Luận án Nghiên cứu một số đặc điểm bệnh lý của lợn mắc viêm phổi do Actinobacillus Pleuropneumoniae, Pasteurella Multocida, Streptococcus Suis và sử dụng vacxin phòng bệnh

1. Trình tự mồi dùng để xác định gen omlA của A. pleuropneumoniae 
Gen đích 
Ký hiệu 
mồi 
Trình tự nucleotide (5’-3’) Sản phẩm 
Nhiệt độ 
bắt cặp 
OmlA 
LPF AAGGTTGATATGTCCGCACC 
950 bp 63oC 
LPR CACCGATTACGCCTTGCC 
c. Trình tự mồi xác định P. mutocilda 
Trình tự mồi xác định các serotype giáp mô A, B, D của vi khuẩn 
P. multocida dựa trên phản ứng PCR được mô tả bởi Đỗ Ngọc Thúy & cs. (2007) 
gồm các cặp mồi: CAPA-F và CAPA-R để xác định serotype A, CAPB-F và 
CAPB-R để xác định serotype B, CAPD-F và CAPD-R để xác định serotype D. 
Trình tự cặp mồi và kích cỡ sản phẩm được trình bày ở bảng 3.2. 
40 
Bảng 3.2. Trình tự các cặp mồi dùng để xác định serotype A, D của P. multocida 
Tên mồi Trình tự mồi 
Độ 
đặc hiệu 
Kích 
thước 
Nhiệt độ 
bắt cặp 
CAPA-F 5’- TGCCAAAATCGCAGTGAG-3’ 
Serotype A 1044 bp 
54oC 
CAPA-R 5’- TTGCCATCATTGTCAGTG-3’ 
CAPB-F 5’-CATTTATCCAAGCTCCACC-3’ 
Serotype B 720 bp 
CAPB-R 5’-GCCCGAGAGTTTCAATCC-3’ 
CAPD-F 5’- TTACAAAAGAAAGACTAGGAGCCC-3’ 
Serotype D 657 bp 
CAPD-R 5’- CATCTACCCACTCAACCATATCAG-3’ 
d. Trình tự mồi xác định S. suis 
Mồi của phản ứng PCR: cặp mồi của phản ứng được thiết kế dựa vào chuỗi 
gen mã hoá glutamate dehydrogenase (gdh) đặc trưng cho vi khuẩn S. suis, gồm 1 
mồi xuôi là Str2-F và 1 mồi ngược là Str2-R, được trình bày ở bảng 3.3. 
Bảng 3.3. Trình tự mồi dùng để xác định gen gdh của S. suis theo tiêu chuẩn 
quốc gia- TCVN 8400-2:2010 
Gen 
đích 
Ký hiệu mồi Trình tự cặp mồi (5’ - 3’) 
Kích cỡ sản 
phẩm (bp) 
Nhiệt độ 
bắt cặp 
gdh 
Str2 - F (mồi xuôi) 5’-GCAGCGTATTCTGTCAAACG-3’ 
688 58oC 
Str2 - R (mồi ngược) 5’-CCATGGACAGATAAAGATGG-3’ 
e. Thành phần phản ứng và chu trình nhiệt của phương pháp PCR 
Bảng 3.4. Thành phần phản ứng 
Thành phần Thể tích (µl) 
PCR Master Mix (Thermo) 25 
Mồi xuôi (10pmol/µl) 2 
Mồi ngược (10pmol/µl) 2 
DMSO 2 
Khuôn tổng số 3 
Nước tinh khiết (của kit) 16 
Tổng 50 
Bảng 3.5. Chu trình nhiệt 
Các giai đoạn phản ứng Nhiệt độ Thời gian Số chu kỳ 
Khởi đầu 94 0C 5 phút 1 
Biến tính 94 0C 30 giây 
35 Gắn mồi Tùy cặp thuộc cặp mồi 30 giây 
Kéo dài 72 0C 2 phút 
Kết thúc 72 0C 10 phút 1 
Bảo quản 40C Bảo quản tạm thời 
41 
f. Điện di kiểm tra trên Agarose 1%: 
Sử dụng 10 µl sản phẩm PCR, chạy 30 phút ở hiệu điện thế 110V, 100mA, 
nhuộm Ethidium Bromide 5 phút. 
