Luận án Nghiên cứu một số đặc tính sinh học của vi rút gây hoại tử thần kinh và tạo kháng nguyên tái tổ hợp làm nguyên liệu sản xuất vắc-xin phòng bệnh cho cá mú (Epinephelus spp.)

ừ mạch khuôn RNA của NNV để tạo cDNA 
và giai đoạn khuếch đại đoạn cDNA tạo nên số bản sao cần thiết. 
2.3.1.6 Điện di axit nucleic trên gel agarose 
Dùng phương pháp của Sambrook J và Russel DW (2001) [61]. 
Lấy một thể tích mẫu (chứa khoảng 1-2 μg DNA), trộn với loading sau đó tra 
vào các giếng của gel. Chạy điện di ở hiệu điện thế 110 V, thời gian 20-30 
phút. Lấy bản gel tráng rồi quan sát và chụp ảnh dưới ánh sáng tia tử ngoại có 
bước sóng λ=260 nm. 
2.3.1.7 Phương pháp tách dòng gen: 
Dùng phương pháp của Sambrook J và Russel DW (2001) [61] 
* Phương pháp tinh sạch DNA không sử dụng gel agarose. 
- Trộn đều hỗn hợp: sản phẩm RT-PCR, Sodium acetate 3M (lượng 
20% so với lượng sản phẩm RT-PCR), isopropanol (lượng bằng 80-100% so 
với lượng sản phẩm RT-PCR). Đặt tube chứa hỗn hợp trên ở -20oC trong 25 
phút. Ly tâm 10.000 vòng/phút trong 30 phút, thu cặn (sản phẩm RT-PCR kết 
tủa). Rửa với ethanol 70%, ly tâm 10.000 vòng/phút trong 10 phút, thu cặn. 
Khi cồn khô hết thì hòa sản phẩm vào 50 µl H2O, bảo quản ở -20
o
C. 
* Phương pháp tạo plasmid tái tổ hợp mang gen T4. 
- Phân cắt plasmid pGEM-T bằng enzyme giới hạn 
Thành phần phản ứng bao gồm: H2O (2 μl): đệm cho EcoRI hoạt động 
(1 μl): EcoRI (1 μl): pGEMT (6 μl). Ủ ở 37oC từ 2,5 đến 3 giờ. Điện di trên 
gel agarose 1% để kiểm tra kết quả. 
- Ghép nối gen T4 vào pGEM-T: Hỗn hợp phản ứng bao gồm các 
thành phần: H2O (6 μl): T4 DNA (1 μl): pGEM-T Easy (1 μl): Ligate Buffer 
42 
(1 μl): T4 Ligase (1 μl). Thực hiện phản ứng trong tube đã thanh trùng, ủ 
tube ở 160C trong 14 giờ. Sau đó bảo quản ở 40C. 
* Phương pháp chuyển vector tái tổ hợp vào tế bào khả biến E. coli 
Dùng phương pháp của Sambrook J và Russel DW (2001) [61] 
a) Chuẩn bị tế bào khả biến với tế bào chủ là E. coliJM109 . 
- Chủng vi khuẩn E. coliJM109 được cấy ria trên môi trường LB đặc và 
nuôi qua đêm ở 370C. Lấy một khuẩn lạc đơn vào 20ml môi trường LB lỏng, 
lắc qua đêm ở 370C, 200 lần/phút. 
- Chuyển 1ml dịch nuôi trên sang 50 ml môi trường LB lỏng, lắc tiếp 
khoảng 3h đến khi OD600nm đạt 0,4 - 0,6 thì chuyển dịch nuôi cấy sang ống ly 
tâm đã giữ lạnh trên đá 15 phút. Ly tâm 4000 vòng/phút, ở 40C trong 10 phút 
rồi bỏ dịch nổi và thu sinh khối vi khuẩn. 
