Luận án Nghiên cứu nuôi cấy tế bào cây nghệ đen (Curcuma zedoaria roscoe) và khảo sát khả năng tích lũy một số hợp chất có hoạt tính sinh học của chúng

hợp chất tự nhiên như tinh dầu, curcumin, 
sesquiterpene và polysaccharide trong tế bào nghệ đen nuôi cấy trong hệ lên 
men 10 L. 
- Thử nghiệm đánh giá hoạt tính kháng khuẩn của tinh dầu tế bào nghệ 
đen nuôi cấy trong hệ lên men 10 L. 
 38 
2.3. PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 
Hình 2.2. Sơ đồ th nghiệm 
Cây nghệ đen tự nhiên 
Cây nghệ đen in vitro 
Callus có nguồn gốc từ bẹ lá 
Chọn loại callus thích hợp cho nuôi 
cấy huyền phù 
Nuôi cấy huyền phù tế bào trong bình tam giác ở các điều 
kiện và môi trường nuôi cấy khác nhau 
Môi trường và điều kiện nuôi cấy thích hợp 
Cỡ mẫu 
Cỡ mẫu 
Điều kiện nuôi cấy thích hợp 
Khảo sát sự tích lũy của tinh dầu, curcumin, 
polysaccharide, và sesquiterpene 
Phân tích hoạt tính kháng khuẩn của tinh dầu 
Tốc độ lắc Nguồn carbon Chất ĐHST 
Nuôi cấy TB trong hệ lên men ở các điều kiện nuôi 
cấy khác nhau 
Tốc độ khuấy Tốc độ sục khí 
 39 
Các thí nghiệm của luận án được tiến hành tại Phòng thí nghiệm Hợp chất 
thứ cấp, Viện Tài nguyên, Môi trường và Công nghệ sinh học, Đại học Huế. 
2.3.1. Nuôi cấy callus 
Bẹ lá (0,2×1,0 cm) của cây nghệ đen in vitro được nuôi trên môi trường 
MS [107] có 2% sucrose và 0,8% agar, bổ sung 0,5-4,0 mg/L 2,4-D và 0,5-4,0 
mg/L BA để tạo callus. Các callus sơ cấp hình thành từ bẹ lá (có màu trắng, xốp) 
được cắt thành các khối nhỏ (đường kính 2-3 mm) cấy chuyển lên môi trường MS 
có bổ sung 0,25-4,0 mg/L 2,4-D và 0,25-4,0 mg/L BA để phát triển thành callus 
thứ cấp. Các callus thứ cấp có màu vàng, rắn và rời rạc được tách thành những 
khối nhỏ (đường kính 1-2 mm) nuôi cấy trên trên cùng môi trường để nhân sinh 
khối. Callus được cấy chuyển 2 tuần/lần để tạo nguồn nguyên liệu nuôi cấy huyền 
phù tế bào. 
2.3.2. Nuôi cấy huyền phù tế bào 
2.3.2.1. Nuôi cấy huyền phù tế bào trong bình tam giác 
Thiết lập nuôi cấy huyền phù tế bào bằng cách cấy chuyển 2 g callus (14 
ngày tuổi) vào bình tam giác 250 ml, chứa 50 ml môi trường MS có 2% sucrose, bổ 
sung 2,4-D 0,5 mg/L và BA 0,5 mg/L, nuôi trên máy lắc với tốc độ lắc 100 
vòng/phút. Sau 10 ngày nuôi cấy, 2 g tế bào được chuyển sang môi trường mới có 
thành phần tương tự và nuôi trong cùng một điều kiện cho đến khi thu được dịch tế 
bào huyền phù đồng nhất. 
Sau 3 lần cấy chuyển, dịch huyền phù tế bào đồng nhất, sinh khối của tế 
bào 10 ngày tuổi được sử dụng nuôi cấy trong bình tam giác 250 ml, chứa 50 ml 
môi trường MS có 2% sucrose, bổ sung 0,5 mg/L 2,4-D và 0,5 mg/L BA với các 
điều kiện khác nhau như: cỡ mẫu 2-5 g, tốc độ lắc từ 80-180 vòng/phút để đánh 
giá ảnh hưởng của điều kiện nuôi cấy đến khả năng sinh trưởng của tế bào. 