3.5.2. Phương pháp nghiên cứu đánh giá khả năng ổn định đặc tính sinh học 
của giống sản xuất vacxin phòng bệnh do vi khuẩn A. pleuropneumoniae, 
P. multocida và S. suis gây ra 
3.5.2.1. Phương pháp nuôi cấy vi khuẩn và kiểm tra đặc tính sinh vật, hoá học 
Phương pháp giám định các đặc tính nuôi cấy trên các loại môi trường, đặc 
tính sinh vật hóa học của các chủng vi khuẩn A. pleuropneumoniae, P. multocida 
và S. suis nghiên cứu theo (Moller & cs., 1996; Quinn & cs., 2012) và theo TCVN- 
8685. Bệnh phẩm là phổi, dịch ngoáy vùng hầu họng được cấy sơ cấp lên môi 
trường thạch máu hoặc môi trường thạch chọn lọc Colombia. Sau khi nuôi cấy 
trong tủ ấm có 5% CO2, có thể chọn 1-2 khuẩn lạc nghi ngờ đặc trưng để giám 
định vi khuẩn về mặt hình thái và đặc tính sinh hóa tùy theo loại vi khuẩn. Việc 
kiểm tra đặc tính sinh hóa theo TCVN 8685. 
3.5.2.2. Phương pháp PCR kiểm tra yếu tố độc lực của các chủng vi khuẩn 
a. Quy trình tách ADN tổng số: 
Thực hiện theo mô tả ở phần 3.5.1.2.a 
b. Trình tự mồi xác định yếu tố độc lực của A. pleuropneumoniae 
- Xác định gen sản sinh độc tố (Apx) của vi khuẩn A. pleuropneumoniae bằng 
kỹ thuật PCR theo (Frey & cs., 1995): 
Bảng 3.6. Trình tự các cặp mồi dùng để xác định gen quy định sản sinh ba 
loại độc tố Apx của A. pleuropneumoniae 
Gen đích 
Ký hiệu 
mồi 
Trình tự nucleotide (5’- 3’) 
Sản phẩm 
(bp) 
Nhiệt độ 
bắt cặp 
apxICA 
XICA-F TTGCCTCGCTAGTTGCGGAT 
2420 
62oC 
XICA-R TCCCAAGTTCGAATGGGCTT 
apxIICA 
XIICA-F CCATACGATATTGGAAGGGCAAAT 
2088 
XIICA-R TCCCCGCCATCAATAACGGT 
apxIIICA 
XIIICA-F CCTGGTTCTACAGAAGCGAAAATC 
1755 
XIIICA-R TTTCGCCCTTAGTTGGATCGA 
apxIBD 
XIBD-F GTATCGGCGGGATTCCGT 
1447 
XIBD-R ATCCGCATCGGCTCCCAA 
apxIIIBD 
XIIIBD-F TCCAAGCATGTCTATGGAACG 
968 
XIIIBD-R AACAGAATCAAAATCAGCTTGGTT 
c. Trình tự mồi xác định yếu tố độc lực của P. multocida 
Trình tự mồi được thông tin tương tự ở phần 3.5.1.2.c 
42 
d. Trình tự mồi xác định yếu tố độc lực và serotype của S. suis 
Việc xác định 4 yếu tố gây bệnh của S. suis được thực hiện bằng phản ứng 
Multiplex PCR. Về nguyên tắc, phương pháp này được thực hiện tương tự như 
phương pháp PCR để xác định vi khuẩn S. suis, chỉ khác về thành phần của phản 
ứng và các chu kỳ nhiệt. 
