Luận án Nghiên cứu sự phát sinh phôi soma từ nuôi cấy lớp mỏng tế bào lá cây cọc rào (Jatropha curcas L.) và ứng dụng trong vi nhân giống

986) ở m c ý nghĩ 5% 
[86]. 
Phương pháp phân tích các y u tố chính dự tr n bảng số li u trung bình về tỷ l 
hình thành ph i, số lượng ph i và khối lượng ph i củ các thí nghi m sử d ng các cid 
amine (proline, glutamine, adenine sulphate) và spermidine. Phương pháp này ược 
thực hi n bằng phần mềm Minitab® 16.2.2 (State College, Pennsylvania, USA). 
2.4. Điều kiện nuôi cấy 
Điều ki n nu i cấy trong phòng thí nghi m: Th i gi n chi u sáng là 10h/ngày, 
cư ng ộ chi u sáng là 2500 100 lux, nhi t ộ: 25 2C, ộ m trung bình: 60 
5%. 
Điều ki n nu i trồng ngoài vư n ươm: Th i gi n chi u sáng theo ngày, cư ng ộ 
chi u sáng 5000 500 lux, nhi t ộ 25 5C, ộ m trung bình 75 5%. 
2.5. Địa điểm và thời gian tiến hành thí nghiệm 
Địa điểm thí nghiệm: Phòng Thí nghi m Trọng i m Quốc Gi về C ng ngh 
T bào Thực vật, Vi n Sinh học Nhi t ới. 
Thời gian thực hiện: Th i gian thực hi n từ tháng 01/2011 n tháng 03/2015. 
58 
Chƣơng 3. KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN 
3.1. Khảo sát tạo nguồn mô sẹo có khả năng sinh phôi từ nuôi cấy lớp mỏng tế bào 
lá 
3.1.1. Ảnh hưởng của các auxin ngoại sinh lên sự phát sinh hình thái của lớp mỏng 
tế bào lá 
Auxin là y u tố cần thi t cho sự phát sinh ph i với ảnh hưởng khác nh u trong 
từng gi i oạn củ quá trình sinh ph i. Nhu cầu về loại cũng như nồng ộ uxin trong 
quá trình cảm ng ph i th y ổi tùy thuộc vào ki u gen củ thực vật cũng như loại m 
sử d ng trong nu i cấy. Trong ó, 2,4˗D và NAA là h i loại uxin ược sử d ng nhiều 
nhất, 2,4˗D chi m 50% và NAA chi m 25% trong các trư ng hợp phát sinh ph i 
[168]. 
Ảnh hưởng của auxin NAA, IBA lên sự phát sinh hình thái của lớp mỏng tế 
bào lá cây cọc rào 
Sau 28 ngày nu i cấy tr n m i trư ng MS bổ sung IBA và NAA ri ng l ở các 
nồng ộ khác nh u, k t quả cho thấy các mẫu cấy lớp mỏng lá củ cây cọc rào kh ng 
có sự hình thành m sẹo mà còn có dấu hi u hó nâu và ch t. Từ k t quả thu ược, 
chúng t i có th k t luận rằng IBA và NAA là nh ng loại uxin ngoại sinh kh ng thích 
hợp cảm ng sự hình thành m sẹo củ lớp mỏng t bào lá cây cọc rào (Hình 3.1). 