- Hòa sinh khối tế bào với 20 ml nước cất đã vô trùng để lạnh (hòa tan 
thật nhẹ nhàng bằng pipette). Sau đó ly tâm 3500 vòng/phút trong 10 phút ở 
4
0C. Loại bỏ dịch nổi thu sinh khối tế bào. 
- Hòa sinh khối tế bào với 15 ml CaCl2 0,1 M đã thanh trùng để lạnh, 
hòa nhẹ nhàng, để trên đá lạnh khoảng 2 đến 5 phút. Sau đó ly tâm 3000 
vòng/ phút trong 10 phút ở 40C, loại bỏ dịch thu sinh khối tế bào. 
- Hòa tan tế bào vào 1 ml dung dịch CaCl2 0,1M có bổ sung 15% 
glycerol đã vô trùng để lạnh, để trên đá 30 phút. Sau đó đảo trộn nhẹ nhàng, 
chia ra các ống eppendorf mỗi ống 100 µl, bảo quản ở -80oC. 
b) Biến nạp bằng phương pháp sốc nhiệt. 
- Bổ sung 5 µl sản phẩm nối gen vào ống tế bào khả biến và để 30 phút 
trên đá lạnh. 
- Sốc nhiệt 420C trong 45 giây, giữ trên đá 3 phút. Sau đó bổ sung 500 
µl môi trường LB lỏng và nuôi lắc ở 370C trong 1 giờ. 
c) Chọn lọc tế bào mang plasmid tái tổ hợp bằng phương pháp sàng lọc xanh 
- trắng. 
43 
- Cấy trang 100 μl hỗn hợp biến nạp trên môi trường LB rắn có bổ 
sung Ampicillin (100 µg/ml), X-gal, IPTG. Nuôi trong tủ ấm 370C thời gian 
từ 14 đến 16 giờ. 
 - Toàn bộ khuẩn lạc phát triển trên môi trường có ampicillin đều là 
khuẩn lạc mang vector plasmid. Những khuẩn lạc xanh không có đoạn gen 
được xen vào. Lựa chọn khuẩn lạc trắng mang plasmid tái tổ hợp trên vi 
khuẩn E. coli 
* Phương pháp tách plasmid từ vi khuẩn E. coli 
Dùng phương pháp của Sambrook J và Russel DW (2001) [61] 
Vi khuẩn được nuôi trong môi trường LB đặc và nhân lên đến cuối giai 
đoạn log. Tế bào được phá vỡ bằng kiềm và các chất tẩy mạnh, plasmid được 
thu lại bằng cách tủa với ethanol. 
- Nuôi E. coli ở điều kiện 370C, lắc 200 vòng/phút qua đêm. 
- Ly tâm 10.000 vòng/phút trong 6 phút, 4
oC. Loại bỏ dịch thu sinh 
khối tế bào. 
- Hòa tan tế bào trong 200 µl Solution I, hòa tan nhẹ nhàng bằng 
pipette. 
- Bổ sung 400 µl Solution II, đảo thật nhẹ nhàng. 
- Bổ sung 200 µl Solution III đảo nhẹ nhàng đến khi xuất hiện kết tủa, 
để yên khoảng 2 đến 3 phút. Sau đó ly tâm 10.000 vòng/phút trong 10 phút, 
4
o
C, hút 500 µL dịch nổi vào eppendorf mới. 
- Bổ sung 500 µl isopropanol vào eppendort chứa dịch, ly tâm 10.000 
vòng/phút, 4
oC. Loại bỏ dịch thu cặn chính là DNA kết tủa. 
- Bổ sung 1ml ethanol 70% vào eppendort chứa cặn, ly tâm 10.000 
vòng/phút trong 10 phút, 4
oC, bỏ dịch thu cặn, thực hiện 2 lần liên tục như 
thế. 
- Khi cồn khô hết, bổ sung H2O để hòa tan DNA và bảo quản ở -20
0
C. 
Sản phẩm tách được kiểm tra trên gel agarose 0,8%. 
44 
* Phương pháp kiểm tra plasmid tái tổ hợp. 