Bảng 3.7. Trình tự các cặp mồi dùng để xác định một số gen mã hoá 
các yếu tố độc lực của S. suis 
Gen 
đích 
Ký hiệu 
mồi 
Trình tự nucleotide (5 ’- 3 ’) 
Sản phẩm 
(bp) 
Nhiệt độ 
bắt cặp 
epf 
 epf-F 
epf-R 
CGCAGACAACGAAAGATTGA 
AAGAATGTCTTTGGCGATGG 
744 
62oC 
sly 
sly-F 
sly-R 
GCTTGACTTACGAGCCACAA 
CCGCGCAATACTGATAAGC 
248 
mrp 
mrp-F 
mrp-R 
ATTGCTCCACAAGAGGATGG 
TGAGCTTTACCTGAAGCGGT 
188 
arc 
arcA-F 
arcA-R 
TGATATGGTTGCTGCTGGTC 
GGACTCGAGGATAGCATTGG 
118 
Bốn serotype S. suis gây bệnh thường gặp nhất ở lợn là serotype 1, 2, 7 và 9 
được xác định bằng phản ứng PCR. 
 Mồi của phản ứng: các cặp mồi dùng để xác định các serotype 1, 2, 7 và 9 
của S. suis được lựa chọn dựa vào chuỗi gen mã hoá quá trình sinh tổng hợp thành 
phần polysaccharide của giáp mô (cps), gồm 4 cặp mồi: cps1J-F và cps1J-R để xác 
định serotype 1, cps2J-F và cps2J-R để xác định serotype 2, cps7H-F và cps7H-R 
để xác định serotype 7, cps9H-F và cps9H-R để xác định serotype 9. 
Bảng 3.8. Trình tự các mồi dùng để xác định các serotype 1, 2, 7, 9 của S. suis 
Serotype 
Ký hiệu 
mồi 
Trình tự nucleotide (5 ’- 3 ’) 
Sản 
phẩm 
(bp) 
Nhiệt độ 
bắt cặp 
1 
cps1J-F 
cps1J-R 
TGG CTC TGT AGA TGA TTC TGC T 
TGA TAC GTC AAA ATC CTC ACC A 
637 
2 
cps2J-F 
cps2J-R 
TTT GTC GGG AGG GTT ACT TG 
TTT GGA AGC GAT TCA TCT CC 
498 
7 
cps7H-F 
cps7H-R 
AAT GCC CTC GTG GAA TAC AG 
TCC TGA CAC CAG GAC ACG TA 
379 62oC 
9 
cps9H-F 
cps9H-R 
GGG ATG ATT GCT CGA CAG AT 
CCG AAG TAT CTG GGC TAC TGA 
303 
43 
e. Thành phần phản ứng và chu trình nhiệt của phương pháp PCR: 
Thực hiện theo thao tác đã mô tả ở phần 3.5.1.2.e 
f. Điện di kiểm tra trên Agarose 1%: 
Thực hiện như đã mô tả ở phần 3.5.1.2.f 
3.5.2.3. Phương pháp kiểm tra yếu tố độc lực của vi khuẩn trên chuột và lợn 
Độc lực của các chủng A. pleuropneumoniae, P. multocida và S. suis trong 
nghiên cứu này, được xác định trên chuột nhắt trắng và trên lợn. Xác định độc lực 
của các chủng A. pleuropneumoniae, P. multocida và S. suis nghiên cứu trên chuột 
nhắt trắng theo phương pháp của (Carter, 1995), tính liều LD50 theo (Reed & 
Muench, 1938). Với mỗi chủng vi khuẩn, sử dụng canh trùng được nuôi cấy ở 
37◦C/24 giờ, riêng với A. pleuropneumoniae nuôi cấy trong điều kiện có 5% CO2 
mỗi một chủng vi khuẩn được tiêm cho 2 chuột thí nghiệm vào dưới da với liều 
0,2 ml/con. Với lợn, mỗi lợn được gây bệnh thực nghiệm ở liều 5 ml/con (Theo 
TCVN 8685). 
