Luận án Nghiên cứu một số hoạt tính sinh học của cao chiết chứa alkaloid và flavonoid chiết tách từ rễ cây khổ sâm (sophora flavescens ait.) trồng tại Tây Nguyên

hình mác dài 3 - 4 cm, r ng 1 - 2 cm, 
dốc thuôn đầu nhọn hoặc hơi t mặt trên nhẵn, mặt ƣ i có lông mịn màu xám 
(Hình 3.1 A và B). Hoa màu vàng nhạt, đ i 5 răng h nh chuông tr ng 5 c nh không 
đều, nhị 10, rời nhau, bầu có lông mịn và cụm hoa mọc ở kẽ lá hoặc đầu cành thành 
chùm dài 10 - 20 cm (Hình 3.1 C). Quả dạng đậu, thắt lại giữa các hạt, hình thuôn 
dài 5 - 12 cm, đƣờng kính 5 - 8 mm, đầu có mỏ thuôn dài; hạt 3-7, hình cầu, màu 
đen. 
Rễ hình trụ dài, vỏ ngoài màu vàng trắng. Rễ có hình trụ i thƣờng phân 
nhánh ở phần ƣ i, dài 10 – 30 cm đƣờng kính 1 – 6,5 cm (Hình 3.1 D). Phía trong 
41 
có màu nâu xám hoặc vàng xám, có nhiều nếp nhăn theo chiều dọc, có những ch 
lồi ra ngoài giống tế bào khí khẩu xếp nằm ngang. Vỏ ngoài mỏng, hầu hết bị rách 
ra và uốn cong ngƣ c lại, dễ bị tróc ra, bề mặt tiếp xúc m u v ng v trơn nhẵn. Thể 
trạng cứng, khó bẻ gãy. Mặt cắt ngang của rễ có màu trắng hơi v ng v i c c đƣờng 
vân chạy từ tâm ra ngo i đôi khi thấy có các bó mạch bất thƣờng sắp xếp thành các 
v ng đồng tâm hoặc rải rác không theo trật t nào cả (Hình 3.1 F). Mùi dịu nhẹ, vị 
c c đắng. B t có màu vàng nhạt m i thơm nhẹ và vị rất đắng (Hình 3.1 H). 
Hiện nay, chuyên luận trong DĐVN V [96] m i chỉ đề cập t i Khổ sâm cho 
lá và cành (Croton tonkinensis Gagnep) và không có chuyên luận về rễ Khổ sâm. 
Kết quả mô tả c c đặc điểm thân, hoa, lá và rễ của cây Khổ sâm đƣ c trồng tại Đắk 
Nông phù h p v i mô tả trong chuyên luận của DĐTQ [5]. 
3 1 1 2 Đị h h i ằ g h ử 
B ng 3.1: Kết quả search last NCBI 
TT 
Kí 
hiệu 
Lo i định 
danh 
Mã số lƣu trữ 
trong ngân 
h ng ữ liệu 
gene 
% phủ 
Mức đ 
tƣơng 
đồng 
Tỷ lệ 
nucleoti 
tƣơng 
đồng 
1 T1 
Sophora 
flavescens 
AB127037.1 93 % 96 % 569/595 
Cây Khổ sâm trồng tại Đắk Nông đƣ c định danh loài thông qua tr nh t 
gene đƣ c th c hiện bởi Công Ty TNHH Dịch Vụ v Thƣơng Mại Nam Khoa ằng 
phƣơng ph p Sanger tr n m y 3130XL của AIB. 