Sau khi khảo sát một số điều kiện nuôi cấy thích hợp cho sinh trưởng của tế 
bào trong bình tam giác, trên máy lắc (cỡ mẫu, tốc độ lắc), sử dụng 3 g sinh khối 
 40 
tế bào (10 ngày tuổi) từ thí nghiệm thăm dò điều kiện nuôi cấy thích hợp tiếp tục 
nuôi cấy trong bình tam giác 250 ml, chứa 50 ml môi trường MS bổ sung các 
nguồn carbon khác nhau: sucrose, fructose và glucose (nồng độ: 20-70 g/L), và 
các chất ĐHST khác nhau: BA (0,25-2,5 mg/L) và 2,4-D (0,25-2,5 mg/L) ở dạng 
riêng rẽ hoặc phối hợp. Nuôi ở tốc độ lắc 120 vòng/phút để đánh giá ảnh hưởng 
của yếu tố môi trường nuôi cấy đến khả năng sinh trưởng của tế bào. 
2.3.2.2. Nuôi cấy huyền phù tế bào trong hệ lên men 
100 g sinh khối tế bào (10 ngày tuổi) nuôi cấy trên bình tam giác 250 
ml trong môi trường cơ bản MS có 3% sucrose, bổ sung thêm BA 0,5 mg/L và 
2,4-D 1,5 mg/L được đưa vào hệ lên men có tổng thể tích 14 L, thể tích làm 
việc 10 L (BioFlo 110, New Brunswick Scientific, USA) chứa môi trường MS 
lỏng có 3% sucrose, bổ sung 2,4-D 1,5 mg/L và BA 0,5 mg/L, cỡ mẫu 100-
250 g, tốc độ khuấy 100-200 vòng/phút, tốc độ sục khí 1,5-3,5 l/phút. Sinh 
khối tế bào được thu 2 ngày một lần trong suốt 18 ngày để khảo sát khả năng 
sinh trưởng của chúng. 
Tất cả môi trường nuôi cấy được điều chỉnh pH 5,8 trước khi khử 
trùng ở 121oC trong 15 phút. Các thí nghiệm nuôi cấy in vitro được duy trì ở 
nhiệt độ 25 2oC, điều kiện chiếu sáng khoảng 2000 lux (cho các thí nghiệm 
nuôi cấy callus) và khoảng 500 lux (cho các thí nghiệm nuôi cấy huyền phù 
tế bào trong bình tam giác 250 ml và hệ lên men 10 L), thời gian chiếu sáng 
8-10 giờ/ngày. 
2.3.3. Xác định khả năng sinh trưởng của tế bào 
Khả năng sinh trưởng của tế bào nuôi cấy huyền phù được đánh giá thông 
qua khối lượng tươi, khối lượng khô, chỉ số sinh trưởng của tế bào. 
Sinh khối tươi của tế bào thu được bằng cách lọc chân không dịch 
huyền phù tế bào, sau đó rửa bằng nước cất để loại bỏ môi trường, cân để xác 
định khối lượng tươi. 
 41 
Sinh khối tươi của tế bào được sấy khô trong tủ sấy ở 500C cho đến khi 
khối lượng không đổi, cân để xác định khối lượng khô của tế bào. 
Chỉ số sinh trưởng (GI) được tính theo công thức: 
I
F
I
W
W
G 
Trong đó, WF: khối lượng tươi tế bào sau một thời gian nuôi cấy, WI: khối 
lượng tươi tế bào lúc đưa vào nuôi cấy. 
2.3.4. Định lượng tinh dầu 
Xác định tinh dầu được thực hiện theo phương pháp của (Manzan và cs 
2003) [95]. 4 g khô của tế bào nghệ đen được nghiền mịn và cho vào bình nút 
mài chứa 50 ml dung môi petrol ether, lắc 180 vòng/phút ở 40ºC trong 6 giờ. 
Quá trình chiết lặp lại 3 lần. Sau khi chiết, dung dịch được cô trên máy cô quay 
chân không (Heidolph, Đức) để loại bỏ dung môi và thu tinh dầu. 
2.3.5. Định lượng curcumin 
Tách chiết curcumin được tiến hành theo phương pháp của Paramapojn và 
Gritsanapan (2009) [120]. Hòa 2 g bột mịn của tế bào nghệ đen trong 20 ml 
ethanol 70%. Hỗn hợp được phá bằng sóng siêu âm trên máy T 700/H (Elma, 
Đức) trong 30 phút ở 30oC. Sau đó, thể nổi được lọc bằng giấy Whatman (No. 