Hình 3.1. Hình thái TCL lá s u 28 ngày nu i cấy tr n m i trư ng 
bổ sung IBA và NAA; a. IBA: 0,1 mg/l b. IBA: 0,5 mg/l c. IBA: 1,0 mg/l d. IBA: 1,5 mg/l 
e. NAA: 0,1 mg/l f. NAA: 0,5 mg/l g. NAA: 1,0 mg/l h. NAA: 1,5 mg/l 
59 
Ảnh hưởng của 2,4-D lên sự phát sinh hình thái của lớp mỏng tế bào lá cây 
cọc rào 
Đối với thí nghi m bổ sung 2,4˗D, s u 28 ngày nu i cấy tỷ l mẫu cấy sống ở 
nghi m th c kh ng bổ sung 2,4˗D là 20,36%. Tỷ l này là rất thấp so với các nghi m 
th c có bổ sung 2,4˗D. Tỷ l mẫu sống ở các nghi m th c bổ sung 0,5 – 1,5 mg/l 2,4-
D ạt tr n 90%, trong ó nghi m th c bổ sung 1,0 mg/l và 1,5 mg/l 2,4-D cho k t quả 
lần lượt là 93,58% và 92,22%. K t quả cũng cho thấy tỷ l tạo m sẹo c o khi bổ sung 
2,4-D ở nồng ộ 0,5 – 1,5 mg/l (tỷ l ạt ược lần lượt là 98,40%, 97,95% và 98,79%). 
Trong khi ó, nghi m th c ối ch ng thì không có sự hình thành m sẹo. Đối với chỉ 
ti u về khối lượng, ở nghi m th c kh ng bổ sung 2,4-D và nghi m th c bổ sung 0,1 
mg/l 2,4-D thì khối lượng ạt ược ều rất thấp (lần lượt là 0,80 mg và 8,01 mg ối 
với chỉ ti u khối lượng tươi; 0,16 mg và 1,13 mg ối với chỉ ti u khối lượng kh ) so 
với các nghi m th c còn lại. Khi tăng nồng ộ 2,4-D bổ sung từ 0,5 – 1,5 mg/l, khối 
lượng tươi m sẹo tăng xấp xỉ 10 lần và khối lượng kh tăng khoảng 4 – 5 lần so với 
nghi m th c bổ sung 0,1 mg/l 2,4-D. Khối lượng tươi và khối lượng kh củ nghi m 
th c bổ sung 0,5 mg/l 2,4-D lần lượt ạt 77,75 mg và 4,11 mg. Các nghi m th c bổ 
sung 2,4-D nồng ộ c o hơn có sự gi tăng kh ng nhiều nhưng khác bi t về mặt thống 
k ở các chỉ ti u này so với nghi m th c 0,5 mg/l 2,4-D. K t quả ở nghi m th c bổ 
sung 1,0 mg/l và 1,5 mg/l 2,4-D kh ng có khác bi t, với khối lượng tươi ạt lần lượt là 
80,44 mg và 81,62 mg, khối lượng kh ạt lần lượt là 5,20 mg và 4,71 mg. (Bảng 3.1). 
Bảng 3.1. Ảnh hưởng của các nồng độ 2,4-D lên sự phát sinh hình thái sau 28 ngày 
nuôi cấy 
Nghiệm thức 
Nồng độ 2,4-D 
(mg/l) 
Khối 
lƣợng tƣơi 
(mg) 
Khối lƣợng 
khô (mg) 
Tỷ lệ tạo mô 
sẹo (%) 
Tỷ lệ sống 
(%) 
D0 0,0 0,80d
x
 0,16e 0,00c 20,36d 
D1 0,1 8,01c 1,13d 10,52b 60,18c 
D2 0,5 77,75b 4,11c 98,40a 90,30b 
D3 1,0 80,44a 5,20a 97,95a 93,58a 
D4 1,5 81,62a 4,71b 98,79a 92,22ab 
ANOVA
y
CV% 
* 
77,24 
* 
68,58 
* 
77,47 
* 
41,16 
x: Các trị số có chữ cái giống nhau trên cùng một cột thì không có sự khác biệt theo trắc nghiệm phân 
hạng LSD. y *: khác bi t có m c ý nghĩ ở p ≤ 0,05. 