Các dòng mang vector tái tổ hợp sau khi được xác định sẽ được kiểm 
tra bằng enzyme giới hạn và phản ứng PCR. 
a) Phản ứng PCR master mix. 
- Thành phần: 
Thành phần phản ứng Nồng độ Thể tích (µl) 
Master mix 2X 25 
H2O - 22 
Primer 1 0,5 
Primer 2 0,5 
Plasmid tái tổ hợp 2 
Tổng số 50 
 - Chu kỳ nhiệt của phản ứng: 94oC trong 7 phút, 94oC trong 45 giây, 
60
o
C trong 45 giây, 72
oC trong 50 giây; lặp lại chu kỳ trên 30 lần; 72oC trong 
5 phút cho kết thúc ở vòng cuối cùng. 
b) Cắt plasmid bằng enzyme giới hạn. 
 Thành phần phản ứng cắt bằng enzyme EcoRI 
 Phản ứng cắt bằng EcoRI để kiểm tra sự có mặt của T4. Thành phần 
phản ứng gồm: H2O (2 μl): đệm cho EcoRI hoạt động (1 μl): EcoRI (1 μl): 
pGEM-T (6 μl). Ủ ở 37oC từ 2,5 đến 3 giờ. Điện di trên gel agarose 1% để 
kiểm tra kết quả. 
 * Phương pháp tinh sạch DNA bằng gel agarose. 
Plasmid tái tổ hợp sau phản ứng cắt bởi enzym giới hạn được tiến hành 
tinh sạch theo PureLink® Quick Gel Extraction Kit có trong bộ TOPO® TA 
Cloning Kit của hãng Invitrogen: 
1. Cắt phần gel agarose có chứa đoạn DNA mong muốn. 
2. Cân lát gel rồi hòa tan với dịch đệm (GS1) có trong bộ kit với tỉ lệ 
10: 60 (mg/ µl) trong ống vô trùng 5ml. 
45 
3. Ủ ở 50°C trong 15 phút, cứ 3 phút lại lắc đều để gel agarose tan chảy 
hết. 
4. Làm tan gel với dung dịch đệm TE ở 65°C- 75°C. 
5. Hút 400 µl hỗn hợp dịch agarose vào cột lọc. 
6. Bổ sung 500 µl Gel Solubilization Buffer vào cột, trộn đều rồi ủ ở 
nhiệt độ phòng, ly tâm 12.000 vòng/phút trong 1 phút, loại bỏ dịch phía dưới. 
7. Bổ sung 700 µl washing buffer vào cột và ủ ở nhiệt độ phòng trong 5 
phút. 
8. Ly tâm 12.000 vòng/phút trong vòng 1 phút, đổ bỏ dịch, chuyển cột 
tinh sạch sang eppendorf 1,5 ml. 
9. Bổ sung 50 µl TE buffer vào cột, ủ ở nhiệt độ phòng trong 1 phút. 
10. Ly tâm 12.000 vòng/phút trong 2 phút, loại bỏ cột tinh sạch, thu 
các eppendorf chứa DNA tinh sạch, bảo quản ở -20°C 
* Phương pháp giải trình tự gen bằng máy tự động 
Gen T4 trên gel được tinh sạch và xác định trình tự bằng máy giải trình 
tự gen tự động ABI 3100 (Applied Biosystems). Quy trình được thực hiện 
theo bộ Kit BigDye Terminator v3.1 Cycle Sequencing. Sử dụng phần mềm 
Blast để xác định mức độ tương đồng của trình tự gen T4 thu được với các 
trình tự của GenBank. 
2.3.2. Phương pháp xác định đặc tính sinh học của vi rút gây hoại tử thần 
kinh (NNV) 
2.3.2.1. Phương pháp xác định độc lực của vi rút trên tế bào GS1 
- Độc lực của vi rút được xác định bằng phương pháp chuẩn độ trên đĩa 
nhựa 96 giếng. 
