Luận án Nghiên cứu phát triển bộ sinh phẩm multiplex realtime PCR phát hiện một số tác nhân gây nhiễm khuẩn bệnh viện và khảo sát tính kháng kháng sinh

dạng của một tín hiệu realtime chuẩn. Giá trị chu kì ngƣỡng của mỗi chủng vi 
khuẩn trong các ống phản ứng chứng minh sự đặc hiệu của mồi và mẫu dò với DNA 
đích. Nhƣ mẫu S. aureus giá trị chu kì ngƣỡng trong ống có 1DNA của vi khuẩn S. 
aureus và ống có hỗn hợp DNA đích của 5 vi khuẩn và DNA ngƣời lần lƣợt là 13.65 
và 13.55 đều không có sự khác biệt nhiều, mẫu E. coli giá trị chu kì ngƣỡng trong 
65 
ống có 1DNA của vi khuẩn E. coli và ống có hỗn hợp 5 DNA đích của các vi khuẩn 
và DNA ngƣời lần lƣợt là 12,98 và 13,61. Chứng tỏ các mồi và mẫu dò đƣợc thiết 
kế đều đặc hiệu với gen đích đã lựa chọn. Kết quả cho thấy giá trị chu kì ngƣỡng ở 
mẫu DNA đơn và DNA hỗn hợp có kết quả tƣơng đồng, nhƣ vậy có thể dùng bộ mồi 
và mẫu dò cho các nghiên cứu tiếp theo. 
3.2.3.2. Độ đặc hiệu của hỗn hợp mồi và mẫu dò với các gen đích 
Phản ứng multiplex realtime PCR đƣợc thiết kế dựa trên phản ứng PCR 
cặp mồi đơn với tổng thể tích của một phản ứng là 10 µl bao gồm master mix, 
mồi, mẫu dò, khuôn DNA và nƣớc khử ion. Tuy nhiên trong phản ứng 
multiplex realtime PCR có bổ sung thêm các cặp mồi và mẫu dò để đồng thời 
phát hiện nhiều gen khác nhau. Việc bổ sung này làm cho nồng độ các thành 
phần thay đổi so với phản ứng realtime PCR chuẩn, đồng thời có thể xảy ra 
hiện tƣợng các cặp mồi ức chế, bắt cặp chéo lẫn nhau dẫn đến không phát hiện 
đƣợc gen đích quan tâm. Do đó sau khi kiểm tra đƣợc sự bắt cặp của từng cặp 
mồi, mẫu dò với DNA của các chủng vi khuẩn nghiên cứu là đặc hiệu chúng tôi 
tiến hành chạy phản ứng multiplex realtime PCR với thành phần và nồng độ 
nhƣ đã trình bày ở phần phƣơng pháp. 
 Độ đặc hiệu của hỗn hợp mồi, mẫu dò với gen đích của vi khuẩn A. baumannii, 
K. pneumoniae và gen GADPH của ngƣời 
 Dựa vào kết quả ở Hình 3.10 cho thấy không xuất hiện tín hiệu huỳnh 
quang ở mẫu đối chứng không có DNA. Hình 3.11 cho thấy các mẫu có DNA 
của vi khuẩn A. baumanni, K. pneumoniae đều có tín hiệu huỳnh quang vƣợt tín 
hiệu huỳnh quang nền và có dạng tín hiệu của một phản ứng realtime PCR 
chuẩn. Đối chiếu với bảng giá trị chu kì ngƣỡng (Bảng 3.6) có sự bắt cặp đặc 
hiệu khá sớm với chu kỳ là 12,93 và 10,93 lần lƣợt ở A. baumanni, K. 
pneumoniae. Điều này chứng tỏ trong phản ứng multiplex realtime này các cặp 
mồi và mẫu dò không ức chế và không bắt cặp chéo nhau. 