1), bã được chiết lại với cùng dung môi cho tới khi hết hoàn toàn (dịch chiết cuối 
cùng là không màu). Dịch chiết nhiều lần được trộn lại và làm giàu bằng máy cô 
quay chân không (Heidolph, Đức) . 
Mẫu sau khi cô được hòa tan với ethanol 70% đến 10 ml, lọc bằng màng 
Millipore 0,25 μm (Sartorius, Đức) và pha loãng dịch chiết 5 lần. 20 μl của dịch 
chiết được đưa vào máy sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC) bằng Hamilton 
syringe. Điều kiện chạy HPLC ở nhiệt độ phòng: cột Vertisep GES C18 (5 µm; 
4,6×150 mm), tốc độ chạy 1,2 ml/min, thời gian chạy 10 phút, detector đọc ở 
bước sóng 420 nm, pha tĩnh là silica gel (pha ngược) và pha động là 
acetonitrile:acetic acid 2% (50:50, v/v). 
 42 
Phân tích HPLC được thực hiện trên máy Spectra System (Thermo 
Electron, Mỹ) bằng chương trình ChromQuest (ver. 4.2.34). Tất cả dung môi đạt 
tiêu chuẩn phân tích được mua từ các hãng Sigma (Mỹ) và Merck (Đức). Hòa 
tan curcumin chuẩn (≥ 94%) bằng ethanol 70% ở các nồng độ từ 0,1-1 mg/ml để 
dựng đường chuẩn. Hàm lượng curcumin (% khối lượng khô) của tế bào được 
tính theo phương trình đường chuẩn y = 10805,46 x (r2 = 0,966). 
2.3.6. Định lượng polysaccharide hòa tan trong nước 
Tách chiết polysaccharide được thực hiện theo phương pháp của Sun và 
cs (2005) [151]. 1 g bột mịn của tế bào nghệ đen được chiết Soxhlet (Selecta, 
Tây Ban Nha) trong 3 giờ với ethanol 80% để loại bỏ chất màu, làm bất hoạt các 
enzyme, và biến tính các protein tự do. Phần cặn được cho vào bình tam giác 150 
ml, thêm vào 30 ml nước cất, sau đó chiết trong thiết bị làm sạch bằng sóng siêu 
âm T 700/H (Elma, Đức) ở 600C trong 30 phút. Dịch chiết được thêm vào 40 ml 
ethanol 95%, ủ qua đêm ở 40C để kết tủa polysaccharide. Ly tâm thu kết tủa và 
rửa sạch bằng hỗn hợp diethyl ether và acetone (1:1 v/v) để thu polysaccharide. 
Hòa tan kết tủa polysaccharide trong 3 ml nước cất, sau đó thêm vào 1 ml 
phenol và 7 ml H2SO4, ủ trong bể điều nhiệt ở 40
0C trong 30 phút. Làm lạnh đến 
nhiệt độ phòng trong 20 phút. So màu trên máy quang phổ BioMate 3 UV-Vis 
(Thermo Spectronic, Mỹ) ở bước sóng 485 nm. Mẫu trắng có thành phần giống 
như mẫu phân tích nhưng không có polysaccharide. Hàm lượng polysaccharide 
được xác định dựa vào đường chuẩn D-glucose (4-20 mg/ml) (Chaplin và cs 
1994) [30] và tính toán theo hệ số chuyển đổi sang polysaccharide là 3,168 (Li 
và cs 2007) [83]. Phương trình đường chuẩn D-glucose như sau: y = 0,0668x với 
R2 = 0,996. 
2.3.7. Xác định sesquiterpene 
Xác định sesquiterpene theo phương pháp của Jang và cs (2004) [64]. Lấy 
1 g mẫu bột mịn của tế bào nghệ đen chiết trong 3 giờ với dung môi methanol. 
 43 
Quá trình chiết lặp lại 3 lần. Dịch chiết trộn lại, lọc và cô bằng hệ thống cô quay 
chân không (Heidolph, Đức) cho tới khô. Mẫu sau đó được hòa tan trong hỗn 
hợp ethyl acetate và nước (1:1 v/v). Phần hòa tan trong ethyl acetate được cô cho 
tới khô, sau đó hòa tan trong methanol, lọc bằng màng Millipore 0,25 μm 
(Sartorius, Đức), lấy 50 μl để chạy HPLC pha ngược. Điều kiện chạy HPLC ở 
nhiệt độ phòng như sau: cột Vertisep GES C18 (5 µm, 4,6 ×150 mm), pha động 
methanol 60%, tốc độ dòng 1 ml/min, độ hấp thu quang đo ở bước sóng 254 nm. 