60 
Qu n sát hình thái giải phẫu bằng phương pháp nhuộm kép cetoc rmine và 
Ev n’s blue ược sử d ng nhuộm t bào. Các t bào có khả năng phát sinh ph i có 
nhân lớn và t bào chất ậm ặc nhuộm màu ỏ sáng mạnh với cetoc rmine. K t quả 
cho thấy tr n m i trư ng có bổ sung 0,5 mg/l 2,4-D có hi u quả cảm ng sự hình 
thành m sẹo có khả năng sinh ph i som cây cọc rào. 
Hình 3.2. Hình thái TCL lá s u 28 ngày nu i cấy tr n m i trư ng bổ sung 2,4-D 
D0. Đối chứng; D1. 0,1mg/l; D2. 0,5 mg/l; D3. 1,0 mg/l; D4. 1,5 mg/l 
D5. Mô sẹo trên môi trường MS có bổ sung 2,4-D (0,5 mg/l) sau 28 ngày được nhuộm bằng 
acetocarmine và Evan’s Blue để phân biệt tế bào có khả năng sinh phôi. 
61 
3.1.2. Ảnh hưởng của sự kết hợp 2,4-D và kinetin lên khả năng phát sinh phôi soma 
Phương pháp phát sinh ph i từ t bào som ược áp d ng thành c ng tr n cây 
cọc rào. Auxin tổng hợp như 2,4˗D ặc bi t hi u quả trong vi c thúc y sự thi t lập 
và tăng sinh ph i hơn các loại uxin khác. Trong gi i oạn cảm ng phát sinh ph i từ 
m sẹo, các t bào sinh ph i ược cảm ng tạo thành s phân chi và tạo n n các c m 
t bào ph i hình cầu. Tuy nhi n, sự phát tri n củ các c m t bào ph i kh ng ược ghi 
nhận, số các c m t bào ph i này có hình cầu và kh ng có sự phát tri n ở các gi i 
 oạn s u (gi i oạn kéo dài, hình thủy l i h y gi i oạn lá mầm). Điều này có th ược 
giải thích rằng 2,4-D có tác ộng ối ngh ch nh u trong sự phát sinh ph i som . Khi 
bổ sung 2,4-D ở nồng ộ thích hợp vào m i trư ng nu i cấy, các t bào m sẹo tăng 
sinh và hình thành các t bào có khả năng sinh ph i, tuy nhi n, 2,4-D lại ngăn cản các 
c m t bào ph i hình cầu phát tri n s ng các gi i oạn s u.Vì vậy, trong nghi n c u về 
phát sinh hình thái, 2,4-D thư ng ược sử d ng ở các nồng ộ thấp vào gi i oạn khởi 
 ầu củ quá trình phát sinh m sẹo củ lớp mỏng t bào. Đ kích thích tăng trưởng củ 
phôi soma, các c m t bào này cần ược chuy n s ng m i trư ng kh ng có uxin. Khi 
m i trư ng nu i cấy thi u uxin, các gen ngăn cản ph i chuy n s ng gi i oạn hình 
tim s kh ng bi u hi n ược (Zimmerm n, 1993) [222]. Jh và cộng sự (2007) [89] 
ghi nhận m sẹo có khả năng phát sinh ph i ược thu nhận bằng cách nu i cấy mẫu lá 
tr n m i trư ng MS có bổ sung 2,0 mg/l KIN. K thừ k t quả thí nghi m 1 và các 
nghi n c u về sự phát sinh ph i ở cây cọc rào, thí nghi m này ti p t c nghi n c u ảnh 
hưởng củ KIN có hoặc kh ng k t hợp với 2,4-D (0,5 mg/l) l n khả năng sinh ph i 
soma từ m sẹo ược cảm ng bởi nu i cấy lớp mỏng t bào lá cây cọc rào trưởng 
thành. 
