu sống không tăng mà bắt đầu giảm. Các mẫu là mô lá chết hoàn toàn ở cả hai giống, các mẫu là đoạn thân mang mắt ngủ tỷ lệ mẫu sống giảm còn 20% (cho cả hai giống). 
Bảng 3.1. Ảnh hưởng của thời gian khử trùng và cơ quan nuôi cấy đến sự tạo nguồn vật liệu khởi đầu ở hai giống hoa chuông
 	 (sau 2 tuần nuôi cấy)
Thời gian (phút)
Vật liệu
Tỷ lệ mẫu chết (%)
Tỷ lệ mẫu nhiễm (%)
Tỷ lệ mẫu sống (%)
Hoa màu đỏ cánh kép
5
Đoạn thân
0,00h
93,33a
6,67fg
Lá non
26,67fg
63,33c
10,00efg
Nụ non
3,33h
80,00a
16,67def
7
Đoạn thân
20,00g
50,00d
30,00bc
Lá non
53,33e
30,00e
16,67def
Nụ non
23,33fg
43,33d
33,33ab
10
Đoạn thân
36,67f
20,00ef
43,33a
Lá non
90,00ab
6,67gh
3,33g
Nụ non
56,67de
16,67fg
26,67bcd
15
Đoạn thân 
70,00cd
10,00fgh
20,00cde
Lá non
100,00a
0,00h
0,00g
Nụ non
76,67bc
6,67gh
16,67def
LSD0,05
14.42
12,15
10,79
Hoa màu trắng cánh đơn
5
Đoạn thân
6,67h
93,33a
0,00c
Lá non
33,33fg
60,00bc
6,67bc
Nụ non
16,67gh
70,00b
13,33bc
7
Đoạn thân
30,00fg
50,00cd
20,00b
Lá non
53,33de
33,33ef
13,33bc
Nụ non
43,33ef
36,67de
20,00b
10
Đoạn thân
20,00gh
26,67ef
53,33a
Lá non
80,00bc
10,00gh
10,00bc
Nụ non
63,33cd
20,00fg
16,67b
15
Đoạn thân 
73,33c
 6,67gh
20,00b
Lá non
100,00a
0,00h
0,00c
Nụ non
93,33ab
0,00h
6,67bc
LSD0,05
18,62
15,22
16,08
Ghi chú: a, b, c, d, e, f, g, h chỉ ra các công thức có cùng ký tự trong một cột không có sai khác ý nghĩa tại mức α = 0,05
Như vậy, các cơ quan trước khi đưa vào nuôi cấy có thời gian khử trùng càng dài thì tỷ lệ mẫu nhiễm giảm nhưng tỷ lệ mẫu chết lại tăng, do chất khử trùng ngoài tác dụng diệt các vi sinh vật thì nó cũng gây độc cho mô nuôi cấy [17].
Tóm lại: Để tạo nguồn vật liệu khởi đầu trong nhân giống in vitro cây hoa chuông, sử dụng cơ quan sinh dưỡng là đoạn thân mang mắt ngủ cho hiệu quả cao hơn hẳn nụ non và lá non. Thời gian khử trùng là 10 phút cho tỷ lệ mẫu sống cao nhất đạt từ 43,33% - 53,33%. Kết quả này cũng phù hợp với nghiên cứu của Nguyễn Quang Thạch và cs (2004) [15]. 
Phân tích hồi quy, chúng tôi xác định được mô hình toán học và đồ thị (Phụ lục 4) biểu diễn mối quan hệ giữa thời gian khử trùng và tỷ lệ mẫu sống đối với đoạn thân mang mắt ngủ như sau: 
y1 = -1,2163 x12 + 25,606 x1 - 90,532 (r = 0,969)
y2 = -1,6028x22 + 34,482x2 - 135,74 (r = 0,888)
Trong đó: x là thời gian xử lý; y là tỷ lệ mẫu sống; r: là hệ số tương quan (y1, x1, r1: giống hoa màu đỏ cánh kép; y2, x2, r2: giống hoa màu trắng cánh đơn). 
Mô hình toán học và hệ số tương quan thu được cho thấy, tỷ lệ mẫu sống có tương quan rất chặt với thời gian khử trùng mẫu (r = 0,888 - 0,969). Vì vậy, cần phải xác định được thời gian khử trùng phù hợp để cho tỷ lệ mẫu sống cao, làm tăng hiệu quả của phương pháp khử trùng.