Phân tích HPLC được thực hiện trên máy Spectra System (Thermo 
Electron, Mỹ) bằng chương trình ChromQuest (ver. 4.2.34). Tất cả dung môi đạt 
tiêu chuẩn phân tích được mua từ hãng Merck (Đức). 
2.3.8. Xác định hoạt tính kháng khuẩn của tinh dầu 
Hoạt tính kháng khuẩn của tinh dầu tế bào nghệ đen được xác định theo 
phương pháp khuếch tán đĩa thạch của Lehrer và cs (1991) [81]. Sử dụng dịch 
huyền phù (106 - 108 CFU/ml) của các chủng vi khuẩn Bacillus cereus ATCC 
11778, Staphylococcus aureus ATCC 6538, và Escherichia coli ATCC 25922 
(Bansal, 2003). 100 µl dịch huyền phù của mỗi chủng được bổ sung lên đĩa Petri 
chứa 20 ml môi trường dinh dưỡng dạng rắn, dùng que cấy dàn đều tế bào vi 
khuẩn trên mặt thạch. Khoan 3 lỗ đường kính 6 mm trên đĩa môi trường, sau đó 
cho vào mỗi lỗ 70 µl tinh dầu (50 mg/ml), dung dịch DMSO được dùng làm đối 
chứng. Đặt đĩa môi trường trong tủ lạnh khoảng 8 giờ, sau đó nuôi trong tủ ấm ở 
37oC, sau 24 giờ xác định đường kính vô khuẩn D - d (D: đường kính vòng vô 
khuẩn; d: đường kính lỗ khoan). 
2.3.9. Xử lý thống kê 
Mỗi thí nghiệm được bố trí lặp lại 3 lần. Số liệu thực nghiệm được tính 
trung bình mẫu ± sai số chuẩn và phân tích Ducan’s test (p<0,05) bằng chương 
trình SAS. 
 44 
Chƣơng 3 
KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN 
3.1. NUÔI CẤY CALLUS NGHỆ ĐEN 
Callus thường được dùng làm nguồn nguyên liệu khởi đầu để thiết lập 
nuôi cấy huyền phù tế bào của thực vật. Vì vậy, tìm ra môi trường dinh dưỡng 
thích hợp cho nuôi cấy callus là rất cần thiết. Bảng 3.1 trình bày kết quả tạo 
callus từ bẹ lá của cây nghệ đen in vitro trên các môi trường khác nhau sau 90 
ngày nuôi. 
Bảng 3.1. Khả năng tạo callus từ bẹ lá của cây nghệ đen in vitro 
2,4-D 
(mg/L) 
BA 
(mg/L) 
% mẫu vật 
tạo callus 
Sinh trưởng 
của callus 
Hình thái callus 
- - - - - 
0,5 0,5 15,74c ++ Trắng, mọng nước 
1,0 1,0 46,01a ++++ Trắng, xốp 
2,0 2,0 40,10b ++++ Trắng, xốp 
3,0 3,0 10,20d +++ Trắng, mọng nước 
4,0 4,0 8,20cd + Trắng, mọng nước 
Các chữ cái khác nhau trong cùng một cột chỉ sự sai khác có ý nghĩa thống kê ở p<0,05 
(Duncan’s test). 
++++: sinh trưởng mạnh; +++: sinh trưởng khá; ++: sinh trưởng trung bình; +: sinh trưởng 
kém; - : không xuất hiện callus. 
Các môi trường có bổ sung BA và 2,4-D đều kích thích tạo callus, trong 
khi đó môi trường không bổ sung chất ĐHST lại không tạo callus. Môi trường có 
bổ sung 1,0 mg/L 2,4-D và 1,0 mg/L BA hoặc 2,0 mg/L 2,4-D và 2,0 mg/L BA 
 45 
là thích hợp nhất (tỷ lệ tạo callus từ 40,1-46,01%), callus có màu trắng, xốp và 
có khả năng sinh trưởng tốt (Hình 3.1A). Ở các môi trường còn lại tỷ lệ tạo 
callus thấp (8,2-15,74%), callus có màu trắng và mọng nước (Hình 3.1B). 