S u 8 tuần nu i cấy, k t quả thí nghi m cho thấy 2,4-D và KIN bổ sung vào m i 
trư ng nu i cấy với các nồng ộ khác nh u có ảnh hưởng khác nh u l n sự hình thành 
ph i từ m sẹo cây cọc rào. Khi bổ sung ri ng l KIN vào m i trư ng nu i cấy, tỷ l 
hình thành ph i từ m sẹo ạt tốt nhất ở nồng ộ KIN bổ sung là 1,0 mg/l (79,29%) 
với khối lượng tươi thu ược là 60,33 mg. Vi c tăng nồng ộ KIN tr n 1,0 mg/l bổ 
sung vào m i trư ng cho thấy tỷ l phát sinh ph i từ m sẹo giảm rõ r t (dưới 50%), 
kéo theo ó là khối lượng tươi thu ược chỉ ạt xấp xỉ 1/2 lần so với nghi m th c bổ 
sung 1,0 mg/l KIN (27,14 mg và 28,38 mg lần lượt ở nghi m th c bổ sung 1,5 mg/l và 
62 
2,0 mg/l KIN). K t quả ở bảng 3.2 cũng cho thấy, m i trư ng bổ sung 0,5 mg/l 2,4˗D 
k t hợp với 0,5 mg/l KIN cho tỷ l phát sinh ph i từ m sẹo cây cọc rào thấp nhất 
(30,43%). nghi m th c k t hợp 0,5 mg/l 2,4˗D và 1,0 mg/l KIN bổ sung vào môi 
trư ng, tỷ l phát sinh ph i tăng l n 77,33%. Tỷ l này cũng xấp xỉ so với nghi m th c 
bổ sung 1,0 mg/l KIN (79,29%). Khi tăng nồng ộ KIN bổ sung k t hợp với 0,5 mg/l 
2,4-D vào m i trư ng nu i cấy, tỷ l hình thành ph i cũng giảm xuống (56,72% và 
49,52% lần lượt ở nghi m th c k t hợp bổ sung 1,5 mg/l và 2,0 mg/l KIN). Điều này 
cũng xảy r tương tự ở các nghi m th c bổ sung KIN ri ng l có nồng ộ tr n 1,0 
mg/l. Qu thí nghi m này, xác nh ược sự k t hợp gi 2,4˗D và KIN có hi u quả 
trong vi c cảm ng hình thành ph i từ m sẹo có khả năng phát sinh ph i som cây 
cọc rào. Như vậy, m i trư ng khoáng cơ bản MS có bổ sung 0,5 mg/l 2,4˗D và 1,0 
mg/l KIN là tốt nhất trong vi c cảm ng hình thành ph i từ m sẹo có khả năng sinh 
ph i som cây cọc rào ( ạt 62,95 mg khối lượng tươi với tỷ l hình thành ph i là 
77,33%) (Hình 3.3a và Hình 3.3b). 
Bảng 3.2. Ảnh hưởng của 2,4-D và kinetin lên sự phát sinh phôi từ mô sẹo 
Nghiệm 
thức 
2,4-D 
(mg/l) 
Kinetin 
(mg/l) 
Khối lƣợng tƣơi (g) 
Tỷ lệ hình thành 
phôi (%) 
A1 0,5 0,5 12,86d
x
 30,43f 
A2 0,5 1,0 62,95a 77,33a 
A3 0,5 1,5 50,52b 56,72b 
A4 0,5 2,0 33,19c 49,52c 
A5 - 0,5 14,52d 41,33e 
A6 - 1,0 60,33a 79,29a 
A7 - 1,5 27,14c 46,76d 
A8 - 2,0 28,38c 44,67d 
ANOVA
y
CV% 
* 
52,08 
* 
30,89 
x: Các trị số có chữ cái giống nhau trên cùng một cột thì không có sự khác biệt theo trắc nghiệm phân 
hạng Duncan. y *: khác bi t có m c ý nghĩ ở p ≤ 0,05. 