Trước khi chuẩn độ 1 ngày, đĩa nhựa 96 giếng được cấy mỗi giếng 
khoảng 7x104 tế bào GS1. Dịch vi rút được tiến hành pha loãng từ 10-1 đến 
10
-9
 với môi trường Leibovitz’s 15 (10% FCS). 
- Mỗi độ pha loãng cấy vào 4 giếng, mỗi giếng cấy 0,1 ml dịch vi rút. 
Giữ khay đã cấy ở nhiệt độ 28oC để vi rút hấp phụ lên tế bào. Sau 2 giờ, hút 
46 
hết dịch trong các giếng và chuyển vào mỗi giếng 0.5 ml môi trường 
Leibovitz’s 15 (10% FCS). Bọc khay lại và để ở nhiệt độ 28oC trong tủ ấm 
CO2 0,5%. 
- Quan sát và đếm số giếng có CPE trong 5 ngày. 
Khả năng gây bệnh của vi rút trên tế bào GS1 được đánh giá qua chỉ số 
TCID50 (nồng độ gây chết 50% tế bào). Áp dụng phương pháp chuẩn độ của 
Reed và Muench (1938) [57] để xác định TCID50 
 LgTCID50= lgA+ x1lgf 
LgTCID50= lgA+ x2lgf 
Trong đó: f là hệ số pha loãng 
A1: tỷ lệ cận trên có bệnh tích A: độ pha loãng với tỷ lệ cận trên có bệnh tích 
B1: tỷ lệ cận dưới có bệnh tích B: độ pha loãng với tỷ lệ cận dưới có bệnh tích 
2.3.2.2. Phương pháp xác định độc lực của vi rút trên cá mú 
- Bố trí thí nghiệm: Từ kết quả thí nghiệm xác định độc lực của vi rút 
trên tế bào, tiến hành lựa chọn một số chủng NNV có độc lực cao và độc lực 
thấp trên tế bào để thí nghiệm xác định độc lực của các chủng NNV trên cá 
mú. 
Dịch vi rút được pha loãng từ 10-1 đến 10-9, mỗi độ pha loãng vi rút 
tiêm 30 cá mú con có kích thước 1,5-2 cm, mỗi độ pha loãng lặp lại 3 lần. 
Liều tiêm dịch vi rút: 0,1 ml/con và tiêm vào dưới gốc vây đuôi. Lô đối chứng 
cá được tiêm nước muối sinh lý. Sau tiêm truyền, theo dõi cá sau 6 giờ đến 5 
ngày để quan sát các biểu hiện lâm sàng, tỷ lệ chết, kiểm tra gen mã hóa 
kháng nguyên T4 của NNV. 
Khả năng gây bệnh của vi rút trên cá mú được đánh giá bằng liều gây 
chết 50% cá thí nghiệm: LD50 (Lethal Dose). LD50 được tính dựa theo phương 
pháp của Reed và Muench (1938) [57]. 
47 
 LgLD50 = αlgb + lgc
Trong đó: 
 b = Độ pha loãng của vi rút, trong thí nghiệm này b = 1/10 (10-1); 
c = Độ pha loãng vi rút gây tỉ lệ chết cận trên 50%. 
2.3.2.3 Thí nghiệm ảnh hưởng của nhiệt độ đến khả năng gây nhiễm của vi 
rút trên tế bào GS1 
 Lựa chọn 1 chủng vi rút (QN4) có chỉ số TCID50 cao để nghiên cứu ảnh 
hưởng của nhiệt độ đến khả năng gây nhiễm của NNV trên tế bào GS1. 
Chủng NNV được gây nhiễm vào tế bào GS1 với mật độ tế bào ban đầu là 
22x10
2
 tế bào/mm2. Tế bào gây nhiễm NNV được nuôi cấy ở 4 ngưỡng nhiệt 
độ: 17, 22, 27 và 32oC, liều gây nhiễm là liều TCID50 = 10
-6,8
. Sau 5 ngày 
nuôi cấy tiến hành đánh giá CPE và xác định mật độ tế bào còn sống sót. Thí 
nghiệm được bố trí theo hình 2.2. 