3.1.2. Giai đoạn tạo sự phát sinh hình thái và nhân nhanh
Để nhân nhanh chồi in vitro, trong giai đoạn đầu cần phải điều khiển mô nuôi cấy phát sinh nhiều chồi để tăng lượng mẫu sạch. Môi trường nuôi cấy, ngoài các chất dinh dưỡng cần thiết, cần phải bổ sung các chất điều hoà sinh trưởng thuộc nhóm auxin và cytokinin... 
BA có tác dụng kích thích sự phân chia tế bào, tái sinh chồi mạnh mẽ từ mô nuôi cấy và hạn chế sự phát triển rễ. α-NAA có tác dụng kích thích sinh trưởng giãn của tế bào và hình thành rễ. Sự cân bằng tỷ lệ giữa auxin và xytokynin có ý nghĩa quyết định trong quá trình phát sinh hình thái, sinh trưởng và phát triển chồi của mô nuôi cấy in vitro [13]. 
Nghiên cứu xác định ảnh hưởng của sự phối hợp BA và α-NAA đến khả năng tái sinh chồi của các mẫu cấy là đoạn thân mang mắt ngủ của hai giống hoa chuông, sau 8 tuần theo dõi được trình bày ở bảng 3.2.
Số liệu bảng 3.2 cho thấy, các chất điều hòa sinh trưởng có vai trò quyết định đến sự phát sinh chồi của các mô nuôi cấy. Trên môi trường không bổ sung chất điều hòa sinh trưởng thì các mẫu cấy không có sự kích ứng tạo chồi. Trong tổ hợp với α-NAA, khi tăng nồng độ BA từ 0,5-1mg/l, tỷ lệ mẫu tạo chồi tăng, chất lượng chồi tốt. Tỷ lệ mẫu tạo chồi và số chồi/mẫu cao nhất đạt được lần lượt là: 46,67% và 1,17 chồi/mẫu (hoa đỏ); 60% và 1,53 chồi/mẫu (hoa trắng), trên môi trường bổ sung 1mg BA/l kết hợp với 0,02mg α-NAA/l. Chồi to khoẻ, đồng đều, màu xanh đậm. Kết quả nghiên cứu này, tạo được các chồi in vitro ở nồng độ BA và α-NAA thấp hơn so với nghiên cứu của Jie (2004) [58], Naz và cs (2001) [83] và Ioja-Boldura và Ciulca (2013) [57]. Khi tăng nồng độ BA lên 1,5mg/l thì tỷ lệ mẫu tạo chồi và số chồi TB/mẫu đã giảm rõ rệt ở tất cả các mức nồng độ α-NAA.
 Môi trường thích hợp để tái sinh chồi trong nhân giống in vitro cây hoa chuông là: MS + 1mg BA/l + 0,02mg α-NAA/l + 6,5g agar/l + 30g saccarose/l. Kết quả này góp phần làm giảm chi phí đầu vào (chất kích thích sinh trưởng BA và α-NAA) trong quy trình nhân giống in vitro cây hoa chuông.
Từ kết quả thu được, chúng tôi phân tích hồi quy, xác định được mô hình toán học biểu diễn mối quan hệ giữa nồng độ BA và α-NAA đến tỷ lệ mẫu tái sinh chồi. Tuy nhiên, kết quả phân tích ANOVA ở mức xác suất P = 0,05 thì tỷ lệ mẫu tái sinh chồi thu được không phụ thuộc vào nồng độ α-NAA (Px21 = 0,8247 > 0,05 (hoa đỏ); Px22 = 0,3244 > 0,05 (hoa trắng); với x21: nồng độ α-NAA cho giống hoa đỏ; x22: nồng độ α-NAA cho giống hoa trắng) (Phụ lục 4) mà chỉ phụ thuộc vào nồng độ BA bổ sung. Đồng thời, mối tương quan giữa tỷ lệ mẫu tái sinh chồi và nồng độ BA là tương đối chặt (r = 0,612 - 0,619). Vì vậy, mô hình toán học biểu diễn mối quan hệ giữa nồng độ BA và tỷ lệ mẫu tái sinh chồi như sau:
y1 = - 16,667x12 + 40x1 - 3,75 (r1 = 0,612)
y2 = - 19,1667x22 + 48x2 - 4,7083 (r2 = 0,619)
Trong đó: x là nồng độ BA; y: tỷ lệ mẫu tái sinh chồi; r: là hệ số tương quan (y1, x1, r1: giống hoa màu đỏ cánh kép; y2, x2, r2: giống hoa màu trắng cánh đơn).