Trình t gene của cây Khổ sâm trồng tại Đắk Nông có 640 nucleotide và 
đƣ c trình bày trong (Phụ lục 1). Thông qua thƣ viện Basic Local Alignment 
Search Tool (BLAST) và th c hiện thuật toán dò tìm theo xác xuất để kiểm tra trình 
t nucleotide [108], cây Khổ sâm trồng tại Đắk Nông đƣ c định danh thu c loài 
Sophora flavescens, có mã số lƣu l AB127037.1 v có 595 nucleoti e trong chu i 
trình t gene. Phân tích x c định trình t DNA là m t trong những kĩ thuật hiện đại 
nhất v có đ tin cậy cao nhất trong phân tích đ nh gi ƣ c liệu. Kết quả phân tích 
có đ phù h p cao khi đối chiếu giữa trình t DNA th c nghiệm v i trình t DNA 
42 
tr n thƣ viện BLAST có tỷ lệ tƣơng đồng là 569 trên tổng số 595 nucleotide v đạt 
đ phủ t i 93 %. 
 Từ các kiểm tra đã th c hiện, kết luận ƣ c liệu đang nghi n cứu đúng l 
 ƣ c liệu Khổ sâm (Sophora flavescens Ait.). 
3.1.2. Đánh giá chất lượng dược liệu 
3.1.2.1. Soi b và vi h ặ ắ g g 
Hình 3.2: (A) Tinh b t vi phẫu và (B) vi phẫu mặt cắt ngang rễ Khổ sâm 
L p bần gồm 4 - 8 hàng tế bào xếp song song. Kế tiếp là l p mô mềm mỏng 
chứa nhiệu tinh b t tinh b t có hình cầu nhỏ hoặc hình elipse chứa các sẹo, v i 
đƣờng kính kính trong khoảng 5 – 35 µm. Tia libe r ng và tách biệt v i tầng phát 
sinh libe-g đƣ c sắp xếp th nh c c v ng gi n đoạn, phân biệt rõ vùng libe và vùng 
g . Tầng g phân nhánh thành 2 – 4 đƣờng hƣ ng ra ngoài, có mạch g sắp xếp 
xuyên tâm và có các tia g r ng có khả năng phân iệt rõ. 
43 
B t rễ Khổ Sâm Bó có mang tinh thể 
 Tinh thể Calcium oxalate Mảnh mô mềm có tế bào thành mỏng 
 Mạch vạch Tinh b t 
 Bó s i Mảnh bần 
Hình 3.3: M t số thành phần b t rễ Khổ sâm quan s t ƣ i kính hiển vi quang học 
(X10) 
44 
Khi quan sát dƣ i kính hiển vi quang học, tiêu bản thấy có rất nhiều s i 
th nh y thƣờng tập h p thành bó có thể mang tinh thể; mảnh bần; mảnh mô mềm 
có các tế bào thành mỏng. Tế bào mô cứng màu vàng nhạt, thành dày. Tinh thể 
calcium oxalate hình khối đơn lẻ hay tập trung th nh đ m. Mảnh mạch phần l n là 
mạch vạch. Kết quả vi phẫu và soi b t mặt cắt ngang rễ Khổ sâm đƣ c trồng tại 
Đắk Nông phù h p v i mô tả trong chuyên luận của DĐTQ [5] và ấn bản kiểm 
nghiệm ƣ c liệu bằng phƣơng ph p hiển vi. 
3.1.2.2. Ph g ới N OH 
Hình 3.4: Phản ứng v i NaOH của rễ Khổ sâm phơi khô 
Khi thêm NaOH 40 % lên bề mặt cắt ngang của rễ, ở phần vỏ xuất hiện màu 
đỏ-cam và từ từ chuyển th nh m u đỏ máu, bền trong m t thời gian dài; phần lõi 
không đổi màu (Hình 3.4). Kết quả ghi nhận đƣ c phù h p v i mô tả trong chuyên 
luận của DĐTQ [5]. 
3.1.2.3. Đị h g ẩ (LOD), h A (%) ổ g h hiế 
 E (%) 
Đ ẩm ƣ c liệu đƣ c th c hiện theo (Mục 2.2.1) và tính toán theo (Công 
thức 2.1). Kết quả th c nghiệm là 8,5 % trình bày trong phù h p v i quy định của 
DĐTQ là không quá 11,0 %. 