66 
Hình 3.10. Biểu đồ khảo sát độ đặc hiệu của hỗn hợp mồi và mẫu dò với DNA đích 
của vi khuẩn: ống đối chứng không có DNA đích 
Bảng 3.6. Giá trị chu kì ngƣỡng kiểm tra độ đặc hiệu của hỗn hợp mồi, mẫu dò với 
DNA đích của vi khuẩn A. baumanni, K. pneumoniae và gen GADPH 
STT 
Mẫu 
Giá trị chu kì ngƣỡng 
HEX (tín 
hiệu mẫu dò 
Ac) 
FAM (tín 
hiệu mẫu dò 
Kp) 
CY5 (tín hiệu 
mẫu dò Hu) 
1 Không có DNA đích 0 0 0 
2 DNA A. baumanni 12,93 0 0 
3 DNA K. pneumoniae 0 10,93 0 
4 DNA Hu 0 0 20,99 
5 
Hỗn hợp DNA đích 5 vi 
khuẩn và DNA ngƣời 
14,91 18,48 23,92 
67 
Ở các ống có hỗn hợp mồi và mẫu dò cùng với DNA của mỗi loại vi khuẩn chúng tôi 
thu đƣợc kết quả nhƣ sau: 
(A) 
(B) 
(C) 
Hình 3.11. Biểu đồ khảo sát độ đặc hiệu của hỗn hợp mồi và mẫu dò với DNA 
đích của vi khuẩn: (A): A. baumanni, (B): K. pneumoniae, (C): DNA của ngƣời 
68 
 Để khẳng định chắc chắn về độ đặc hiệu của các cặp mồi và mẫu dò với 
các gen đích trong cùng một phản ứng multiplex realtime PCR chúng tôi trộn DNA 
của 5 chủng vi khuẩn khác nhau và DNA của ngƣời để tạo thành hỗn hợp DNA 
khuôn và tiến hành phản ứng multiplex realtime PCR. Kết quả sản phẩm của phản 
ứng multiplex realtime PCR xuất hiện cả 3 đƣờng tín hiệu huỳnh quang và không 
có đƣờng phụ (Hình 3.12). 
Hình 3.12. Biểu đồ khảo sát độ đặc hiệu của hỗn hợp mồi và mẫu dò với 
DNA đích của vi khuẩn với ống có hỗn hợp các DNA đích 
 Độ đặc hiệu của hỗn hợp mồi, mẫu dò với DNA đích của vi khuẩn S. 
aureus, E. coli, P. aeruginosa. 
 Chúng tôi tiến hành thí nghiệm tƣơng tự để xác định độ đặc hiệu của hỗn 
hợp mồi và mẫu dò với DNA đích của vi khuẩn S. aureus, E. coli, P. aeruginosa với 
thành phần phản ứng, chƣơng trình chạy nhƣ đã trình bày. Kết quả thu đƣợc: 
Hình 3.13. Biểu đồ khảo sát độ đặc hiệu của hỗn hợp mồi và mẫu dò với DNA đích 
của vi khuẩn: ống đối chứng không có DNA 
69 
(A) 
(B) 
(C) 
Hình 3.14. Biểu đồ khảo sát độ đặc hiệu của hỗn hợp mồi và mẫu dò với DNA đích 
của vi khuẩn: (A): S. aureus, (B): E. coli; (C): P. aeruginosa 
70 
Bảng 3.7. Giá trị chu kì ngƣỡng kiểm tra độ đặc hiệu của hỗn hợp mồi, mẫu dò với 
DNA đích của vi khuẩn S. aureus, E. coli, P. aeruginosa 
Ống Mẫu 
Giá trị chu kì ngƣỡng 
FAM (tín hiệu 
mẫu dò Sa) 
HEX (tín 
hiệu mẫu dò 
Ec) 
CY5 (tín 
hiệu mẫu dò 
Pa) 
1 Không có DNA đích 0 0 0 
2 DNA S. aureus 22.48 0 0 
3 DNA E. coli 0 17.88 0 
4 DNA P. aeruginosa 0 0 20.99 
5 
Hỗn hợp DNA của 5 vi 
khuẩn và DNA ngƣời 
23.36 17.00 21.17 
Hình 3.15. Biểu đồ khảo sát độ đặc hiệu của hỗn hợp mồi và mẫu dò với DNA đích 
của vi khuẩn ống có hỗn hợp các DNA đích. 