Hình 2.2. Thí nghiệm ảnh hưởng của nhiệt độ đến khả năng gây nhiễm 
của vi rút trên tế bào 
48 
2.3.2.4. Thí nghiệm ảnh hưởng của nhiệt độ đến khả năng gây nhiễm của 
vi rút trên cá mú 
 Thí nghiệm được trình bày ở hình 2.3. 
Hình 2.3. Thí nghiệm ảnh hưởng của nhiệt độ đến khả năng gây nhiễm 
của vi rút trên cá mú 
NNV chủng QN4 có liều LD50 cao (10
-7,5) được chọn để gây nhiễm vào 
cá mú con bằng phương pháp tiêm dưới gốc vây đuôi. Bố trí 3 bể nuôi cá thí 
nghiệm, mỗi bể tiêm 30 cá mú. Lô đối chứng cá được tiêm môi trường 
Leibovit’z 15. Cá được nuôi trong 2 điều kiện nhiệt độ là: 280C (cả ngày đêm) 
và 28
0
C (ban ngày)/24
0C (ban đêm). Theo dõi cá, xác định tỷ lệ chết và sự có 
mặt của gen T4 sau 15 ngày. 
2.3.3. Nhóm các phương pháp biểu hiện gen mã hóa kháng nguyên và 
đánh giá khả năng tạo kháng thể của kháng nguyên tái tổ hợp 
2.3.3.1 Chuẩn bị vector pET32a+ để thực hiện phản ứng nối gen 
 Vector pET32a
+
 sẽ được cắt mở vòng bởi enzyme BamHI và EcoRI để 
có thể nhận đoạn gen T4. Phản ứng cắt được thực hiện với thành phần: H2O 
(7,6 μl): Buffer (1μl): EcoRI (0,4 μl): pET32a+ (1 μl). Ủ ống phản ứng ở 37oC 
trong 3 giờ. 
49 
2.3.3.2 Nối gen T4 vào vector pET32a+ 
 Phản ứng được thực hiện với thành phần như sau: H2O (6 μl): T4 DNA 
(1 μl): vector pET32a+(1 μl): Ligate Buffer (1 μl): T4 Ligate (1 μl). Ủ ống 
phản ứng ở 4oC từ 14 đến 16 giờ. 
2.3.3.3 Chuyển gen vào E. coliJM109 
 Sử dụng phương pháp sốc nhiệt để đưa vector tái tổ hợp mang gen T4 
(pET32a
+
-T4) vào tế bào vi khuẩn E. coli. Các bước thực hiện như sau: 
Lấy 1 khuẩn lạc E. coliJM109 nuôi trong 20 ml LB lỏng ở điều kiện 
37
0C, lắc 200 vòng/phút, qua đêm. 
Lấy 0,5 ml canh trường E. coli chuyển sang bình 50 ml LB, nuôi ở điều 
kiện 370C, lắc 200 vòng/phút, từ 1 đến 3 giờ đến khi đạt OD từ 0.4 đến 0.6. 
Chuyển sang ống ly tâm 50 ml để trên đá 30 phút. Sau đó ly tâm 4.000 
vòng/phút/4
0C trong 10 phút. Bỏ dịch nổi và thu sinh khối vi khuẩn. 
Hòa sinh khối tế bào với 20 ml nước cất đã vô trùng để lạnh. Sau đó ly 
tâm 3500 vòng/phút/4
0C trong 10 phút. Loại bỏ dịch nổi thu sinh khối tế bào. 
Hòa sinh khối tế bào với 15 ml CaCl2 0.1 M đã thanh trùng để trên đá 
khoảng 2 đến 5 phút. Sau đó ly tâm 3000 vòng/phút/40C trong 10 phút, loại 
bỏ dịch thu sinh khối tế bào. 