Bảng 3.2. Ảnh hưởng phối hợp của BA và a-NAA đến khả năng tái sinh chồi in vitro ở hai giống hoa chuông
 (sau 8 tuần nuôi cấy)
BA 
(mg)
α-NAA
(mg)
Tỷ lệ mẫu tạo chồi (%)
Số chồi/mẫu
 (cái)
Chất lượng chồi
Hoa màu đỏ cánh kép
0,0
0,00
0,00f
0,00d
-
0,5
0,00
0,00f
0,00d
-
0,01
3,33ef
0,03d
+++
0,02
0,00f
0,00d
-
0,03
0,00f
0,00d
+++
1,0
0,00
10,00e
0,17cd
+++
0,01
33,33b
0,77b
+++
0,02
46,67a
1,17a
+++
0,03
20,00d
0,23c
+++
1,5
0,00
6,67ef
0,13cd
++
0,01
23,33cd
0,30c
++ 
0,02
30,00bc
0,60b
+
0,03
0,00f
0,00d
-
LSD0,05
6,84
0,17
-
Hoa màu trắng cánh đơn
0,0
0,00
0,00f
0,00e
-
0,5
0,00
0,00f
0,00e
-
0,01
3,33ef
0,07de
+++
0,02
0,00f
0,00e
-
0,03
0,00f
0,00e
-
1,0
0
16,67d
0,20d
+++
0,01
43,33b
0,83b
+++
0,02
60,00a
1,53a
+++
0,03
36,67b
0,73b
+++
1,5
0
10,00de
0,10de
+++
0,01
26,67c
0,40c
 +++
0,02
40,00b
0,80b
++
0,03
6,67ef
0,07de
+
LSD0,05
9,36
0,18
-
 Ghi chú: a, b, c, d, e, f, chỉ ra các công thức có cùng ký tự trong một cột không có sai khác ý nghĩa tại mức α = 0,05. +++ Chồi to, khỏe, lá màu xanh đặc trưng, ++ Chồi nhỏ, lá bé màu xanh nhạt, + Chồi nhỏ, lá bị cong-mọng nước.
Từ phương trình toán học và hệ số tương quan thu được cho thấy, cần xác định được nồng độ BA bổ sung phù hợp để thu được tỷ lệ mẫu tái sinh chồi cao nhất, làm tăng nguồn vật liệu khởi đầu (chồi in vitro) trong nhân giống in vitro cây hoa chuông.
Nghiên cứu ảnh hưởng của nồng độ BA đến khả năng tăng hệ số nhân chồi và sinh trưởng của chồi in vitro ở hai giống hoa chuông
Các chồi được tạo thành ở thí nghiệm trên được tách ra và cấy chuyển sang các môi trường nhân chồi để tạo ra số lượng chồi nhiều có chất lượng tốt, làm tăng hiệu quả của quy trình nhân giống in vitro.
Nghiên cứu ảnh hưởng riêng lẻ của BA đến khả năng tăng hệ số nhân chồi và sinh trưởng của chồi in vitro ở hai giống hoa chuông màu đỏ cánh kép và màu trắng cánh đơn. Kết quả được trình bày ở bảng 3.3.
Số liệu bảng 3.3 cho thấy, ở cả hai giống, trên môi trường không bổ sung BA, hệ số nhân chồi thu được thấp: 1,43 lần (hoa đỏ) và 1,57 lần (hoa trắng), chồi phát triển về chiều cao, số lá. Tuy nhiên, các chồi đều nhỏ, lá bé màu xanh nhạt.