Kết quả ở Hình 3.13 cho thấy ở mẫu đối chứng không có DNA đích của vi 
khuẩn thì không xuất hiện tín hiệu huỳnh quang. Hình 3.14 cho biết trong các mẫu 
có DNA của vi khuẩn S. aureus, E. coli, P. aeruginosacó đều xuất hiện tín hiệu huỳnh 
71 
quang vƣợt tín hiệu huỳnh quang nền và có dạng một tín hiệu của một phản ứng 
realtime PCR chuẩn. 
Giá trị chu kì ngƣỡng trong các ống chứa DNA của vi khuẩn S. aureus và trong 
ống chứa hỗn hợp DNA lần lƣợt là 22,48 và 23,36; ở ống chứa DNA của E. coli là 
17,78 và 17,00; Giá trị chu kì ngƣỡng trong các ống chứa DNA của vi khuẩn P. 
aeruginosa và trong ống chứa hỗn hợp DNA lần lƣợt là 20,99 và 21,17; kết quả này 
chứng tỏ không có sự khác biệt nhiều về giá trị chu kì ngƣỡng trong phản ứng 
multiplex realtime PCR. Điều đó cho thấy trong phản ứng multiplex realtime PCR các 
cặp mồi và mẫu dò rất đặc hiệu với gen đích, các mồi và mẫu dò không ức chế và bắt 
cặp chéo lẫn nhau. 
Tƣơng tự để khẳng định chắc chắn về độ đặc hiệu của các cặp mồi và mẫu dò 
với các gen đích trong cùng một phản ứng multiplex realtime PCR chúng tôi trộn 
DNA của 5 chủng vi khuẩn khác nhau và DNA của ngƣời để tạo thành hỗn hợp 
DNA khuôn và tiến hành phản ứng multiplex realtime PCR. Kết quả sản phẩm của 
phản ứng multiplex realtime PCR xuất hiện cả 3 đƣờng tín hiệu huỳnh quang và 
không có đƣờng phụ (Hình 3.15) 
Nhƣ vậy với 6 cặp mồi và 6 mẫu dò đƣợc kiểm chứng hoàn toàn phù hợp để 
phối hợp trong một phản ứng phát hiện đồng thời 5 vi khuẩn gây nhiễm khuẩn bệnh 
viện E. coli, S. aureus, P. aeruginosa, A. baumannii, K. pneumoniae. 
Để khẳng định phản ứng multiplex realtime PCR này có thể sử dụng cho các 
trƣờng hợp nhiễm 5 loại vi khuẩn E. coli, S. aureus, P. aeruginosa, A. baumannii, 
K. pneumoniae nên phản ứng multiplex realtime tiếp tục đƣợc kiểm chứng trên các 
chủng chuẩn. 
3.2.4. Kết quả phản ứng multiplex realtime PCR trên các chủng chuẩn 
Sau khi kiểm tra độ đặc hiệu của mồi và mẫu dò và của hỗn hợp mồi và mẫu dò 
ở những thí nghiệm trên chúng tôi tiếp tục thực hiện phản ứng multiplex realtime PCR 
với các mẫu DNA từ các chủng chuẩn đƣợc phân lập, định danh và tách DNA tổng số 
còn lại với thành phần phản ứng, chƣơng trình chạy đƣợc trình bày ở phần phƣơng 
pháp chúng tôi thu đƣợc kết quả. 