M sẹo hình thành tr n m i trư ng MS có bổ sung 0,5 mg/l 2,4˗D và 1,0 mg/l 
KIN ược giải phẫu và nhuộm bằng phương pháp nhuộm kép cetoc rmine và Ev n’s 
blue (Gupta và Holmstrom, 2005) [74]. Các t bào có khả năng phát sinh ph i có nhân 
lớn và t bào chất ậm ặc khi nhuộm bắt màu ỏ sáng mạnh với cetoc rmine (Hình 
3.3c). Các t bào nằm trong khối m sẹo kh ng phát sinh ph i có hạch nhân rất nhỏ 
63 
n n nh ng vật li u b n trong t bào ược nhuộm ỏ bởi cetoc rmine rất khó ược 
phát hi n trong khi toàn bộ t bào bắt màu x nh củ ph m nhuộm Ev n’s blue (Hình 
3.3d). 
Hình 3.3. Hình thái khối m sẹo và ph i 
a. Hình thái khối mô sẹo và phôi soma cây cọc rào trên môi trường MS có bổ sung 2,4-D (0,5 
mg/l) và KIN (1,0 mg/l); b. Hình thái khối mô sẹo và phôi soma cây cọc rào trên môi trường 
MS có bổ sung KIN (1,0 mg/l); c, d. Mô sẹo được nhuộm bằng acetocarmine và Evan’s Blue 
để phân biệt tế bào có khả năng sinh phôi 
K t quả cho thấy, khi bổ sung k t hợp hoặc ri ng l 2,4˗D và KIN ở các nồng ộ 
khác nhau, ph i phát sinh tr n tất cả các nghi m th c với tỷ l mẫu phát sinh ph i và 
khối lượng tươi củ ph i hình thành tr n mẫu là khác nh u (Bảng 3.2). Tỷ l m sẹo 
phát sinh ph i c o nhất ược ghi nhận tr n m i trư ng bổ sung ri ng l 1,0 mg/l KIN 
(79,29%) và m i trư ng bổ sung k t hợp 0,5 mg/l 2,4-D và 1,0 mg/l KIN (77,33%). 
K t quả ghi nhận về hình thái ch ng minh sự hi n di n củ uxin ri ng l h y uxin 
k t hợp với một cytokinin là cần thi t cho sự thành lập các t bào h y nhóm các t bào 
có khả năng sinh ph i. Tuy nhi n, uxin lại cản trở sự sinh ph i ở các gi i oạn ti p 
theo củ quá trình phát sinh ph i (gi i oạn ph i hình tim, hình thuỷ l i, lá mầm). 
64 
Trong thí nghi m này k t quả ghi nhận ược ở nh ng m i trư ng có bổ sung 2,4˗D, 
m sẹo từ mẫu cấy lớp mỏng lá chỉ hình thành nh ng ph i hình cầu, kh ng ti n n 
gi i oạn hình thành và phát tri n ở nh ng gi i oạn ti p theo củ ph i. Mẫu cấy tr n 
m i trư ng bổ sung 1,0 mg/l KIN ạt tỷ l c o về số m sẹo phát sinh phôi (79,29%) 
và phôi soma phát tri n qu nhiều gi i oạn: dạng cầu, dạng tim, dạng thủy l i và dạng 
lá mầm. 
Vi c sử d ng cytokinin ri ng l tạo ph i v tính từ ph i hợp tử non cũng ạt 
 ược nh ng thành c ng tr n các loài, b o gồm cả thực vật hạt kín và hạt trần. Kum ri 
và J iw l (1998) nhận thấy rằng vi c sử d ng cytokinin ri ng l có tác d ng kích thích 
phát sinh phôi soma cây Terminalia arjuna [103]. Cytokinin kích thích quá trình phân 
chi t bào mà kh ng b kìm h m bởi các t bào xung qu nh. Bản chất củ quá trình 
phân chi t bào có ý nghĩ quy t nh, chỉ có sự phân chi song song hoặc xi n là dẫn 
 n sự hình thành ph i v tính. Mặt khác, vi c bổ sung cytokinin trong suốt gi i oạn 
bi t hó có th bù ắp cho nh ng bất lợi mà uxin gây r l n sự phát tri n củ m phân 
sinh (Dương Tấn Nhựt, 2007) [12]. Ph i cây ậu nành khi ch u tác ộng củ cytokinin 
thì phát tri n mạnh hơn, trong khi ó, m phân sinh ỉnh ti p t c kéo dài tạo n n v số 
chồi. K limuthu và cộng sự (2007) k t luận rằng, ph i som cũng ược cảm ng tr n 
m i trư ng chỉ ch cytokinin ri ng l chẳng hạn như BAP [93]. 