Tro toàn phần của ƣ c liệu đƣ c th c hiện theo (Mục 2.2.1) và tính toán 
theo (Công thức 2.2). Quy định của DĐTQ là không quá 8,0 %. Kết quả th c 
nghiệm là 4.6 % thể hiện s phù h p về hàm lƣ ng tro toàn phần so v i giá trị quy 
định nêu trên. 
45 
Tổng chất chiết đƣ c từ ƣ c liệu đƣ c th c hiện theo (Mục 2.2.1) và tính 
toán theo (Công thức 2.3). Kết quả th c nghiệm tổng chất chiết là 21,8 % phù h p 
v i quy định của DĐTQ là không nhỏ hơn 20 0 %. 
B ng 3.2: Kết quả đ ẩm, tro toàn phần và tổng chất chiết của nguyên liệu 
Chỉ ti u Khối lƣ ng c c giai đoạn Kết quả 
(%) 
Trung bình 
(%) 
SD 
mo (g) m (g) m2 (g) 
Đ ẩm 
LOD (%) 
28,3855 1,0206 29,3207 8,4 
8,5 0,01 33,6478 1,0031 34,5650 8,6 
30,3948 1,0355 31,3430 8,4 
Tro toàn 
phần 
A (%) 
34,7527 2,0005 34,8535 4,6 
4,6 0,04 34,0474 2,0042 34,1493 4,7 
34,7283 2,0028 34,8286 4,6 
Tổng chất 
chiết đƣ c 
E (%) 
34,7146 3,9994 34,8734 21,7 
21,8 
0
0,10 
34,1614 4,0149 34,3222 21,9 
34,5023 4,0096 34,6624 21,8 
Nhƣ đã tr nh y DĐVN chƣa có chuyên luận về rễ Khổ sâm cho rễ. Trong 
khi đó DĐTQ có chuy n luận riêng về tiêu chí chất lƣ ng đ ẩm, tro toàn phần, 
tổng chất chiết đƣ c của rễ Khổ sâm nhƣng không có hƣ ng dẫn định lƣ ng. Do đó 
c c ti u chí n y đƣ c định lƣ ng và tiến h nh theo hƣ ng dẫn chung đƣ c nêu trong 
DĐVN V cho đối tƣ ng mẫu ƣ c liệu. Các kết quả th c nghiệm đƣ c đối chiếu so 
sánh v i yêu cầu đƣ c n u trong DĐTQ để đ nh gi chất lƣ ng ƣ c liệu v đều 
đạt yêu cầu. 
3.1.2.4. Đị h h Matrine và oxymatrine 
Tiến hành sắc ký l p mỏng theo (Mục 2.2.1.1), kết quả hiện màu bản mỏng 
đƣ c thể hiện trên (Hình 3.5) 
46 
Hình 3.5: Kết quả định tính alkaloid trong ƣ c liệu 
Kết quả định tính m t số alkaloid đƣ c thể hiện trong (Hình 3.5). Mẫu thử 
dịch chiết ƣ c liệu cho các vết trên sắc ký l p mỏng có giá trị Rf và màu sắc tƣơng 
t v i giá trị Rf và màu sắc các vết matrine, oxymatrine chuẩn. Matrine và 
oxymatrine đƣ c xem nhƣ l c c chất đ nh ấu sinh học cho rễ Khổ sâm và kết quả 
sắc ký bản mỏng hoàn toàn phù h p v i mô tả trong chuyên luận của DĐTQ [5]. 