72 
3.2.4.1 Phản ứng multiplex realtime PCR trên các chủng chuẩn A. baumannii, K. 
pneumoniae và của ngƣời (Hu) 
(A)
 (B) 
(C) 
Hình 3.16. Biểu đồ khuếch đại DNA của các chủng chuẩn (A): A. 
baumannii; (B): K. pneumoniae; (C): GADPH của ngƣời 
73 
 Bảng 3.8. Giá trị chu kì ngƣỡng của phản ứng multiplex realtime PCR trên các 
chủng chuẩn A. baumannii, K. pneumoniae và của ngƣời (Hu) 
Ống Mẫu 
Giá trị chu kì ngƣỡng 
HEX (tín hiệu 
mẫu dò Ac) 
FAM (tín hiệu 
mẫu dò Kp) 
CY5 (tín hiệu 
mẫu dò Hu) 
1 2Ac 15,23 0 0 
2 3Ac 13,92 0 0 
3 4Ac 15,59 0 0 
4 2Kp 0 14,24 0 
5 3Kp 0 14,26 0 
6 4Kp 0 14,10 0 
7 2Hu 0 0 22,55 
8 3Hu 0 0 25,22 
9 4Hu 0 0 24,81 
Kết quả Bảng 3.8 cho thấy kết giá trị chu kì ngƣỡng của các mẫu trong cùng 
loại vi khuẩn không có sự khác biệt đáng kể. Ở vi khuẩn K. pneumoniae giá trị chu kì 
ngƣỡng trong các chủng 2Kp, 3Kp, 4Kp lần lƣợt là 14,24; 14,26; 14,14. Ở vi khuẩn A. 
baumannii giá trị chu kì ngƣỡng lần lƣợt ở các chủng 2Ac, 3Ac, 4Ac là: 15,23; 13,92 
và 15,59. Còn ở mẫu 2Hu, 3Hu và 4Hu giá trị chu kì ngƣỡng lần lƣợt là 22,55; 25,22 
và 24,81. Điều này chứng tỏ bộ sinh phẩm multiplex realtime PCR đƣợc tạo ra là đặc 
hiệu có thể sử dụng để kiểm chứng các mẫu bệnh phẩm để có thể đánh giá đƣợc độ 
nhạy và độ đặc hiệu. 
3.2.4.2. Phản ứng multiplex realtime PCR trên các chủng chuẩn E. coli, S. aureus, P. 
aeruginosa. 
Chúng tôi tiến hành thí nghiệm tƣơng tự với thành phần phản ứng và chu trình 
nhiệt nhƣ trên đối với các chủng chuẩn E. coli, S. aureus, P. aeruginosa. Kết quả thể hiện 
trong Hình 3.17 và Bảng 3.9. 
250 
74 
(A) 
(B) 
(C) 
Hình 3.17. Biểu đồ khuếch đại DNA của các chủng chuẩn 
(A): E. coli, (B): S. aureus, (C): P. aeruginosa 
75 
Bảng 3.9. Giá trị chu kì ngƣỡng của phản ứng multiplex realtime PCR trên các 
chủng chuẩn E. coli, S. aureus, P. aeruginosa 
Ống Mẫu 
Giá trị chu kì ngƣỡng 
HEX (tín hiệu 
mẫu dò Ec) 
FAM (tín hiệu 
mẫu dò Sa) 
CY5 (tín hiệu 
mẫu dò Pa) 
1 2Ec 13,85 0 0 
2 3Ec 13,01 0 0 
3 4Ec 13,36 0 0 
4 2Sa 0 13,79 0 
5 3Sa 0 14,34 0 
6 4Sa 0 15,33 0 
7 2Pa 0 0 11,96 
8 3Pa 0 0 11,10 
9 4Pa 0 0 10,87 
Dựa vào biểu đồ khuếch đại (Hình 3.17) các mẫu DNA chuẩn đều có tín hiệu 
huỳnh quang vƣợt qua tín hiệu huỳnh quang nền và có dạng của một tín hiệu 
realtime PCR chuẩn, đối chiếu vào bảng giá trị chu kì ngƣỡng (Bảng 3.9) nhận thấy 
chu kỳ ngƣỡng của các ống phản ứng khá đồng đều nhau, nhƣ mẫu 2Ec, 3Ec, 4Ec 
giá trị chu kì ngƣỡng lần lƣợt là 13,85; 13,01; 13,36, mẫu 2Sa, 3Sa, 4Sa là 13.79, 
14,34 và 15,33. Mẫu 2Pa, 3Pa, 4Pa lần lƣợt là: 11,96, 11,10 và 10,87. Từ các kết 
quả trên chúng tôi khẳng định bộ sinh phẩm multiplex realtime PCR đã xây dựng là 
đặc hiệu có thể sử dụng để kiểm chứng các mẫu bệnh phẩm để có thể đánh giá đƣợc 
độ nhạy, độ đặc hiệu của chúng. 