Khi bổ sung BA nồng độ từ 0,1 - 1 mg/l, hệ số nhân chồi được cải thiện rõ rệt. Đối với giống hoa chuông màu đỏ cánh kép hệ số nhân chồi thu được đạt giá trị cao nhất là 5,10 lần ở môi trường bổ sung 0,5 mg BA/l, chồi phát triển tốt, thân mập, khỏe, lá màu xanh đậm. Ở giống hoa chuông màu trắng, hệ số nhân tăng tỷ lệ thuận với nồng độ BA bổ sung (0,1 - 0,7 mg BA/l). Hệ số nhân thu được ở giống hoa màu trắng cao hơn hẳn giống hoa màu đỏ và đạt cao nhất là 8,57 lần ở môi trường bổ sung 0,7 mg BA/l. Tuy nhiên, các chồi thu được có chất lượng giảm (chồi nhỏ, lá bé màu xanh nhạt, một số lá bị biến dạng). Tăng nồng độ BA lên 1 mg/l thì hệ số nhân bắt đầu giảm ở cả hai giống, một số chồi bắt đầu có những biểu hiện thay đổi về hình thái bên ngoài như: chồi nhỏ, lá bị cong mọng nước, xuất hiện các khối callus màu xanh nhạt. 
Như vậy, BA là hợp chất cytokinine có tác dụng tốt tới khả năng nhân nhanh chồi trong nhân giống in vitro cây hoa chuông. Nồng độ BA bổ sung vào môi trường nhân nhanh chồi in vitro phù hợp nhất là 0,5 mg BA/l. 
Bảng 3.3. Ảnh hưởng của nồng độ BA đến khả năng tăng hệ số nhân chồi và sinh trưởng của chồi in vitro ở hai giống hoa chuông
 (sau 6 tuần nuôi cấy)
BA
(mg)
Hệ số nhân chồi (lần)
Chiều cao chồi (cm)
Số lá/chồi 
(cái) 
Chất lượng chồi
Hoa màu đỏ cánh kép 
0,0
1,43e
4,37a
5,90a
++
0,1
2,60d
3,22b
4,80b
++
0,3
3,83c
2,73c
4,40c
+++
0,5
5,10a
2,30d
3,90d
+++
0,7
5,17a
2,21d
3,70e
++
1,0
4,90b
1,91e
3,40f
++
LSD0,05
0,20 
0,14
0,19
-
Hoa màu trắng cánh đơn
0,0
1,57e
4,25a
6,00a
++
0,1
4,00d
3,13b
5,07b
+++
0,3
6,87c
2,85c
4,67c
+++
0,5
7,83b
2,34d
4,03d
+++
0,7
8,57a
2,28d
3,90de
++
1,0
7,20c
1,89e
3,67e
+
LSD0,05
0,45
0,23
0,33
-
 Ghi chú: a, b, c, d, e, f, chỉ ra các công thức có cùng ký tự trong một cột không có sai khác ý nghĩa tại mức α = 0,05, +++ Chồi to, khỏe, lá màu xanh đậm, ++ Chồi nhỏ, lá bé màu xanh nhạt, + Chồi nhỏ, lá bị cong, mọng nước, xuất hiện các khối callus màu xanh nhạt
Từ kết quả thu được, chúng tôi phân tích hồi quy, xác định được mô hình toán học và đồ thị (Phụ lục 4) biểu diễn mối quan hệ giữa nồng độ BA và hệ số nhân chồi như sau:
y1 = -6,9118x12 + 10,268x1 + 1,509 (r1 = 0,993)
y2 = -14,682x22 + 19,93x2 + 1,8717 (r2 = 0,989)
Trong đó: x là nồng độ BA; y: là hệ số nhân chồi; r: là hệ số tương quan (y1, x1, r1: giống hoa màu đỏ cánh kép; y2, x2, r2: giống hoa màu trắng cánh đơn).
Từ mô hình toán học và hệ số tương quan thu được cho thấy, hệ số nhân chồi có tương quan rất chặt với nồng BA bổ sung vào thành phần môi trường nuôi cấy (r = 0,993 - 0,989). Vì vậy, cần xác định được nồng độ BA bổ sung phù hợp để thu được hệ số nhân chồi cao nhất, đồng thời các chồi in vitro tạo ra có chất lượng tốt. 