3.1.2.5. Đị h g Matrine và Oxymatrine ằ g h ơ g h HPL -UV 
B ng 3.3: Chƣơng tr nh pha đ ng HPLC-UV phân tách matrine và oxymatrine 
Th i gian ph t) Pha A* (% v/v) Pha B** (% v/v) 
0,0 92,5 7,5 
15,0 10,0 90,0 
15,1 0,0 100,0 
19,0 0,0 100,0 
19,1 92,5 7,5 
25,0 92,5 7,5 
* : pha A là hệ đệm HCl/triethylamine , pH =3; **: pha B là acetonitrile 
Theo DĐTQ pha đ ng acetonitrile và hệ đệm 0.3 % phosphoric acid 0.3 % 
triethylamine (4:96, v/v) đƣ c sử dụng trong phân tách matrine và oxymatrine trên 
hệ sắc ký pha đảo. Theo nghiên cứu đã công ố của Wentao Bi cùng c ng s [98], 
để h tr quá trình phân tách matrine và oxymatrine trên c t sắc ký pha đảo cần 
47 
thành phần phần pha đ ng chứa chất ghép cặp ion nhƣ trifluoroacetic aci . Keli 
cùng c ng s [109] sử dụng triethylamine che các tâm sillanol t do trên c t sắc ký 
để loại trừ tƣơng t c thứ cấp giữa gốc silanol t do trên c t v i các tâm –N- trên cấu 
trúc của matrine và oxymatrine. Nếu tƣơng t c thứ cấp xảy ra mũi sắc ký của 
matrine và oxymatrine có hiện tƣ ng kéo đuôi gây khó khăn cho qu tr nh định 
lƣ ng. Từ c c định hƣ ng tr n đề tài sử dụng hệ pha đ ng chứa hệ đệm 
HCl/triethylamine, pH =3 cho phân tách matrine và oxymatrine trên c t sắc ký pha 
đảo. Thông qua các khảo s t thăm chƣơng tr nh pha đ ng bằng c ch tăng tuyến 
tính tỉ lệ pha acetonitrile từ 5 % t i 100 % trong thời gian 20 phút chƣơng tr nh pha 
đ ng đƣ c điều chỉnh cho s phân tách matrine và oxymatrine trên c t sắc ký pha 
đảo (Bảng 3.3). 
Hình 3.6: Phƣơng tr nh đƣờng chuẩn matrine và oxymatrine 
D ng đƣờng tuyến tính giữa diện tích mũi sắc ký và nồng đ c c điểm 
chuẩn đƣờng chuẩn của matrine và oxymatrine thể hiện trên (Hình 3.6) cho thấy hệ 
số tƣơng quan R2 đều đạt 0 9994. Điều này cho thấy phƣơng tr nh đƣờng chuẩn 
y = 1x + 0 
R² = 0,9994 
0
200
400
600
800
0 200 400 600 800
C (ug/mL) 
Diện tích Đƣ ng chuẩn matrine 
y = 1x + 4E-08 
R² = 0,9994 
0
200
400
600
800
0 200 400 600 800
C (ug/mL) 
Diện tích 
Đƣ ng chuẩn oxymatrine 
48 
hoàn toàn phù h p v đạt yêu cầu cho phân tích định lƣ ng matrine và oxymatrine 
từ các mẫu ƣ c liệu. 
Kh o sát dung môi chiết xu t 
Tiến hành khảo s t điều kiện chiết xuất cao toàn phần v i 100 mL hệ dung 
môi EtOH : H2O trong đó tỉ lệ EtOH tăng ần từ 60 % (v/v) đến 90 % (v/v). Th c 
hiện quy trình xử lý mẫu, thông số HPLC đƣ c nêu trong (mục 2.2.2) và m i thí 
nghiệm đƣ c th c hiện lặp ba lần. Kết quả h m lƣ ng matrine và oxymatrine trong 
c c cao tƣơng ứng đƣ c trình bày trong (Bảng 3.4), 
B ng 3.4: Khảo sát tỉ lệ dung môi EtOH chiết matrine và oxymatrine từ rễ Khổ sâm 
Tỉ lệ EtOH 
% (v/v) 
Hàm lƣợng matrine 
(µg/mL) 
Hàm lƣợng oxymatrine 
(µg/mL) 
60 56,2 ± 3,6 3,7 ± 1,1 
70 61,3 ± 3,2 3,5 ± 1,0 
80 93,9 ± 1,2 6,27 ± 0,69 
90 79,8 + 1,5 4,77 ± 0,78 
B ng 3.5: Các thông số thẩm định phƣơng ph p HPLC-UV x c định matrine và 
oxymatrine. 