3.2.5. Kết quả tối ưu phản ứng realtime PCR 
3.2.5.1. Tối ưu về nhiệt độ gắn mồi 
 Nhiệt độ gắn mồi là một trong các yếu tố ảnh hƣởng lớn đến phản ứng 
realtime PCR vì thành phần phản ứng này gồm nhiều cặp mồi và mỗi cặp mồi lại có 
nhiệt độ bắt mồi khác nhau. Do đó nhiệt độ gắn mồi đƣợc tối ƣu để tránh các sản 
76 
phẩm không đặc hiệu và đảm bảo các gen đích đã chọn đều đƣợc khuếch đại chính 
xác. Dựa trên nhiệt độ của mồi và mẫu dò cũng nhƣ các kết quả khảo sát sơ bộ ở 
trên, phản ứng realtime PCR đƣợc khảo sát ở 3 nhiệt độ bắt mồi là 58oC, 60oC và 
62
o
C, kết quả nhƣ sau: 
Bảng 3.10. Giá trị chu kì ngƣỡng của phản ứng multiplex realtime PCR ở các nhiệt độ 
khác nhau. 
STT Vi khuẩn 
Giá trị chu kì ngƣỡng 
58 
o
C 60
o
C 62
o
C 
1 K. pneumoniae 24,27 24,11 25,99 
2 A. baumanni 12,40 20,20 21,13 
3 Hu Nocq 22,85 37,95 
4 S. aureus Nocq 28,59 29,77 
5 E. coli 15,53 25.02 25,26 
6 P. aeruginosa Nocq 23.63 38,53 
Bảng 3.10 cho thấy giá trị chu kì ngƣỡng của phản ứng realtime PCR ở các 
nhiệt độ 58oC, 60oC và 62oC là khác nhau trong đó ở nhiệt độ 60oC cả 6 mẫu DNA đều 
xuất hiện giá trị chu kì ngƣỡng và các giá trị này có ý nghĩa trong chẩn đoán. Điều này 
chứng tỏ 60oC là nhiệt độ thích hợp cho phản ứng multiplex realtime PCR. 
3.2.5.2. Kết quả tối ưu Master mix 
 Để tối ƣu thành phần khác tham gia vào phản ứng realtime PCR, chúng tôi 
lựa chọn 2 master mix: master mix của IDT (hãng tổng hợp mồi và mẫu dò) và 
master mix của hãng Hàn Quốc (HQ). Thông thƣờng thành phần cơ bản của master 
mix bao gồm buffer, dNTPs, MgCl2. Tuy nhiên, dNTPs, MgCl2 của mỗi hãng có 
nồng độ khác nhau. Hơn nữa, nồng độ của các thành phần này ảnh hƣởng rất lớn 
đến độ nhạy và độ đặc hiệu của phản ứng PCR. Do đó, chúng tôi khảo sát 2 loại 
master mix trong phản ứng realtime PCR nhiều gen đích để lựa chọn master mix. 
Kết quả thể hiện ở Bảng 3.11 cho thấy trong các trƣờng hợp master mix của hãng 
HQ đều cho giá trị Cq chậm hơn master mix của IDT từ 3 chu kỳ, chính vì vậy 
chúng tôi lựa chọn master mix của IDT cho các phản ứng multiplex realtime PCR. 
77 
 Bảng 3.11: Giá trị chu kì ngƣỡng ở phản ứng multiplex realtime PCR với master mix IDT 
và HQ 
STT 
Vi khuẩn 
Giá trị chu kì ngƣỡng 
Master mix IDT Master mix HQ 
1 S. aureus 22,28 25,17 
2 E. coli 19,02 22,60 
3 P. aeruginosa 21,23 24,46 
4 A. baumanni 20,37 23,26 
5 K. pneumoniae 24,21 26,7 
6 Human 23,22 25,34 
Nhƣ vậy, chúng tôi lựa chọn nhiệt độ bắt mồi và mẫu dò là 60oC và master 
mix IDT cho phản ứng multiplex realtime PCR. 