3.2. Khảo sát khả năng tăng sinh, sự biệt hóa và trƣởng thành của nguồn mô sẹo 
có khả năng sinh phôi: ảnh hƣởng của một số nồng độ acid amine và spermidine 
3.2.1. Ảnh hưởng của nồng độ proline lên sự hình thành phôi soma 
Hầu h t các quá trình phát tri n ở thực vật ược iều khi n bởi các hormon thực 
vật. Sự cảm ng tạo ph i v tính cũng ược ki m soát bằng cách iều khi n các thành 
phần củ chất iều hò sinh trưởng trong m i trư ng nu i cấy. Ngoài r vi c bổ sung 
các amino cid ngoại sinh vào m i trư ng nu i cấy ược báo cáo là có tác d ng 
thúc y sự phát sinh ph i v tính ở một số loài thực vật (W ng và cộng sự, 2002) 
[214]. Amino cid là một nguồn nitơ h u cơ (dạng khử) ược chuy n hó rất nh nh 
trong t bào thực vật, kích thích t bào sinh trưởng và phát tri n nh nh hơn (Grimes và 
Hodges, 1990) [72]. Song nhu cầu ở các loài thực vật khác nh u về các chất bổ sung 
và thành phần củ các chất iều hò sinh trưởng cũng khác nh u. 
65 
Bảng 3.3. Ảnh hưởng của nồng độ proline lên sự hình thành phôi soma 
Proline 
(mg/l) 
Số phôi/mẫu Khối lƣợng tƣơi (mg) 
Tỷ lệ hình 
thành phôi/mẫu 
(%) 
0 11,66c
x
 13,00c 23,33d 
250 45,07b 50,07b 50,00c 
500 47,87b 52,83b 60,00bc 
750 72,33a 81,37a 86,67a 
1000 50,70b 56,80b 66,67b 
ANOVA
y
CV% 
* 
45,42 
* 
45,42 
* 
38,71 
x: Các trị số có chữ cái giống nhau trên cùng một cột thì không có sự khác biệt theo trắc nghiệm phân 
hạng LSD. y *: khác bi t có m c ý nghĩ ở p ≤ 0,05. 