3.5.3. Phương pháp nghiên cứu quy trình sản xuất vacxin đa giá vô hoạt nhũ 
dầu phòng bệnh viêm phổi ở lợn do vi khuẩn A. pleuropneumoniae, 
P. multocida và S. suis gây ra 
3.5.3.1. Phương pháp chế tạo vacxin đa giá vô hoạt nhũ dầu 
Giống gốc master seed được lưu giữ tại Trung tâm nghiên cứu phát triển 
vacxin gồm: vi khuẩn A. pleuropneumoniae serotype 2, 5a và 5b; Vi khuẩn 
P. multocida serotype A và D; vi khuẩn S. suis serotype 2. Bộ giống gốc này đang 
được sử dụng để sản xuất vacxin đa giá vô hoạt có bổ trợ keo phèn phòng bệnh 
viêm phổi cho lợn, đã được phép lưu hành trên toàn quốc. Các vi khuẩn của bộ 
giống gốc này có cấu trúc kháng nguyên ổn định, kháng nguyên tính cao, sản sinh 
các loại độc tố và độc lực cao (Hồ sơ đăng ký lưu hành thuốc thú y: Sản phẩm: 
MAR-APPSVAC - vacxin viêm phổi lợn đa giá, 2015). 
Các chủng vi khuẩn được lưu giữ dưới dạng đông khô hay thạch lỏng 
Glycerol (Phần phụ lục). 
- Lấy vi khuẩn A. pleuropneumoniae từ thạch lỏng (hoặc ống giống đã đông 
khô) nuôi cấy trên môi trường thạch PPLO có bổ sung NAD; Vi khuẩn 
P. multocida và S. suis nuôi cấy trên môi trường thạch máu, để ở 370C, với 
A. pleuropneumoniae trong điều kiện có 5% CO2 trong 24 giờ. 
- Chọn khuẩn lạc A. pleuropneumoniae trên thạch PPLO; Vi khuẩn 
P. multocida và S. suis trên môi trường thạch máu cấy vào môi trường TYE, BHI 
44 
hay TSB (giống nhỏ), nuôi cấy lắc ở 370C, trong 6 giờ. Chuyển canh trùng đã nuôi 
cấy lắc: từ 100 ml canh trùng chuyển vào bình có 200 ml TYE, nuôi cấy lắc ở 
370C, trong 10 giờvv, tóm tắt ở sơ đồ (hình 3.1). 
Ghi chú: - TW: Tryptone Water 
 - PLLO: Pleuropneumonia-like organism 
 - BHI: Brain Heart Infusion 
 - TYE: Tryptone Yeast Extract Broth 
- TSB: Tryptic Soy Broth 
- THB: Todd Hewitt Broth 
Hình 3.1. Tóm tắt quy trình sản xuất vacxin viêm phổi đa giá bổ trợ nhũ dầu 
 Kiểm tra an toàn 
Bộ giống gốc 
Thạch máu, thạch PPLO, BHI 
Giống nhỏ: TYE, TSB, THB 
Giống sản xuất: TYE, TSB, THB 
Lên men sục khí: TW, TSB, THB 
Vô hoạt bằng formol 0,3% 
Bổ sung nhũ dầu 25% 
 Dán nhãn thành phẩm 
Ra chai bán thành phẩm 
Kiểm tra vô trùng Kiểm tra hiệu lực 
Kiểm tra thuần khiết 
Kiểm tra thuần khiết 
Đếm số và kiểm tra thuần 
khiết 
Kiểm tra vô trùng 
Kiểm tra vô trùng 
45 
3.5.3.2. Phương pháp kiểm tra chỉ tiêu thuần khiết, vô trùng 
Kiểm tra cảm quan, đậm độ và vô trùng: vacxin được kiểm tra vô trùng 
(không tạp nhiễm vi khuẩn và nấm mốc) theo tiêu chuẩn quốc gia TCVN 8685-
2017 và theo quy trình của Bộ môn Vi trùng, Viện Thú y quốc gia. 
3.5.3.3. Phương pháp kiểm tra chỉ tiêu an toàn 
Kiểm tra an toàn: vacxin được kiểm tra an toàn trên chuột nhắt trắng bằng 
cách tiêm bắp đùi liều 0,5 ml/con. Bên cạnh đó vacxin cũng được kiểm tra an toàn 
trên lợn bằng cách tiêm vacxin liều gấp đôi (4 ml/con) cho lợn 4 tuần tuổi với 
đường tiêm bắp. Theo dõi các phản ứng của chuột nhắt và lợn để xem mức độ an 
toàn của vacxin thử nghiệm. 