Thông số Matrine Oxymatrine 
Thời gian lƣu (phút) 10,912 12,948 
Khoảng tuyến tính (µg/mL) 10,0-600,0 10,0-600,0 
Phƣơng tr nh đƣờng chuẩn Y=X Y=X
R
2
 0,9994 0.9994 
% RSD 2,8 3,5 
HSTH trung nh (%) mức th m 10 µg/g 91,0 88,3 
HSTH trung nh (%) mức th m 50 µg/g 94,1 95,1 
HSTH trung nh (%) mức th m 100 µg/g 102,6 99,7 
SD 0,61 1,4 
LOD (µg/g) 2,0 4,5 
LOQ (µg/g) 6,1 14 
49 
Khi tăng ần tỉ lệ dung môi EtOH từ mức 60 % (v/v) đến 80 % (v/v), kết quả 
cho thấy tại tỉ lệ EtOH 80 % có h m lƣ ng matrine và oxymatrine lần lƣ t là 93,89 
µg/mL và 6,7 µg/mL cao hơn so v i các tỉ lệ EtOH khác. Tiếp tục tăng tỉ lệ EtOH 
lên 90 % (v/v) nhận thấy h m lƣ ng matrine và oxymatrine có xu hƣ ng giảm v i 
kết quả lần lƣ t là 79,8 µg/mL và 4,77 µg/mL. Theo định hƣ ng tách chiết và tinh 
chế đơn chất matrine và oxymatrine, dung môi EtOH 80 % đƣ c sử dụng trong quy 
trình chiết xuất cho c c ƣ c khảo sát tiếp theo. 
Kết quả thẩm định phƣơng ph p cho thấy phƣơng ph p HPLC-UV định 
lƣ ng matrine v oxymatrine có đ chính xác % RSD lần lƣ t là 2,8 % và 3,5 %. 
Đ đúng của phƣơng ph p d a trên phần trăm hiệu suất thu hồi (% HSTH) của các 
mẫu ƣ c liệu thêm chuẩn matrine và oxymatrine có các giá trị trung bình lần lƣ t 
là 95,9 % và 94,4 % (Bảng 3.5). Đây l cơ sở quan trọng trong định hƣ ng tách 
chiết các cao chiết phân đoạn từ lƣ ng l n ƣ c liệu Khổ sâm cho các n i dung tiếp 
theo của đề t i. Đặc biệt là n i ung điều chế matrine và oxymatrine tinh khiết, 
cũng nhƣ c c thử nghiệm của cao chiết phân đoạn trên các tế bào HepG2 và BT474. 
 Quy trình phân tích HPLC-UV đã thẩm định trên mẫu ƣ c liệu đƣ c áp 
dụng cho phân tích định lƣ ng matrine và oxymatrine trong các cao chiết phân 
đoạn. Qua đó nhằm định hƣ ng chọn cao chiết chứa h m lƣ ng l n hai chất trên 
cho n i dung tinh chế chất tinh khiết bằng sắc ký điều chế. 
3.2. Kết quả tách chiết một số hoạt chất chính trong rễ Khổ sâm 
3.2.1. Phân lập Matrine và Oxymatrine bằng phƣơng pháp sắc ký điều chế 
3.2.1.1 Th hiế h 
H m lƣ ng matrine trong cao CHCl3 527,7 mg/g cao hơn gần gấp 5 lần so 
v i h m lƣ ng matrine trong cao EtOH 80 % (107,4 mg/g) v h m lƣ ng 
oxymatrine trong cao CHCl3 30,5 mg/g cao hơn gần gấp 5 lần so v i h m lƣ ng 
oxymatrine trong cao EtOH 6,79 µg/mg. C n h m lƣ ng các alkaloid này trong cao 
EA không đ ng kể v đây l phân đoạn cao giàu flavonoid. 
Cao phân đoạn đƣ c phân tích HPLC-UV để x c định h m lƣ ng matrine và 
oxymatrine và chọn cao phân đoạn cho c c ƣ c tinh sạch và tinh chế matrine và 
oxymatrine ở c c ƣ c sau. Quá trình chiết tách trên khối lƣ ng mẫu ƣ c liệu l n 
có s thay đổi về kết quả định lƣ ng matrine và oxymatrine trong cao chiết EtOH. 