Hòa tan tế bào trong 1 ml dung dịch (CaCl2 0,1 M có bổ sung 15% 
glycerol) đã vô trùng để lạnh trên đá 30 phút. Sau đó đảo trộn, chia ra các ống 
eppendorf, mỗi ống 100 µl, bảo quản ở -200C. 
 - Thực hiện chuyển gen: Trộn 4 µl sản phẩm nối gen vào ống tế bào E. 
coliJM109 khả biến, đảo trộn bằng pipette, ủ trên đá 30 phút, sốc nhiệt ở 42oC 
trong thời gian 1 phút. Lập tức chuyển sang ủ trên đá 10 phút. Bổ sung 600 µl 
LB lỏng, nuôi lắc 200 vòng/ phút ở 37oC trong thời gian 1 giờ. Sau đó cấy 
trang dịch tế bào lên môi trường LB rắn có bổ sung kháng sinh Ampicillin với 
nồng độ 100 µg/ml, nuôi ở 37oC trong thời gian từ 14 đến 16 giờ. 
50 
2.3.3.4. Tách chiết plasmid từ các khuẩn lạc sau biến nạp chuẩn bị cho 
kiểm tra bằng PCR và enzyme giới hạn. 
a, Tách chiết plasmid 
- Nuôi E. coli ở điều kiện 370C, lắc 200 vòng/phút với thời gian từ 14 
đến 16 giờ. Sau đó ly tâm 10.000 vòng/phút/4oC trong 6 phút. Loại bỏ dịch 
thu sinh khối tế bào. 
- Hòa tan tế bào trong 200 µl Solution I, hòa tan nhẹ. 
- Bổ sung 400 µl Solution II, đảo nhẹ. 
- Bổ sung 200 µl Solution III đảo nhẹ đến khi xuất hiện kết tủa, để yên 
khoảng 2 đến 3 phút. Sau đó ly tâm 10.000 vòng/phút/4oC trong 10 phút, hút 
500 µL dịch nổi vào eppendorf mới. 
- Bổ sung 500 µl isopropanol lạnh vào eppendort chứa dịch, đảo đều, 
để yên từ 1 đến 2 phút, ly tâm 10.000 vòng/phút/4oC. Loại bỏ dịch nổi, thu 
cặn (DNA kết tủa). 
- Bổ sung 1 ml ethanol 70% lạnh vào eppendort chứa cặn, ly tâm 
10.000 vòng/phút/4
o
C trong 10 phút, bỏ dịch nổi, thu cặn. Thực hiện 2 lần 
liên tục. 
- Đợi cồn bay hơi đến khô, bổ sung H2O de-ion để hòa tan DNA . 
- Bảo quản ở -200C. 
b, Kiểm tra bằng PCR và enzyme giới hạn 
 - Kiểm tra bằng PCR: Phản ứng PCR sẽ khuếch đại đoạn gen T4 (nếu 
có) trong plasmid tách chiết được. Thành phần phản ứng được thực hiện như 
sau: 
STT Thành phần Thể tích (µl) 
1 Master mix 2x 25 
2 H2O 22 
3 Primer 1 0,5 
4 Primer 2 0,5 
5 DNA template 2 
 Tổng số 50 
51 
 Chu trình nhiệt của phản ứng: 94oC trong 5 phút, 94 oC trong 30 giây, 
60
 o
C trong 30 giây, 72
 o
C trong 30 giây; lặp lại chu kỳ trên 30 lần; 72 oC 
trong 5 phút và giữ ở 4 oC. Sản phẩm của phản ứng sẽ được kiểm tra bằng 
điện di trên gel agarose 1%. 
 Kiểm tra bằng enzyme giới hạn: 
 Plasmid sau tách chiết được sử sụng làm nguyên liệu cho phản ứng cắt 
bằng các enzyme giới hạn BamHI và EcoRI để kiểm tra sự có mặt của đoạn 
gen T4 trong các plasmid. Phản ứng cắt được thực hiện với thành phần: H2O 
(7,6 μl): Buffer (1 μl): EcoRI (0,4 μl): DNA plasmid (1 μl). 