3.5.3.4. Phương pháp kiểm tra chỉ tiêu hiệu lực 
a. Kiểm tra trên chuột nhắt trắng bằng phương pháp thay thế: 
Thí nghiệm được bố trí thành 3 lô: 
- Lô 1: Chia 2 nhóm, nhóm thí nghiệm tiêm vacxin cho 15 chuột khỏe mạnh, 
mỗi chuột tiêm 0,2 ml vacxin vào dưới da, lặp lại mũi 2 sau 7 ngày và nhóm đối 
chứng gồm 15 chuột được tiêm nước thịt vô trùng. Sau 21 ngày, tiến hành thử thách 
công cường độc với liều 10LD50 của vi khuẩn A. pleuropneumoniae (LD50 = 4,8 x 
107 CFU/0,2 ml) cho tất cả chuột thí nghiệm và chuột đối chứng. 
- Lô 2: Chia 2 nhóm, cách tiêm như lô 1, nhóm thí nghiệm tiêm vacxin cho 
10 chuột và nhóm đối chứng 10 chuột được tiêm nước thịt vô trùng. Sau 21 ngày, 
tiến hành thử thách công cường độc với liều 10LD50 của vi khuẩn P. multocida 
(LD50 = 4,2 x 107 CFU/0,2 ml) cho tất cả chuột thí nghiệm và chuột đối chứng. 
- Lô 3: Chia 2 nhóm, cách tiêm như ở lô 1 và 2, nhóm thí nghiệm tiêm vacxin 
cho 5 chuột, nhóm đối chứng 5 chuột được tiêm nước thịt vô trùng Sau 21 ngày, 
tiến hành thử thách công cường độc với liều 10LD50 của vi khuẩn S. suis (LD50 = 4,4 
x 107 CFU/0,2 ml) cho tất cả chuột thí nghiệm và chuột đối chứng. 
b. Kiểm tra hiệu lực trên lợn bằng phương pháp trọng tài: 
Vacxin được kiểm tra phải có khả năng tạo đáp ứng miễn dịch đạt hiệu lực ≥ 
70% khi công cường độc. Lợn thí nghiệm là lợn khỏe mạnh, trên 4 tuần tuổi, không 
nhiễm mầm bệnh tự nhiên (âm tính với kháng thể kháng A. pleuropneumoniae, 
P. multocida và S. suis). Thí nghiệm được tiến hành chia lô và tiêm vacxin cho 
lợn như sau: 
+ Lô thí nghiệm: 21 lợn, đánh số tai từ TN1 đến TN21, tiêm vacxin liều sử 
dụng 2 ml/con, tiêm bắp. 
46 
+ Lô đối chứng: 14 lợn, đánh số tai ĐC1 đến ĐC14, tiêm nước thịt vô trùng, 
liều tiêm và đường tiêm tương tự lô thí nghiệm. 
Sau 21 ngày tiêm vacxin và nước thịt vô trùng, công cường độc cho lợn ở lô 
thí nghiệm và lô đối chứng bằng cách tiêm 7 chủng vi khuẩn cường độc tiêu chuẩn 
vào dưới da, mỗi chủng vi khuẩn cho 3 lợn ở lô thí nghiệm và 2 lợn ở lô đối chứng, 
liều 5ml/con, tương đương với liều gây bệnh thực nghiệm là 4,5 x 109 vi khuẩn/ml 
đối với từng loại vi khuẩn A. pleuropneumoniae, P. multocida và S. suis. 