50 
Tuy nhiên, trong quá trình tinh chế đơn chất, có m t số ti u chí đƣ c th c hiện nhƣ 
sau: 
B ng 3.6: H m lƣ ng matrine và oxymatrine trong cao phân đoạn EtOH 80 %, EA, 
CHCl3 v cao nƣ c 
Nguyên liệu Khối 
lƣợng g) 
Hàm lƣợng 
matrine 
(mg/g) 
Hàm lƣợng 
oxymatrine 
(mg/g) 
B t rễ Khổ 
sâm 
100 18,78* 1,25* 
EtOH 80 % 16,12 107,4 6,79 
CHCl3 3,2 527,7 30,5 
EA 2,51 7,0 KPH (< LOD) 
Nƣ c 10,57 KPH (< LOD) KPH (<LOD) 
((*) tính toán d a trên kết qu trình bày trong (B ng 3.6) và KPH là không phát 
hi n) 
- Không cần chiết kiệt nhằm giảm thiểu lƣ ng tạp chất trong dịch chiết. 
- Cần làm giàu matrine, oxymatrine và làm sạch thành phần nền mẫu trƣ c 
khi tiến hành sắc ký điều chế. 
- Hứng chất rửa giải từ 50 % mũi sắc ký phía trƣ c t i 50 % mũi sắc ký phía 
sau để đảm bảo s tinh khiết của chất tinh chế ở mức cao nhất. 
Nhƣ vậy, cao chiết phân đoạn CHCl3 đƣ c sử dụng cho c c ƣ c tinh sạch 
và tinh chế matrine và oxymatrine ở ƣ c tiếp theo. 
3.2.1.2. Ti h h hiế 
Kết quả trình bày trong (Bảng 3.7) cho thấy, tại 1 mL dịch rửa giải đầu tiên 
chứa h m lƣ ng matrine và oxymatrine thấp. Do đó 1 mL MeOH chứa 5 % NH3 
đầu ti n đƣ c sử dụng làm dung dịch rửa tạp chất khỏi dịch chiết. Lƣ ng matrine và 
oxymatrine xuất hiện phần l n trong 2 mL rửa giải tiếp theo, nên 2 mL MeOH chứa 
5 % NH3 đƣ c sử dụng làm dịch rửa giải matrine và oxymatrine khỏi dịch chiết. 
51 
B ng 3.7: Tối ƣu l m sạch dịch chiết ƣ c liệu trên c t OASIC MCX, sử 
dụng 200 mg cao CHCl3 cho ƣ c khảo sát này. 
Lần rửa giải bằng 
MeOH chứa NH3 
Thể tích 
rửa giải 
Hàm lƣợng 
matrine 
(µg/mg) 
Hàm lƣợng 
oxymatrine 
(µg/mg) 
Lần 1 1 mL 5,4 0,08 
Lần 2 1 mL 20,6 1,54 
Lần 3 1 mL 63,1 3.28 
Lần 4 1 mL 10,2 0,8 
Lần 5 1 mL 1,5 0,01 
Lần 6 1 mL Không phát hiện 
(<LOD) 
Không phát hiện 
(<LOD) 
Trong nghiên cứu của Wentao Bi cùng c ng s [98] sử dụng c t chiết pha 
rắn (SPE) v i thành phần amino-imidazolium polymer hình thành các liên kết 
hy rogen v tƣơng t c - nhằm h tr quá trình tách các tạp chất trong nền mẫu. 
Hình 3.7: Cấu trúc pha tĩnh c t OASIS MCX 
Tuy nhiên, nghiên cứu này ứng dụng cho phân tích định lƣ ng matrine và 
oxymatrine trong mẫu ƣ c liệu. Trong quá trình tinh sạch mẫu cho mục đích tinh 
chế, cần c t chiết SPE có ung lƣ ng c t cao hơn để có thể xử lý lƣ ng mẫu l n. 