2.3.3.5 Nuôi cấy E. coliBL21 mang plasmid tái tổ hợp pET32a+-T4 
 E. coliBL21 mang plasmid tái tổ hợp pET32a+-T4 được nuôi cấy hoạt 
hóa trong môi trường LB lỏng qua đêm ở 37oC, nuôi lắc 200 lần/phút. Theo 
hướng dẫn của hãng Novagen, điều kiện biểu hiện ban đầu được đưa ra là 
hoạt hóa vi khuẩn để OD đạt khoảng 0,6 – 0,8 thì cảm ứng bằng IPTG ở nồng 
độ 0,6 - 1 mM, nuôi lắc 37oC, sau 3 đến 4 giờ protein sẽ được biểu hiện. 
Protein tái tổ hợp sẽ được kiểm tra điện di SDS-PAGE và Western blot. 
2.3.3.6 Phương pháp điện di SDS-PAGE 
 Pha lớp Separating gel 10% (5 ml) với tỷ lệ như bảng sau 
Acrylamide stock solution 30% 1,67 ml 
Tris-HCl 1 M, pH 8.8 1,9 ml 
H2O 1,33 ml 
Trộn đều dung dịch của lớp gel separating sau đó hút và bơm dịch vào 
buồng gel tới khi mức gel cách mép trên bản thuỷ tinh 1,5 cm. 
- Phủ 1 lớp nước hoặc n-propanol lên trên bề mặt lớp gel vừa đổ, quá 
trình polymer hoá sẽ hoàn thành khoảng 1 giờ, đổ bỏ lớp nước phía trên. 
52 
- Tiếp tục pha gel Stacking 5% (2 ml) theo tỷ lệ như sau: 
Acrylamide stock solution 30% 330 µl 
Tris-HCl 1 M, pH 6.8 250 µl 
H2O 1,38 ml 
SDS 10% 20 µl 
AP 10% 20 µl 
TEMED 2 µl 
 - Đổ tiếp lớp gel stacking lên trên cho tới khi đầy buồng gel, đặt lược 
tạo giếng. Quá trình polymer hoá gel khoảng 30 phút. Khi bản gel đã hoàn 
thành, toàn bộ bản gel được đặt trong buồng điện di có chứa dung dịch điện di 
và rút lược tạo giếng. 
- Nhỏ mẫu: Kháng nguyên sau khi đã pha loãng ở các nồng độ khác 
nhau, mỗi giếng nhỏ 15-20 µl kháng nguyên và 10 µl marker chuẩn. Mẫu 
trước khi nhỏ cần được biến tính ở 100oC trong 5 phút. 
- Chạy điện di ở hiệu điện thế 120 -180 V (thường là ở 150 V), đến khi 
màu thuốc nhuộm chạy đến chân bản gel tách. 
- Nhuộm bản gel bằng Coomassie blue R–250 0,1% (Methanol: glacial 
acetic acid: nước = 4:1:5) ở nhiệt độ phòng trong 30 phút và lắc. 
- Tẩy màu bằng dung dịch tẩy (Methanol: glacial acetic acid: nước = 
1:1:8) lắc, thay dịch tẩy khoảng 2 – 3 lần đến khi thấy các vạch xuất hiện. 
Dựa vào kích thước kháng nguyên trên bản gel để bước đầu kiểm tra 
kháng nguyên tạo ra có phải là kháng nguyên T4 mong muốn hay không. 
2.3.3.7. Phương pháp Western blot 
Phức hợp protein T4 đã có được sau tinh sạch, được phân tách bằng 
điện di gel SDS-PAGE, ủ gel trong transfer buffer trong 10 phút. 
- Cắt các mảnh giấy lọc và màng PVDF theo kích thước bản gel. Ủ các 
mảnh giấy lọc và miếng xốp trong dung dịch đệm 10 phút. Ủ màng PVDF 
trong methanol trong 1 phút. 