3.5.3.5. Phương pháp đánh giá kiểm tra kháng thể 
Hiệu giá kháng thể chống vi khuẩn A. pleuropneumoniae (serotype 2, 5a, 5b); 
P. multocida (serotype A, serotype D) và S. suis serotype 2 được xác định dựa vào 
tiêu chuẩn quốc gia TCVN 8685-15:2017, tiêu chuẩn ngành TCN 940-2006, tiêu 
chuẩn cơ sở TCCS 02VT-92/KNI và quy trình tại bộ môn Vi trùng, Viện Thú y 
Quốc gia. Hiệu giá kháng thể được biểu thị dưới dạng log2 và được xác định vào 
các thời điểm trước khi tiêm phòng, sau khi tiêm phòng 21 ngày, 2 tháng, 3 tháng, 
4 tháng và 5 tháng. 
a. Phương pháp xác định kháng thể A. pleuropneumoniae bằng ELISA 
- Tên bộ Kit: ID Screen APP 2,5 Indirect; 
- Hãng sản xuất: ID.vet Innovative Diagnostics 
Hóa chất được cung cấp trong bộ Kit 
STT Tên hóa chất 
1 Đĩa đã gắn kháng nguyên APP 2/5 
2 Conjugate (10X) 
3 Đối chứng dương 
4 Đối chứng âm 
5 Dilution Buffer 2 
6 Dilution Buffer 19 
7 Đệm rửa (20X) 
8 Cơ chất 
9 Stop solution (0.5M) 
Lưu ý: Conjugate, các ống đối chứng, cơ chất phải được giữ trong đá gel 
hoặc đá bào (5oC ± 3 oC) trong quá trình thao tác. 
Các hóa chất khác có thể giữ ở 2oC và 26oC. 
Trong bộ Kit ELISA có tên là ID Screen APP 2,5 Indirect của Hãng ID, trong 
mỗi giếng đều gắn 1 số lượng kháng nguyên A.pp nhất định, khi gắn với kháng thể 
kháng A.pp serotype 2 hoặc 5 có trong huyết thanh lợn sẽ cho các kết quả khác 
47 
nhau phụ thuộc vào hàm lượng kháng thể có trong huyết thanh lợn được tiêm 
vacxin. Khi các chỉ số OD và S/P cao chứng tỏ vacxin kích thích cơ thể lợn sinh 
kháng thể tốt hơn. 
- Tiến hành: 
Để các hóa chất và các mẫu huyết thanh ở nhiệt độ phòng (21oC ± 5oC) trong 
30 phút trước khi tiến hành thí nghiệm. Các ống chứa mẫu huyết thanh và các ống 
đối chứng cần được trộn đều bằng máy vortex và spin nhanh trước khi tiến hành 
các phản ứng. Pha loãng Wash solution từ 20X xuống 1X. 
Bước 1: Nhỏ 100 µl đối chứng âm, 100 µl đối chứng dương vào các giếng 
đối chứng. Nhỏ 250 µl dilution buffer 2 và 5 µl mỗi mẫu huyết thanh vào các giếng 
còn lại. 
Bước 2: Ủ 30 phút ± 3 phút ở nhiệt độ phòng 21oC ± 5oC. 
Bước 3: Chuẩn bị 1X Conjugate bằng cách pha loãng Conjugate 10X với tỉ 
lệ 1/10 trong Dilution buffer 19. 
Bước 4: Đổ bỏ dịch. Rửa mỗi giếng 3 lần bằng 1X Wash solution (300 µl/ 
giếng) sử dụng pipet đa kênh.Tránh để giếng khô giữa các lần rửa.Ở lần rửa cuối, 
đảo ngược giếng rồi vỗ mạnh vào giấy khô. 
Bước 5: Bổ sung 100 µl 1X conjugate vào mỗi giếng. Ủ 30 phút ± 3 phút ở 
nhiệt độ phòng 21oC ± 5oC. 
Bước 6: Lặp lại bước 4 
Bước 7: Bổ sung 100 µl cơ chất vào mỗi giếng. Ủ 15 phút ± 2 phút ở nhiệt 
độ phòng 21oC ± 5oC trong tối (phủ giấy bạc kín các giếng). 
Bước 8: Thêm 100 µl Stop solution vào mỗi giếng. 