Trong thí nghi m này, các m sẹo có khả năng phát sinh ph i ược cấy chuyền 
vào m i trư ng có bổ sung proline ở các nồng ộ khác nh u. S u 4 tuần nu i cấy, k t 
quả thí nghi m cho thấy có sự khác bi t áng k về mặt thống k gi các nghi m th c 
sử d ng proline và nghi m th c ối ch ng. nghi m th c ối ch ng khi kh ng bổ 
sung proline, số lượng ph i hình thành trung bình ạt 11,66 ph i và tỷ l tạo ph i ạt 
23,33%. Các nghi m th c còn lại có bổ sung proline vào m i trư ng nu i cấy, qu các 
chỉ ti u khảo sát cho thấy sự hi n di n củ proline giúp gi tăng hi u quả tạo ph i ở tất 
cả các chỉ ti u theo dõi và cả khối lượng tươi củ mẫu. nghi m th c có nồng ộ 250 
mg/l proline, tỷ l hình thành ph i ạt 50,00%, tăng hơn gấp i so với nghi m th c 
 ối ch ng. Số lượng ph i hình thành tăng l n hơn 4 lần (45,07 ph i/mẫu) so với ối 
ch ng. Khối lượng tươi củ mẫu cấy cũng tăng l n ạt 50,07 mg/mẫu. Khi ti p t c gi 
tăng hàm lượng proline l n, các chỉ ti u theo dõi cũng có sự gi tăng và ạt c o nhất ở 
nghi m th c có thành phần proline bổ sung là 750 mg/l với tỷ l hình thành phôi là 
86,67%, số lượng ph i hình thành là 72,33 ph i/mẫu và khối lượng tươi là 81,37 mg 
(Bảng 3.3; Hình 3.4). Các chỉ ti u ghi nhận ược ở nghi m th c này ều có sự khác 
bi t về mặt thống k so với các nghi m th c còn lại. nghi m th c bổ sung 1000 mg/l 
proline, số li u ghi nhận cho thấy có sự giảm i ở tất cả các chỉ ti u theo dõi so với 
nghi m th c bổ sung 750 mg/l proline. Nồng ộ proline c o c ch sự hình thành ph i 
th hi n khi tỷ l ph i hình thành giảm còn 66,67%, giảm 20% so với nghi m th c 
trước ó. Số lượng ph i hình thành (50,70 ph i) và khối lượng tươi củ mẫu (56,80 
mg) cũng chỉ ạt khoảng 2/3 so với nghi m th c bổ sung 750 mg/l proline. 
66 
Nhìn chung, k t quả thí nghi m cho thấy proline có tác ộng hi u quả ối với sự 
hình thành phôi som từ mẫu cấy m sẹo có khả năng phát sinh ph i củ cây cọc rào. 
Kh ng chỉ giúp gi tăng sự tạo ph i, sự gi tăng khối lượng tươi củ mẫu ở tất cả các 
nghi m th c có bổ sung proline cũng cho thấy proline có hi u quả kích thích sự tăng 
trưởng ở ây là sự gi tăng sinh sinh khối mẫu cấy. 
Proline là một trong nh ng cid mine ược bi t n là có ảnh hưởng n sự kích 
thích phát sinh ph i (Shimizu và cộng sự, 1997) [167]. Proline ri ng l h y k t hợp với 
các cid mine khác có tác d ng kích thích phát sinh ph i ở các loại thực vật khác 
nh u như trong trư ng hợp cây Đậu x nh và Đậu nành, ph i som chỉ hình thành tr n 
m i trư ng có bổ sung proline (Shetty và cộng sự, 1993) [165]. Proline ược xem như 
là nguồn nitơ khử qu n trọng ược chuy n hó và hấp th rất nh nh trong t bào thực 
vật, ngoài r proline còn ược xem như là một nguồn năng lượng sẵn có cho t bào. 
B n cạnh ó, proline còn có ch c năng qu n trọng khác như là bảo v các enzyme 
chống lại sự suy thoái, iều khi n nồng ộ cid trong cytosol. Nồng ộ củ proline có 
tác d ng như là một chất m b n trong t bào chất, chống lại sự gi tăng nồng ộ các 
ion trong kh ng bào, có ch c năng như một chất iều khi n cấu trúc củ nước, làm 
tăng tính t n củ protein và các phân tử sinh học khác dưới iều ki n th nước giảm 
(Schobert, 1977) [159]. S ntos và cộng sự (1996) phát hi n rằng vi c bổ sung 
proline m ng lại hi u quả rõ ràng tr n tổng số lượng protein củ m sẹo phát sinh ph i 
[156]. Báo cáo nhận nh sự có mặt củ proline trong m i trư ng nu i cấy có v như 
 áp ng ược các iều ki n stress, giảm i n th nước trong m i trư ng nu i cấy t 
bào thực vật, tăng sự tích t các chất dinh dưỡng trong t bào và cuối cùng tăng khả 
năng phát sinh ph i som . 