53 
- Xếp xen kẽ bản gel và màng PVDF giữa xốp và giấy theo thứ tự (cao 
su/giấy/gel/màng/giấy/cao su) và kẹp chặt lại cùng với nhau đảm bảo không 
có bọt khí lọt vào giữa gel và màng. 
- Chuyển protein từ gel SDS-PAGE lên màng PVDF bằng dòng điện 
200 mA, ở 40oC trong 2 giờ. 
- Rửa màng PVDF 3 lần, mỗi lần khoảng 5 phút với TBS và cố định 
với 3% BSA trong 2 giờ 
- Ủ màng với T4 Antibody trong 3% BSA ở 40oC từ 14 đến 16 giờ. 
- Rửa màng PVDF 3 lần, mỗi lần khoảng 10 phút với TBST. 
- Ủ màng với HRP AffiniPure Goat Anti-Mouse IgG trong 3% BSA 
trong 2h. 
- Rửa màng PVDF 3 lần mỗi lần rửa khoảng 10 phút với TBST. 
- Sử dụng kit DAB để hiện màu. 
2.3.3.8. Phương pháp đánh giá khả năng tạo kháng thể trung hòa của 
kháng nguyên tái tổ hợp 
a, Đánh giá khả năng tạo kháng thể trung hoà của kháng nguyên tái tổ hợp 
trên thỏ. Thí nghiệm được bố trí như sau: 
Thỏ thí nghiệm có khối lượng từ 1,8- 2 kg, thỏ khỏe sạch bệnh và được 
nuôi ổn định trong 1 tuần thì tiến hành gây miễn dịch bằng phương pháp tiêm. 
+ Đối chứng dương: huyết thanh thỏ khỏe, sạch bệnh, không có kháng 
thể đặc hiệu với NNV được ủ với chủng NNV cường độc QN2 (hiệu giá vi rút 
là 10
4 
TCID50) rồi hấp phụ vào tế bào GS1 hoặc gây nhiễm vào cá mú con (≤ 
5 g) bằng phương pháp tiêm (liều 0,05 ml dịch NNV cường độc QN2 liều 103 
LD50
) 
+ Đối chứng âm: huyết thanh thỏ khỏe, sạch bệnh được gây miễn dịch 
với vi khuẩn E.coliBL21- pET32a+- T4 và kháng nguyên tái tổ hợp được pha 
loãng theo hệ số 10 rồi hấp phụ vào tế bào GS1 (in vitro) hoặc gây nhiễm vào 
cá mú con khối lượng ≤ 5 g (in vivo) bằng phương pháp tiêm. 
54 
+ Lô thí nghiệm: huyết thanh thỏ được gây miễn dịch với vi khuẩn E. 
coli BL21- pET32a
+
-
 T4 và kháng nguyên tái tổ hợp pha loãng theo hệ số 10 
được ủ với chủng NNV cường độc QN2 (hiệu giá vi rút 104 TCID50
 rồi hấp 
phụ vào tế bào GS1 hoặc gây nhiễm vào cá mú con (≤ 5 g) bằng phương 
pháp tiêm (liều 0,05 ml dịch NNV cường độc QN2 liều 103 LD50). 
Phản ứng trung hòa NNV được thực hiện trên tế bào GS1 theo hướng 
dẫn của Virology methods manual (Brian và cộng sự, 1996) [22]: 
Bước 1: Chuẩn bị tế bào 
Bước 2 : Chuẩn bị vi rút 
Bước 3: Trung hòa NNV cường độc với các loại huyết thanh ở 280C 
sau 12h. 
Bước 4 : Gây nhiễm trở lại dịch trung hòa vi rút lên tế bào GS1 
Bước 5: Đánh giá kết quả 
- Âm tính: Nếu các giếng phản ứng không có biểu hiện bệnh tích tế bào; 
các bể nuôi cá thí nghiệm không có cá chết hoặc tỷ lệ chết nhỏ hơn 5%. 
- Dương tính: toàn bộ các giếng phản ứng có bệnh tích tế bào ở tất cả các 
độ pha loãng huyết tha