3.1.3. Giai đoạn tạo cây hoàn chỉnh
Các chồi in vitro được hình thành ở giai đoạn nhân nhanh có hình dáng một cụm chồi (gồm nhiều chồi/gốc). Các chồi được tách đơn lẻ (kích thước từ 3 - 3,5 cm, 4 - 6 lá) được cấy vào môi trường có bổ sung a-NAA nồng độ từ 0,1 - 0,5 mg/l. Theo dõi ảnh hưởng của nồng độ a-NAA đến khả năng kích ứng tạo rễ của chồi in vitro sau 4 tuần nuôi cấy, kết quả thu được trình bày ở bảng 3.4.
Số liệu bảng 3.4 cho thấy, trên môi trường đối chứng các chồi in vitro vẫn có khả năng ra rễ, tuy nhiên tỷ lệ chồi ra rễ đạt giá trị thấp và số rễ/chồi còn rất ít: 43,33% và 1,97 rễ/chồi (hoa đỏ) và 56,67%, 2,3 rễ/chồi (hoa trắng). Khi bổ sung a-NAA vào môi trường nuôi cấy ở các mức nồng độ khác nhau, quá trình ra rễ của chồi in vitro của cả hai giống đều có sự thay đổi rõ rệt. Các chỉ tiêu thu được như: số rễ/cây và chiều dài rễ đều tăng tỷ lệ thuận với nồng độ a-NAA bổ sung (0 - 0,3 mg/l) và đạt hiệu quả tốt nhất ở công thức có bổ sung 0,3 mg a-NAA/l. Sau 3 tuần nuôi cấy, tỷ lệ ra rễ của chồi in vitro ở cả hai giống đạt khá cao từ 86,67 - 100% (hoa đỏ) và từ 83,33 - 100% (hoa trắng). Đến tuần thứ 4 sau cấy, ở tất cả các công thức có bổ sung a-NAA thì tỷ lệ ra rễ của chồi in vitro đều đạt 100% (Bảng 3.4) và số rễ/chồi, chiều dài rễ/chồi lần lượt là: 7,07 rễ và 2,09 cm (hoa đỏ); 7,23 rễ và 2,03 cm (hoa trắng), chất lượng bộ rễ rất tốt: rễ đồng đều, mập, nhiều lông tơ. Nghiên cứu này thu được kết quả cao hơn so với nghiên cứu của Dương Tấn Nhựt và cs (2005) [12], Lia và cs (2009) [72].
Bảng 3.4. Ảnh hưởng của nồng độ α-NAA đến sự hình thành rễ của chồi in vitro ở hai giống hoa chuông
(sau 4 tuần nuôi cấy)
µ-NAA (mg)
Động thái ra rễ của chồi (%)
Số rễ/chồi (cái)
Chiều dài rễ/chồi (cm)
Chất lượng bộ rễ
1 tuần 
2 tuần
3 tuần
4 tuần
Hoa màu đỏ cánh kép
0,0
0,00c
6,67c
33,33c
43,33b
1,97d
0,71e
++
0,1
0,00c
56,67b
86,67b
100,00a
3,37c
1,57d
++
0,2
3,33bc
63,33b
93,33ab
100,00a
4,43b
1,83c
+++
0,3
13,33a
83,33a
100,00a
100,00a
7,07a
2,09b
+++
0,5
10,00ab
66,67b
90,00b
100,00a
4,07b
6,63a
+
LSD0,05
8,42
11,91
8,06
4,86
0,47
0,15
-
Hoa màu trắng cánh đơn
0,0
0,00
6,67d
40,00c
56,67b
2,30d
0,70d
++
0,1
0,00
56,67c
83,33b
100,00a
3,93c
1,58c
+++
0,2
0,00
73,33ab
100,00a
100,00a
5,17b
1,76c
+++
0,3
0,00
86,67a
100,00a
100,00a
7,23a
2,03b
++
0,5
0,00
70,00bc
96,67a
100,00a
5,97b
6,20a
+
LSD0,05
-
13,53
11,40
4,86
0,82
0,25
- 
Ghi chú: a, b, c, d, e chỉ ra các công thức có cùng ký tự trong một cột không có sai khác ý nghĩa tại mức α = 0,05, +++ Rễ đồng đều, mập, ++ Rễ không đồng đều + Rễ không đồng đều, nhỏ
Tăng nồng độ a-NAA lên 0,5 mg/l thì sinh trưởng của cây in vitro bắt đầu giảm: thân cây gầy, số rễ/cây giảm, chiều dài rễ/cây tăng, rễ phát triển không đều. Đây là những đặc điểm không có lợi cho cây in vitro khi đưa ra ngoài tự nhiên.