Hình 3.1. Callus hình thành từ bẹ lá của cây nghệ đen in vitro. (A) callus trắng và 
xốp, (B) callus trắng và mọng nước. 
Mello và cs (2001b) đã tạo được callus nghệ đen từ đoạn rễ trên môi 
trường MS có 3% sucrose, bổ sung 13,4 µM NAA và 2,2 µM BA, nuôi trong 
điều kiện tối. Nghiên cứu của Miachir và cs (2004) cho thấy, callus nghệ đen 
hình thành từ đoạn rễ sinh trưởng trên môi trường MS có bổ sung 1,0 mg/L 
NAA, nhưng nếu nuôi cấy trên môi trường MS có bổ sung 2,4 D trong điều kiện 
tối thì callus sẽ không xuất hiện [102]. 
Trong nghiên cứu của chúng tôi, các ĐHST như NAA và KIN cũng đã 
được thăm dò khi nuôi cấy bẹ lá, tuy nhiên chúng cho kết quả rất kém, callus 
sinh trưởng yếu trên môi trường có NAA và hóa nâu trên môi trường có KIN. 
Chúng tôi cũng đã khảo sát khả năng hình thành callus từ đoạn rễ trên các môi 
trường có bổ sung 2,4-D, BA, KIN, và NAA. Trên hầu hết các môi trường thí 
nghiệm, mô rễ tạo callus rất kém hoặc callus có màu trắng, mọng nước và hơi 
nhầy, sinh trưởng rất chậm. 
Trong việc chọn dòng tế bào callus để thiết lập nuôi cấy huyền phù, các 
dòng callus rắn và dễ vỡ vụn (friable) thường được lựa chọn làm nguyên liệu 
B A 
 46 
nuôi cấy huyền phù tế bào do chúng có khả năng sinh trưởng nhanh và ổn định 
trong môi trường lỏng [165]. Trong nghiên cứu của chúng tôi, callus điều có khả 
năng sinh trưởng mạnh trên môi trường MS bổ sung 1,0 mg/L 2,4-D và 1,0 mg/L 
BA hoặc 2,0 mg/L 2,4-D và 2,0 mg/L BA. Tuy nhiên, các callus này có dạng 
xốp và khó vở vụn nên không thích hợp để làm nguyên liệu nuôi cấy huyền phù 
tế bào. Vì thế, cần phải chọn các dòng tế bào callus thích hợp hơn để thiết kế 
nuôi cấy huyền phù. 
Callus sơ cấp có màu trắng, xốp và sinh trưởng mạnh được cấy chuyển lên 
môi trường MS có bổ sung 2,4-D và BA từ 0,25-4 mg/L. Kết quả cho thấy, các 
callus sinh trưởng trên môi trường có 2 mg/L 2,4-D và 2 mg/L BA dần dần hóa 
nâu và chết sau khi cấy chuyển. Các callus trên môi trường có 1 mg/L 2,4-D và 1 
mg/L BA phát triển thành dạng callus thứ cấp có khả năng sinh trưởng tốt nhất 
trên môi trường có chứa 0,5 mg/L 2,4-D và 0,5 mg/L BA (Bảng 3.2). Các môi 
trường còn lại không có tác dụng kích thích sinh trưởng callus (callus sinh 
trưởng kém hoặc hóa nâu và chết) sau 4 tuần cấy chuyển. 
Bảng 3.2. Ảnh hưởng của chất ĐHST lên sinh trưởng và phát sinh hình thái của 
callus 
2,4-D 
(mg/L) 
BA 
(mg/L) 
Sinh trưởng 
của callus 
Hình thái callus 
0,25 0,25 + Trắng và mọng nước 
0,50 0,50 ++++ Vàng sáng, rắn và rời rạc 
1,00 1,00 ++ Trắng và xốp 
2,00 2,00 ++ Trắng và mọng nước 
4,00 4,00 - Hóa nâu và chết 
Các chữ cái khác nhau trong cùng một cột chỉ sự sai khác có ý nghĩa thống kê ở 
p<0,05 (Duncan’s test). 
++++: sinh trưởng mạnh; +++: sinh trưởng khá; ++: sinh trưởng trung bình; +: sinh 
trưởng kém; - : không sinh trưởng. 