Đọc kết quả OD ở bước sóng 450 nm. Kết quả có ý nghĩa khi: 
- Giá trị OD của đối chứng dương lớn hơn 0,35: OD(PC) > 0,350 
- Tỉ số giá trị OD của đối chứng âm và đối chứng dương nhỏ hơn 0,3: OD 
(NC)/OD (PC) < 0,3 
- S/P % = [(OD mẫu – OD chứng âm)/ (OD chứng dương – OD chứng âm)] *100 
S/P Kết quả 
S/P % < 30 % Âm tính 
30% ≤ S/P % < 40 % Nghi ngờ 
S/P % ≥ 40 % Dương tính 
Lưu ý: - Conjugate, các ống đối chứng, cơ chất phải được giữ trong đá gel 
48 
hoặc đá bào (5oC ± 3 oC) trong quá trình thao tác. Các hóa chất khác có thể giữ ở 
2oC và 26oC. 
b. Phương pháp đánh giá hàm lượng kháng thể kháng P. multocida và S. suis bằng 
phản ứng ngưng kết chậm 
- Chuẩn bị kháng nguyên thân (KNO - Somatic antigen- KN xử lý axít HCL 
1N): Cấy 0,01 ml vi khuẩn P. multocida hay S.suis vào môi trường thạch máu, ủ 
ở tủ ấm 37°C trong 24 h. Chọn khuẩn lạc điển hình trên môi trường thạch rồi cấy 
vào môi trường nước thịt BHI hay TSB (ống 4 ml), rồi ủ ở tủ ấm 37°C trong 24h. 
Láng 4 ml canh trùng lên 2 đĩa thạch máu, hút bỏ dịch còn thừa đi, rồi ủ ở tủ ấm 
37°C trong 24 h. Thu hoạch vi khuẩn sau khi láng trên mặt thạch máu bằng cách 
dùng 5ml PBS rửa bề mặt hai đĩa thạch, hút huyễn dịch vi khuẩn thu được vào 
ống nghiệm. Nhỏ 0,02 ml Formaldehyde solution 37% vào huyễn dịch vi khuẩn 
thu được rồi ủ ở tủ ấm 37°C trong 24 h, sau đó đem kiểm tra vô trùng huyễn dịch 
vi khuẩn. Huyễn dịch vi khuẩn đạt chỉ tiêu vô trùng sẽ được ly tâm bằng máy ly 
tâm với tốc độ 12000 rpm trong 20 phút ở nhiệt độ 4°C, thu lấy cặn, hoàn nguyên 
lại bằng 20 ml EDTA 1%, lắc đều rồi ủ ở tủ ấm 37°C trong 24 h. Sau đó tiếp tục 
ly tâm huyễn dịch vi khuẩn bằng máy ly tâm với tốc độ 12000 rpm trong 20 min 
ở nhiệt độ 4°C, cặn thu được sẽ rửa bằng 5 ml PBS có bổ sung 0,3% 
Formaldehyde solution, lặp lại 2 lần. Tiếp tục ly tâm huyễn dịch vi khuẩn bằng 
máy ly tâm với tốc độ 12000 rpm trong 20 phút ở nhiệt độ 4°C, cặn thu được sẽ 
được hoàn nguyên bằng 5 ml PBS để thu hoạch kháng nguyên. Kiểm tra kháng 
nguyên xem có tự ngưng kết không, kháng nguyên đạt yêu cầu khi không có hiện 
tượng ngưng kết. 
- Chuẩn bị huyết thanh kiểm tra: Lấy máu động vật, chắt lấy huyết thanh. Sau 
đó khử bổ thể bằng cách đun ở nồi cách thủy ở nhiệt độ 56°C trong 30 phút. 
- Cách tiến hành: Quy trình cho phản ứng ngưng kết chậm với kháng nguyên 
O (kháng nguyên Somatic) thực hiện trên đĩa 96 giếng đáy chữ U. 
Thực hiện thí nghiệm theo sơ đồ phản ứng ngưng kết chậm như sau. 