Tóm lại: a-NAA có ảnh hưởng tốt đến sự hình thành rễ của chồi in vitro cây hoa chuông. Để tạo cây hoàn chỉnh trong nhân giống in vitro cây hoa chuông, bổ sung 0,3 mg a-NAA/l vào môi trường cho hiệu quả tốt nhất. 
Từ kết quả thu được, chúng tôi phân tích hồi quy, xác định được mô hình toán học và đồ thị (Phụ lục 4) biểu diễn mối quan hệ giữa nồng độ α-NAA và tỷ lệ ra rễ của chồi in vitro ở tuần thứ 3 như sau:
y1 = - 618,56x12 + 406,19x1 + 39,553 (r1 = 0,946)
y2 = - 547,37x22 + 374,52x2 + 44,3 (r2 = 0,954)
Trong đó: x là nồng độ α-NAA; y: là tỷ lệ ra rễ của chồi in vitro; r: là hệ số tương quan (y1, x1, r1: giống hoa màu đỏ cánh kép; y2, x2, r2: giống hoa màu trắng cánh đơn).
Từ mô hình toán học và hệ số tương quan thu được cho thấy, tỷ lệ ra rễ của chồi in vitro có tương quan rất chặt với nồng độ α-NAA bổ sung vào thành phần môi trường nuôi cấy (r = 0,946 - 0,954). Vì vậy, cần xác định được nống độ α-NAA bổ sung phù hợp để thu được tỷ lệ ra rễ của chồi in vitro cao nhất, đồng thời cây giống in vitro tạo ra có chất lượng tốt. 
* Tóm tắt kết quả nghiên cứu nhân giống cây hoa chuông in-vitro
- Để tạo nguồn vật liệu khởi đầu khi nhân giống in vitro cây hoa chuông, sử dụng đoạn thân mang mắt ngủ và khử trùng mẫu bằng HgCl2 nồng độ 0,1% ở thời gian 10 phút cho kết quả tốt nhất, tỷ lệ mẫu sống đạt 43,33 - 53,33%.
- Thành phần môi trường dinh dưỡng thích hợp để tái sinh chồi là: MS + 1 mg BA/l + 0,02 mg α-NAA/l + 6,5 g agar/l + 30 g saccarose/l. Tỷ lệ mẫu tạo chồi và số chồi/mẫu cao nhất đạt được lần lượt là: 46,67 - 60% và 1,17 - 1,53 chồi.
- Thành phần môi trường dinh dưỡng thích hợp để nhân nhanh chồi là: 
MS + 0,5 mg BA/l + 6,5 g agar/l + 30 g saccarose/l. Hệ số nhân chồi đạt được 5,10 - 7,83 lần, chiều cao chồi 2,30 - 2,34 cm.
- Thành phần môi trường dinh dưỡng để tạo rễ cho cây hoa chuông in vitro có hiệu quả nhất là: MS + 0,3 mg a-NAA/l + 6,5 g agar/l + 30 g saccarose/l. Tỷ lệ chồi ra rễ đạt 100%, cây giống in vitro khỏe, rễ đồng đều nhiều lông tơ.
Tóm lại: Từ các kết quả nghiên cứu thu được, chúng tôi đề xuất quy trình kỹ thuật nhân giống in vitro cây hoa chuông bằng nuôi cấy đoạn thân mang mắt ngủ (Hình 3.1).