 47 
Hình 3.2. Callus có màu vàng, rắn và rời rạc sau 14 ngày nuôi cấy 
Các calus thứ cấp có màu vàng sáng, rắn và dễ vỡ vụn (Hình 3.2) thu được 
trên môi trường MS có bổ sung 0,5 mg/L 2,4-D và 0,5 mg/L BA sau 4 tuần được 
cấy chuyển 2 tuần một lần lên môi trường có thành phần tương tự để nhân sinh 
khối callus, tạo nguyên liệu cho nuôi cấy huyền phù tế bào trong bình tam giác. 
3.2. NUÔI CẤY HUYỀN PHÙ TẾ BÀO TRONG BÌNH TAM GIÁC 
3.2.1. Ảnh hưởng của cỡ mẫu nuôi cấy 
Sinh khối tế bào (10 ngày tuổi) nuôi cấy trên môi trường MS có 2% 
sucrose, bổ sung 2,4-D 0,5 mg/L và BA 0,5 mg/L được dùng làm nguyên liệu để 
khảo sát. Tế bào với các cỡ mẫu ban đầu khác nhau (2, 3, 4, 5 g tế bào) được nuôi 
cấy trên môi trường lỏng có thành phần giống như môi trường sinh trưởng tốt 
nhất của callus, ở tốc độ lắc 100 vòng/phút. Kết quả ảnh hưởng của cỡ mẫu nuôi 
cấy lên sinh trưởng của tế bào trong khoảng thời gian từ 2 đến 18 ngày được trình 
bày ở bảng 3.3. 
Kết quả cho thấy, với cỡ mẫu 2 g, sinh khối đạt cao nhất sau 16 ngày là 
4,12 g tươi (0,37 g khô) và chỉ số sinh trưởng là 2,06. Với 3 g tế bào nuôi cấy thì 
sinh trưởng của tế bào đạt cực đại chỉ sau 14 ngày là 5,61 g tươi (0,41 g khô) và 
chỉ số sinh trưởng là 1,87. Khi tăng cỡ mẫu lên 4-5 g, sinh khối đạt cực đại sau 
12 ngày, tương ứng là 6,12 g tươi (0,46 g khô) và 7,22 g tươi (0,51 g khô) nhưng 
chỉ số sinh trưởng thấp chỉ đạt 1,54 và 1,44. 
 48 
Bảng 3.3. Ảnh hưởng của cỡ mẫu lên sinh trưởng của tế bào nuôi cấy huyền phù 
trong bình tam giác 
TN 
2 g tế bào 3 g tế bào 4 g tế bào 5 g tế bào 
FW DW GI FW DW GI FW DW GI FW DW GI 
2 2,22
c 
0,18
d 
1,11 3,14
d 
0,28
c 
1,05 4,07
c 
0,32
b 
1,02 5,20
d 
0,39
c 
1,04 
4 2,52
c 
0,24
c 
1,26 3,52
c 
0,32
c 
1,17 4,34
c 
0,35
b 
1,09 5,32
d 
0,42
c 
1,06 
6 3,00
b 
0,24
c 
1,50 4,00
c 
0,35
b 
1,33 4,94
c 
0,37
b 
1,24 5,61
c 
0,44
c 
1,12 
8 3,30
b 
0,30
b 
1,65 4,53
b 
0,38
b 
1,51 5,65
b 
0,40
b 
1,41 6,09
c 
0,47
b 
1,22 
10 3,50
b 
0,33
b 
1,75 4,92
b 
0,40
a 
1,64 6,04
a 
0,42
b
 1,51 7,02
b 
0,48
b 
1,40 
12 3,70
a 
0,35
b 
1,85 5,15
b 
0,40
a 
1,72 6,15
a 
0,44
a 
1,54 7,22
a 
0,51
a 
1,44 
14 4,00
a 
0,35
b 
2,00 5,61
a 
0,41
a 
1,87 6,12
a 
0,46
a 
1,53 5,68
c 
0,41
c 
1,14 
16 4,12
a 
0,37
a 
2,06 5,21
b 
0,37
b 
1,74 5,20
b 
0,35
b 
1,30 5,00
d 
0,32
cd 
1,00 
18 4,01
a 
0.23
c 
2,01 4,67
b 
0,29
c 
1,56 4,56
c 
0,27
c 
1,14 4,12
e 
0,22
d 
0,82 
Các chữ cái khác nhau trong cùng một cột chỉ sự sai khác có ý nghĩa thống kê ở 
p<0,05 
TN: thời gian nuôi cấy (ngày); FW: khối lượng tươi (g); DW: khối lượng khô (g), GI: 
chỉ số sinh trưởng 
Nghiên cứu cũng cho thấy, mặc dù với cỡ mẫu nuôi cấy là 2 g, sau 14 ngày 
chỉ số sinh trưởng của tế bào có cao (2,0), nhưng chất lượng dịch huyền phù tế bào 
kém hơn (dịch tế bào có màu vàng nhạt, ít đồng nhất) so với khi sử dụng 3 g tế 
bào nuôi cấy (dịch huyền phù tế bào có màu vàng đậm, tươi và đồng nhất). Vì thế, 
theo nhận định của chúng tôi, sử dụng 3 g tế bào callus nuôi cấy trong bình tam 
giác có thể tích 250 ml chứa 50 ml môi trường là thích hợp hơn cả. 