3.2.6. Kết quả xác định ngưỡng phát hiện của phản ứng multiplex realtime PCR 
Ngƣỡng phát hiện là nồng độ tối thiểu (bậc pha loãng tối đa) mà tại đó bộ sinh 
phẩm vẫn phát hiện đƣợc các vi khuẩn. Để xác định đƣợc ngƣỡng phát hiện của bộ sinh 
phẩm multiplex realtime PCR, chúng tôi thực hiện bằng cách nuôi cấy các vi khuẩn gây 
nhiễm khuẩn bệnh viện, đếm số lƣợng chia ra các mẫu khác nhau, các mẫu này đƣợc 
tách chiết DNA và chạy realtime PCR. Kết quả thể hiện ở Bảng 3.12 nhƣ sau: 
Bảng 3.12: Giá trị chu kì ngƣỡng của phản ứng multiplex realtime PCR với các nồng 
độ khác nhau 
STT 
Vi khuẩn 
Giá trị chu kì ngƣỡng 
10
3
/mL 10
4
/mL 10
5
/mL 10
6
/mL 
1 S. aureus 29,78 28,56 24,21 18,95 
2 E. coli 28,98 25,24 20,37 17,34 
3 P. aeruginosa 29,35 28,88 23,22 28,16 
4 A. baumanni 28,63 27,86 26,78 24,56 
5 K. pneumoniae 28,72 27,45 26,20 22,18 
6 Human 29,23 28,34 27,89 28,23 
78 
Kết quả cho thấy ở các nồng độ đã nghiên cứu đƣờng tín hiệu huỳnh quang 
đều vƣợt qua đƣờng tín hiệu nền và có dạng của một đƣờng realtime PCR chuẩn. 
Tuy nhiên ngay ở nồng độ 103 CFU/mL giá trị chu kì ngƣỡng xuất hiện trƣớc chu 
kỳ 35, các tín hiệu huỳnh quang rõ nét, do đó ngƣỡng phát hiện của phản ứng 
multiplex realtime PCR của chúng tôi là 103 CFU/mL vi khuẩn mỗi loại. Theo Yang 
Q và cộng sự trộn chủng Acinetobacter spp kháng carbapenem vào mẫu đờm và 
phân thì ngƣỡng phát hiện là 102 CFU/mL [105]. 
3.2.7. Kết quả tạo các đối chứng dương 
3.2.7.1. Kết quả tạo các đối chứng dương cho vi khuẩn K. pneumoniae 
Nhân bản gen Cyt: DNA tổng số của chủng vi khuẩn K. pneumoniae đƣợc 
tiến hành PCR với cặp mồi đặc hiệu. 
KpCytF: 5’-CCAGTTAGCGACCGAATCTAAT-3’; 
KpCytR: 5’-CGGGTGATCTGCTCATGAAT-3’ 
với chu trình nhiệt tƣơng ứng. Sau đó phân tích điện di trên gel agarose, kết 
quả đƣợc thể hiện trên Hình 3.18: 
Hình 3.18. Kết quả điện di sản phẩm PCR nhân bản gen Cyt 
của chủng K. pneumoniae 
Đường chạy 1: Sản phẩm PCR đối chứng âm (không khuôn); đường chạy 2: Sản 
phẩm PCR nhân bản gen Cyt của chủng K. pneumoniae bằng cặp mồi KpCytF/R; Đường 
chạy M: Thang DNA chuẩn 100 bp (Thermo) 
Kết quả cho thấy sản phẩm PCR thu đƣợc có kích thƣớc và hàm lƣợng đảm 
bảo cho quá trình gắn vào vector tách dòng. 