Do đó c t chiết OASIS MCX v i thành phần là polymer polystyren– divinylbenzen 
52 
có gắn thêm nhóm chức sulfonic aci tr n v ng thơm đƣ c sử dụng cho mục đích 
tinh sạch cao chiết matrine và oxymatrine. 
C t SPE làm sạch bằng đa cơ chế có mô h nh pha đảo v tƣơng t c trao đổi 
ion, khoảng pH r ng từ 1 - 14. Ngo i c c tƣơng t c không phân c c trong cấu trúc 
vòng của matrine và oxymatrine v i pha tĩnh ịch chiết ƣ c liệu đƣ c điều chỉnh 
về pH acid bằng H2SO4 để h tr quá trình chuyển trạng thái matrine và oxymatrine 
mang điện tích ƣơng tr n c c tâm –N- l m tăng khả năng lƣu giữ trên c t theo 
tƣơng t c điện tích. Quá trình rửa giải matrine và oxymatrine khỏi c t đƣ c th c 
hiện bằng dung môi hữu cơ trong môi trƣờng kiềm. Tiến hành rửa giải lần lƣ t 1 
mL MeOH chứa 5 % NH3 và phân tích matrine, oxymatrine trong dịch rửa giải 
nhằm chọn đƣ c điều kiện rửa giải thu đƣ c nhiều matrine và oxymatrine nhất. 
3.2.1.3. Ti h hế matrine và oxymatrine ằ g ắ i hế 
Hình 3.8: Sắc ký đồ điều chế matrine và oxymatrine 
Dịch rửa giải từ quá trình tinh sạch dịch chiết bằng SPE đƣ c tiêm vào hệ 
thống HPLC điều chế để phân lập matrine và oxymatrine tinh khiết và tiến hành qua 
hai giai đoạn nhƣ sau: 
Gi i n 1: kh o sát các thông s sắc ký 
C c mũi sắc ký (H nh 3.8) đƣ c hứng phân đoạn vào các ống hứng riêng 
biệt. Tiếp theo, tiêm từng phân đoạn thu đƣ c vào hệ thống HPLC-MS để nhận diện 
vị trí rửa giải của matrine và oxymatrine trên hệ thống sắc ký điều chế. Matrine 
53 
đƣ c rửa giải trong khoảng thời gian 10,2 – 11,4 phút và thời gian lƣu tại 10,5 phút, 
oxymatrine đƣ c rửa giải trong khoảng thời gian 14,0 – 15,5 phút và thời gian lƣu 
tại 14,3 phút. 
C c phân đoạn hứng đơn chất sau quá trình sắc ký điều chế cần đƣ c làm 
khan ho n to n để tăng đ tinh khiết của tinh chất. Do đó chƣơng tr nh pha đ ng 
đƣ c c i đặt sao cho phân đoạn tinh chất matrine và oxymatrine nằm trong thành 
phần pha đ ng chứa lƣ ng l n dung môi hữu cơ. 
Sau m t số khảo s t chƣơng tr nh pha đ ng thăm chƣơng tr nh pha đ ng 
đƣ c trình bày trong (Bảng 2.2) cho thấy s phân tách tốt giữa matrine và 
oxymatrine v i các thành phần nền. Hơn nữa mũi sắc ký của oxymatrine đƣ c rửa 
giải gần 15 phút, tại thời gian có tỉ lệ pha đ ng chứa 90 % (v/v) dung môi hữu cơ. 
Gi i n 2: tinh chế i e i e ơ h t. 
Th c hiện tiêm 3 lần tiêm mẫu vào máy sắc ký điều chế theo chƣơng tr nh tối 
ƣu. Để thu đƣ c matrine v oxymatrine có đ tinh khiết cao, th c hiện hứng phân 
đoạn tại thời điểm 50 % chiều cao mũi sắc ký phía trƣ c t i 50 % chiều cao mũi sắc 
ký phía sau. Toàn b phân đoạn matrine v oxymatrine thu đƣ c, tiến hành thổi 
bằng ng khí nito để đuổi b t lƣ ng dung môi hữu cơ. Th c hiện chiết phân l p 
bằng CHCl3 để chuyển matrine và oxymatrine qua hữu cơ. Cô quay chân không để 
loại CHCl3 và thu phần rắn còn lại chứa đơn chất matrine và oxymatrine. 