Đoạn thân mang mắt ngủ
Tạo chồi 
Nhân nhanh chồi
Tạo cây hoàn chỉnh
 (MS + 1 mg BA/l + 0,02 mg α-NAA/l + 6,5 g agar/l + 30 g saccarose/l) 
 (MS + 0,5 mg BA/l + 6,5 g agar/l + 30 g saccarose/l)
8 tuần
8 tuần
4 tuần
 (MS + 0,3 mg a-NAA/l + 6,5 g agar/l + 30 g saccarose/l)
Hình 3.1. Sơ đồ quy trình kỹ thuật nhân giống in vitro cây hoa chuông bằng nuôi cấy đoạn thân mang mắt ngủ
3.2. Kết quả nghiên cứu xây dựng quy trình kỹ thuật ươm cây giống hoa chuông in vitro giai đoạn vườn ươm
Giai đoạn chuyển cây in vitro từ phòng thí nghiệm (điều kiện nhân tạo) ra vườn ươm (điều kiện tự nhiên) thường gặp rất nhiều khó khăn như: tỷ lệ cây sống rất thấp, cây sinh trưởng kém và sâu bệnh tấn công... Nguyên nhân do cây in vitro đưa ra vườn ươm rất mẫn cảm với môi trường, bộ rễ còn non yếu, điều kiện thời tiết khắc nghiệt và khâu xử lý giá thể trước khi trồng chưa phù hợp Vì vậy, việc xác định được tiêu chuẩn cây giống in vitro trước khi đưa ra vườn ươm, thời vụ trồng, giá thể trồng và chế độ dinh dưỡng hợp lý có ý nghĩa quyết định đến sự thành công của quy trình nhân giống in vitro. 
3.2.1. Nghiên cứu ảnh hưởng của khối lượng cây giống in vitro đến khả năng sinh trưởng của hai giống hoa chuông in vitro giai đoạn vườn ươm
Xác định được tiêu chuẩn cây giống in vitro khi đưa ra vườn ươm có ý nghĩa rất quan trọng, ảnh hưởng đến khả năng sinh trưởng của cây ở vườn ươm và chất lượng cây giống khi xuất vườn ươm. Theo lý thuyết thì những cây có đủ thân, lá, rễ đều có thể đưa ra trồng ở vườn ươm. Tuy nhiên, trong thực tế nhân giống cây in vitro thường gặp hiện tượng: một số cây đưa ra không đủ tiêu chuẩn, cây sinh trưởng yếu ngay từ khi đưa ra trồng và không thể phục hồi để sinh trưởng bình thường ở các giai đoạn sau. Vì vậy, xác định được tiêu chuẩn cây giống in vitro khi đưa ra vườn ươm là việc rất quan trọng, giúp giảm chi phí sản xuất và nâng cao chất lượng cây giống ở giai đoạn vườn ươm và cây thương phẩm ở vườn sản xuất. Trong nghiên cứu này, chúng tôi đã sử dụng các mẫu cây cấy mô có đủ thân, lá, rễ (5 - 7 rễ, 6 - 8 lá), không dập nát, có khối lượng khác nhau và được trồng vào giá thể cát, để đánh giá khả năng sinh trưởng của chúng ở vườn ươm. Kết quả thu được trình bày ở bảng 3.5.
Số liệu bảng 3.5 cho thấy, ở cả hai giống hoa màu đỏ và hoa màu trắng khối lượng cây giống in vitro trước khi ra vườn ươm ảnh hưởng trực tiếp đến tỷ lệ sống cũng như khả năng sinh trưởng phát triển của cây trong giai đoạn vườn ươm. Những cây cấy mô có khối lượng từ 0,2 - 0,5g/cây, khi đưa ra vườn ươm có tỷ lệ sống thấp nhất, chỉ đạt 76,67% (hoa đỏ) và 77.78% (hoa trắng). Các chỉ tiêu sinh trưởng đều rất kém (Bảng 3.5). Sự tăng trưởng các chỉ tiêu sinh trưởng và tỷ lệ sống của cây giống hoa chuông in vitro ở giai đoạn vườn ươm, tăng tỷ lệ thuận với khối lượng cây giống cấy mô từ 0,2 - 0,9g/cây. Những cây in vitro có khối lượng 0,6 - 0,9g/cây, có tỷ lệ cây sống đạt rất cao từ 93,33 - 100% và không có sự sai khác có ý nghĩa với những cây có khối lượng lớn hơn từ 1,0 - 1,5 g/cây. Các chỉ tiêu sinh trưởng thu được: số lá/cây, chiều cao cây và khối lượng tươi đều tăng trưởng rất tốt. Kết quả thu được, phản ánh rõ thực tế các cây giống hoa chuông in vitro có khối lượng quá nhỏ (non) khi đưa ra trồng ngoài vườn ươm thường bị héo, bệnh hại do chưa thích nghi