Trong nh ng báo cáo trước ó, proline ược phát hi n ư r nh ng phản hồi tối 
ưu nhất trong sự phát sinh ph i som cả sơ cấp và th cấp tr n cây Ho hồng 
(M rch nt và cộng sự, 1996) [120]. Báo cáo khác cũng ề cập n nh ng v i trò rõ 
ràng củ proline l n sự phát sinh ph i ở cây Ng (Supr s nn và cộng sự, 1994) [185] 
và cây K (Vikr nt và R shis, 2002) [210]. Khi nu i cấy tạo ph i Sâm Ngọc Linh, 
Nhut và cộng sự (2012) nhận thấy nồng ộ proline tối ưu là 300 mg/l [137]. Trong khi 
 ó tr n ối tượng cây Dâu tây thì nồng ộ proline là 0,5 g/l cho hi u quả tạo ph i tốt 
nhất (Bisw s và cộng sự, 2007) [26]. Murch và cộng sự (1999) nghi n c u tr n ối 
67 
tượng cây Đậu phộng thì thấy rằng 100 mg/l proline là nồng ộ thích hợp tạo ph i 
[132]. Tr n ối tượng cây Cà rốt cũng ược cảm ng tạo ph i hi u quả ở nồng ộ này 
(Victori và cộng sự, 1984) [209]. Điều này ch ng minh proline có tác ộng tích cực 
 ối với sự tạo ph i nhưng ở m i loài thực vật khác nh u thì proline có tác d ng ối với 
sự cảm ng tạo ph i với các nồng ộ khác nh u. Theo báo cáo này thì ối với mẫu cấy 
là mô sẹo có khả năng phát sinh ph i cây cọc rào, nồng ộ proline thích hợp cảm ng 
tạo ph i là 750 mg/l. 
3.2.2. Ảnh hưởng của nồng độ glutamine lên sự hình thành phôi soma 
Bảng 3.4. Ảnh hưởng của nồng độ glutamine lên sự hình thành phôi soma 
Glutamine 
(mg/l) 
Số phôi/mẫu 
Khối lƣợng tƣơi 
(mg) 
Tỷ lệ hình 
thành phôi/mẫu 
(%) 
0 11,66c
x
 13,10c 23,33d 
50 33,13c 38,10b 53,33c 
100 46,40b 52,87b 70,00b 
150 67,60a 104,30a 83,33a 
200 48,23b 54,00b 63,33bc 
ANOVA
y
CV% 
* 
46,72 
* 
68,39 
* 
36,93 
x: Các trị số có chữ cái giống nhau trên cùng một cột thì không có sự khác biệt theo trắc nghiệm phân 
hạng LSD. y *: khác bi t có m c ý nghĩ ở p ≤ 0,05. 
Trong thí nghi m này, m sẹo có khả năng phát sinh ph i ược cấy vào m i 
trư ng MS cảm ng phát sinh ph i, có bổ sung glut mine ở các nồng ộ từ 50 n 200 
mg/l. S u 4 tuần nu i cấy, ở tất cả các nghi m th c qu n sát thấy có sự xuất hi n củ 
ph i som cây cọc rào dạng hình cầu. S u ó, có sự xuất hi n củ các dạng ph i hình 
tim, hình thủy l i và h i lá mầm. Tuy nhi n, có sự khác bi t áng k về mặt thống k 
gi các nghi m th c. nghi m th c ối ch ng, mẫu cấy có tỷ l hình thành ph i 
thấp hơn so với các nghi m th c có bổ sung glut mine. Các mẫu ược cấy tr n m i 
trư ng có bổ sung glut mine ở các nồng ộ khác nh u (từ 50 ˗ 150 mg/l) ạt tỷ l hình 
thành ph i c o tr n 50%. Trong ó nghi m th c có bổ sung 150 mg/l glutamine cho 
hi u q