Nói chung, xác định cỡ mẫu là rất cần thiết để đảm bảo cho quá trình sinh 
trưởng diễn ra hiệu quả. Khi mật độ tế bào trong bình nuôi cấy quá cao hoặc quá 
thấp đều làm cho tế bào sinh trưởng kém [111]. Mật độ ban đầu thấp có thể dẫn 
đến kéo dài pha sinh trưởng hàm mũ; trong khi đó, nếu mật độ tế bào ban đầu 
cao hơn có thể nhanh chóng dẫn đến pha tử vong (Ling và cs 2008) [84]. Ảnh 
 49 
hưởng của cỡ mẫu nuôi cấy ban đầu lên sinh trưởng của tế bào nuôi cấy huyền 
phù đã được khảo sát trên nhiều loài thực vật khác nhau. Gou và Zhang (2005), 
khi nghiên cứu nuôi cấy huyền phù tế bào cây gừng nhận thấy, nếu lượng mẫu 
ban đầu thấp hơn 0,5% (w/v) thì tế bào sẽ sinh trưởng chậm, trong khi với lượng 
mẫu cao hơn 2,0% (w/v) thì tế bào sẽ sinh trưởng nhanh [49]. Ling và cs (2008) 
nuôi cấy tế bào cây Ficus deltoidea với cỡ mẫu là 2,5-10 ml dịch tế bào huyền 
phù, kết quả tế bào sinh truởng tốt nhất ở 10 ml và sinh khối đạt cực đại sau 12 
ngày. Nếu lượng mẫu thấp hơn 2,5 ml thì pha thích nghi (pha lag) của tế bào sẽ 
kéo dài đến hết ngày thứ 9 [84]. Nagella và Murthy (2010) cũng đã khảo sát 
ảnh hưởng của cỡ mẫu ban đầu từ 2,5- 20 g/L lên tích lũy sinh khối của tế bào 
cây Withania somnifera nhận thấy, nuôi cấy với lượng mẫu khoảng 10 g/L là 
thích hợp nhất cho sinh trưởng của tế bào [109]. 
Từ kết quả khảo sát ảnh hưởng của cỡ mẫu lên sinh trưởng của tế bào 
nghệ đen cho thấy, tế bào nghệ đen sinh trưởng tốt với cỡ mẫu nuôi cấy ban đầu 
là 3 g trong bình tam giác thể tích 250 ml, chứa 50 ml môi trường và sau 14 ngày 
sinh khối sẽ đạt cực đại. Trong các nghiên cứu tiếp theo chúng tôi sử dụng cỡ 
mẫu nuôi cấy là 3 g và thu hoạch sinh khối sau 14 ngày nuôi cấy để khảo sát ảnh 
hưởng các điều kiện nuôi cấy khác lên sinh trưởng của tế bào nghệ đen. 
3.2.2. Ảnh hưởng của tốc độ lắc 
Tế bào được nuôi cấy trên môi trường MS có BA 0,5 mg/L và 2,4-D 
0,5 mg/L, sucrose 20 g/L, cỡ mẫu ban đầu là 3 g với tốc độ lắc thay đổi từ 80 
đến 180 vòng/phút. Kết quả nghiên cứu ảnh hưởng của tốc độ lắc lên sinh 
trưởng của tế bào sau 14 ngày nuôi cấy được trình bày ở bảng 3.4. 
Nhìn chung, tốc độ lắc đã ảnh hưởng lên sinh trưởng của tế bào nghệ 
đen. Với tốc độ lắc tăng từ 80 đến 120 vòng/phút, sinh khối tế bào đã tăng dần 
lên và đạt cực đại là 5,91 g