49 
+ Đối với các giếng thí nghiệm: cho dung dịch PBS vào các dãy giếng thí 
nghiệm trên đĩa 96 đáy chữ U (50 μl/giếng). Thêm vào giếng đầu tiên 50 μl 
huyết thanh và pha loãng huyết thanh theo cơ số 2. Nhỏ vào các giếng 50 μl 
kháng nguyên. 
+ Đối chứng âm: 50 μl dung dịch PBS + 50 μl kháng nguyên. 
+ Đối chứng dương: 50 μl dung dịch PBS + 50 μl huyết thanh tối miễn dịch 
và pha loãng theo cơ số 2 + 50 μl kháng nguyên 
+ Lắc nhẹ cho đều rồi dính băng dính để ở tủ ấm 37°C qua đêm 
- Đọc kết quả: Phản ứng âm tính: kháng nguyên lắng tròn đáy giếng. Phản 
ứng dương tính: xảy ra hiện tượng ngưng kết, kháng nguyên ngưng kết thành cụm 
lấm tấm xung quanh giếng. Đọc hiệu giá ngưng kết: hiệu giá ngưng kết được đánh 
giá ở độ pha loãng cao nhất còn có phản ứng ngưng kết xảy ra. 
c. So sánh hiệu giá kháng thể kháng vi khuẩn A. pleuropneumoniae, P. multocida 
và S. suis của vacxin đa giá bổ trợ keo phèn và vacxin đa giá bổ trợ nhũ dầu 
Chúng tôi sử dụng 13 lợn không tiêm vacxin có kháng nguyên 
A. pleuropneumoniae, P. multocida và S. suis để tiến hành so sánh hiệu giá kháng 
thể kháng vi khuẩn A. pleuropneumoniae, P. multocida và S. suis của vacxin đa 
giá có bổ trợ keo phèn và vacxin đa giá có bổ trợ nhũ dầu. 
Lợn thí nghiệm được chia ra 3 lô: 
Lô 1: có 5 lợn, được tiêm vacxin đa giá có bổ trợ keo phèn, với ký hiệu TN1 đến 
TN5. 
Lô 2: có 5 lợn, được tiêm vacxin đa giá có bổ trợ nhũ dầu, ký hiệu TN6 đến 
TN10. 
Lô 3: có 3 lợn đối chứng, được tiêm nước sinh lý, với ký hiệu TN11 đến 
TN13. Huyết thanh của lợn sau khi tiêm vacxin 21 ngày, sử dụng để xác định hàm 
lượng kháng thể hình thành trong máu sau khi tiêm vacxin 21 ngày 
3.5.3.6. Phương pháp xác định liều vacxin đa giá phòng bệnh viêm phổi lợn 
Nhằm xác định liều tiêm vacxin đa giá phòng bệnh viêm phổi ở lợn phù hợp 
để có hiệu lực bảo hộ đàn lợn sau khi tiêm vacxin cao nhất và có độ dài miễn dịch 
dài nhất như sau: Lô lợn thí nghiệm gồm 15 con, chia làm 3 nhóm khác nhau, mỗi 
nhóm lợn thí nghiệm có 5 lợn 6 tuần tuổi. Tiến hành tiêm cho lợn như sau: 
- Nhóm 1: tiêm vacxin đa giá viêm phổi lợn 1 mũi với liều tiêm 2 ml/con 
tiêm bắp. 
50 
- Nhóm 2: tiêm vacxin đa giá viêm phổi lợn 2 mũi với liều tiêm 1 ml/con/mũi 
cách nhau 7 ngày, tiêm bắp. 
- Nhóm 3: tiêm vacxin đa giá viêm phổi lợn 2 mũi, với liều tiêm 2 ml/con 
/mũi cách nhau 7 ngày, tiêm bắp. 
Lợn thí nghiệm được đánh số từ KT1 đến KT15. Trong đó: từ KT1 đến KT5 
là lợn nhóm 1, từ KT6 đến KT10 là lợn nhóm 2 và từ KT11 đến KT15 là lợn thuộc 
nhóm 3. Trước khi tiêm vacxin tiến h