Chất chuẩn tinh khiết là hóa chất không thể thiếu trong các nghiên cứu hóa 
học, sinh học ƣ c học và nhiều nghành khoa học khác. Các chất chuẩn tinh khiết 
đa số có giá thành cao, thời gian đặt hàng từ 1 – 2 tháng, gây ảnh hƣởng nhiều t i 
kinh phí, tiến đ nghiên cứu và không chủ đ ng đƣ c trong các nghiên cứu chuyên 
sâu hơn khi cần lƣ ng l n chất chuẩn tinh khiết. Do đó chủ đ ng đƣ c các chất 
chuẩn tinh khiết là rất cần thiết. C c phƣơng ph p phân lập chất bằng sắc ký c t 
silica hoặc C18 đƣ c sử dụng phổ biến tại các phòng thí nghiệm h p chất t nhiên ở 
Việt Nam o chi phí đầu tƣ thấp và dễ th c hiện. Tuy nhiên, thời gian chạy sắc ký 
c t kéo dài và cần lƣ ng l n dung môi hữu cơ sử dụng cho quá trình phân lập chất. 
Trong đề tài này, hệ thống sắc ký điều chế đƣ c sử dụng do có nhiều ƣu 
điểm trong quá trình phân lập chất nhƣ: 
- Phân lập đồng thời nhiều h p chất trên m t lần chạy mẫu trong m t khoảng 
thời gian ngắn. 
54 
- Dung lƣ ng c t điều chế l n cho phép tiêm thể tích mẫu l n giúp phân lập 
đƣ c lƣ ng l n chất tinh khiết trong m t lần chạy mẫu. 
- Sử dụng lƣ ng nhỏ dung môi trong quá trình phân tách chất trên c t. 
Các thao tác hứng chất phân lập đƣ c th c hiện t đ ng khi thiết bị sắc ký 
điều chế đƣ c tích h p v i b phận hứng mẫu t đ ng. Các chất phân lập đƣ c 
hứng vào các ống nghiệm sạch và tiến hành nhận danh và kiểm tra đ tinh sạch 
bằng thiết bị sắc ký lỏng ghép nối đầu dò khối phổ phân giải cao (HPLC-HRMS). 
Đ tinh sạch đƣ c x c định thông qua phần trăm iện tích mũi tr n sắc ký đồ và các 
m/z xuất hiện trên phổ khối. 
3.2.1 4 iể i h hiế ủ matrine và oxymatrine i h hế 
Hình 3.9: Sắc ký đồ và phổ khối HRMS kiểm tra đ tinh khiết của matrine điều chế. 
55 
Hình 3.10: Sắc ký đồ và phổ khối HRMS kiểm tra đ tinh khiết của oxymatrine điều 
chế 
Hòa tan 1,0 mg matrine và oxymatrine tinh chế đƣ c bằng MeOH và tiêm 
vào hệ thống HPLC-MS/MS để kiểm tra đ tinh khiết sắc ký và tinh khiết MS. 
Matrine tinh chế có tinh khiết sắc ký và tinh khiết MS là 100 % theo sắc ký 
đồ và phổ MS (Hình 3.9). Oxymatrine tinh chế có tinh khiết sắc ký và tinh khiết MS 
là 100 % theo sắc ký đồ và phổ MS (Hình 3.10). 
Lƣ ng matrine điều chế đƣ c l 20,6 mg đ tinh khiết 100 % theo sắc ký đồ 
và 100 % theo phổ khối HRMS. 
Lƣ ng oxymatrine điều chế đƣ c l 3,4 mg đ tinh khiết 100 % theo sắc ký 
đồ và 100 % theo phổ kh