Tách dòng và xác định trình các gen Cyt của chủng K. pneumoniae 
Sản 
phẩm 
PCR 
79 
Sản phẩm PCR đƣợc gắn vào vector tách dòng pCR2.1 (Invitrogen) theo quy 
trình đã trình bày ở phần phƣơng pháp. Sau đó, sản phẩm gắn đƣợc biến nạp vào tế 
bào khả biến E. coli DH5α. 
Vi khuẩn E. coli chủng DH5α sau khi xử lý CaCl2, màng tế bào trở nên xốp, 
giúp cho vector pCR2.1 (đã gắn sản phẩm PCR) có thể xâm nhập vào tế bào một 
cách dễ dàng hơn. Giai đoạn sốc nhiệt kế tiếp (42oC trong 60 giây) để kích thích sự 
biến nạp plasmid vào trong tế bào. Sau đó tế bào đƣợc cấy trải lên môi trƣờng 
dƣỡng chất, giúp cho tế bào hồi phục, nhờ sự trợ giúp của bộ máy tổng hợp trong tế 
bào mà plasmid tiến hành sao mã, phiên mã và dịch mã tạo nên các protein tƣơng 
ứng. Gen kháng kháng sinh đƣợc chọn làm dấu hiệu chọn lọc để phân biệt những tế 
bào có tiếp nhận DNA plasmid trong số những tế bào không tiếp nhận. Toàn bộ quá 
trình tiến hành thực hiện nhƣ đã trình bày trong phần phƣơng pháp. Kết quả biến 
nạp đƣợc thể hiện ở Hình 3.19: 
Hình 3.19. Kết quả biến nạp vector pCR2.1 (đã gắn sản phẩm PCR) vào tế bào 
E. coli chủng DH5α 
Để tiến hành chọn dòng, chúng tôi sử dụng phƣơng pháp PCR từ khuẩn lạc, 
chọn ngẫu nhiên 15 khuẩn lạc để tiến hành PCR với cặp mồi KpCytF/R và chu trình 
nhiệt phù hợp kết quả thể hiện ở Hình 3.20. 
80 
Hình 3.20. Kết quả PCR trực tiếp từ khuẩn lạc với cặp mồi KpCytF/R 
1 – 15: Sản phẩm PCR với cặp mồi KpCytF/R từ các khuẩn lạc số 1-15 tương ứng; 
Giếng M: Thang DNA 100 bp 
Kết quả điện di Hình 3.20 cho thấy trong 15 khuẩn lạc đã chọn để tiến hành 
PCR, các khuẩn lạc đều cho sản phẩm PCR có kích thƣớc khoảng hơn 100 bp. Nhƣ 
vậy, khả năng 15 dòng tế bào này đều chứa plasmid tái tổ hợp mang gen đích. Từ đó, 
tiến hành tách chiết plasmid và giải trình tự các gen đã thu đƣợc. 
Dòng khuẩn lạc 1, 4, 7 đƣợc chọn nuôi cấy trong môi trƣờng LB có bổ sung 
kháng sinh ampicillin 100 μg/ml hoặc kanamycin 50 μg/ml và nuôi lắc 37oC, 200 
vòng/phút để nhân lên với số lƣợng lớn. Sau khi tách chiết plasmid theo quy trình 
nhƣ đã trình bày ở phần phƣơng pháp, kiểm tra trên gel agarose 0,8%. Kết quả điện 
di đƣợc thể hiện ở Hình 3.21: 
1 2 3 
Hình 3.21. Kết quả điện di plasmid tái tổ hợp mang gen Cyt 
Giếng 1 – 3: Plasmid tách chiết từ các khuẩn lạc số 1, 4, 7 
200 bp 
75 bp 
500 bp 
Sản 
phẩm 
PCR 
81 
Kết quả sau khi chạy điện di cho thấy 3 băng đậm, rõ nét, thể hiện 3 trạng 
thái khác nhau của plasmid. Điều này chứng tỏ quá trình chiết tách và tinh sạch 
DNA plasmid đã thành công, loại bỏ hoàn toàn RNA và thu plasmid. 
Tiến hành giải trình tự 3 dòng plasmid tái tổ hợp trên. Các trình tự đƣợc phân 
tích và so sánh bằng phần mềm bioedit và NTIvector, kết quả các trình tự giống 
nhau và chính là vùng gen Cyt đã dùng thiết kế mồi và mẫu dò, cụ thể nhƣ sau: 
1 CCAGTTAGCG ACCGAATCTA ATTATCTTGA AGTCTGTTAT ATCCTGCTGT 
51 ACGGCGAAAA GCCGACCCAG GCCGAATATG ACGAATTCAA AACTACCGTC 
101 ACCCGCCACA CCATGATTCA TGAGCAGATC ACCCG-135 
Nhƣ vậy, chúng tôi đã tạo thành công đối chứng dƣơng là plasmid 
pCR2.1/KpCyt mang gen đích Cyt của chủng K. pneumoniae dùng trong phản ứng 
multiplex realtime PCR. 
3.2.7.2. Kết quả tạo đối chứng dương xác định chủng S. aureus 
Tƣơng tự gen Nuc của vi khuẩn S. aureus đƣợc tiến hành PCR với cặp mồi: 
SaNuc_For: AGGGATGGCTATCAGTAATGTTT; 
SaNuc_Rev: CGCCGTTATCTGTTTGTGATG, 
gắn sản phẩm vào vector tách dòng pBT, chọn dòng và xác định trình tự. Kết 
quả trình tự thu đƣợc chính là vùng gen đƣợc thiết kế mồi và mẫu dò của chủng S. 
aureus. Nhƣ vậy đã có đối chứng dƣơng mang vùng gen đích Nuc của chủng vi 
khuẩn S. aureus. 
1 AGGGATGGCT ATCAGTAATG TTTCGAAAGG GCAATACGCA AAGAGGTTTT 
51 TCTTTTTCGC TACTAGTTGC TTAGTGTTAA CTTTAGTTGT AGTTTCAAGT 
101 CTAAGTAGCT CAGCAAATGC ATCACAAACA GATAACGGCG - 141 
3.2.7.3. Kết quả tạo đối chứng dương xác định chủng P. aeruginosa 
Tƣơng tự gen Gyr của vi khuẩn P. aeruginosa đƣợc tiến hành PCR với cặp 
mồi: 
PaGyr_For: CACCCTGCTGTTGACCTTCTT; 
PaGyr_Rev: CTGGTCGTCCTTGATGTACTG, 
gắn sản phẩm vào vector tách dòng pBT, chọn dòng và xác định trình tự. Kết quả 
trình tự thu đƣợc chính xác là vùng gen đƣợc thiết kế mồi và mẫu dò của chủng P. 
aeruginosa. Nhƣ vậy đã có đối chứng dƣơng mang vùng gen đích Gyr của chủng vi 
khuẩn P. aeruginosa. 
82 
1 CCTGCTGTTG ACCTTCTTCT TCCGCCAGAT GCCCGAGCTG ATCGAGCGTG 
51 GCTACATCTA CATCGCCCAG CCCCCGTTGT ACAAGGTCAA GCGCGGCAAG 
101 CAGGAGCAGT ACATCAAGGA CGACCAG - 127 
3.2.7.4. Kết quả tạo đối chứng dương xác định chủng A. baumannii 
 Thực hiện tƣơng tự chúng tôi đã tạo thành công đối chứng dƣơng là plasmid 
pCR2.1/AcOxa mang gen đích Oxa của chủng A. baumanni dùng trong phản ứng 
multiplex realtime PCR. 
3.2.7.5. Kết quả tạo đối chứng dương cho chủng E. coli 
Kết quả xác định trình tự cho thấy các dòng plasmid tái tổ hợp thu đƣợc đều 
mang đoạn gen Ycc đảm bảo làm đối chứng dƣơng trong phản ứng multiplex 
realtime PCR xác định các đối tƣợng nhiễm khuẩn bệnh viện. 
3.2.7.6. Kết quả tạo đối chứng dương mang gen GADPH 
Tƣơng tự các đối chứng dƣơng, gen GADPH cũng đƣợc nhân bản, gắn vào 
vector tách dòn