Luận án Nghiên cứu tạo chủng virus PRRS (porcine reproductive and respiratory syndrome) nhược độc và đánh giá khả năng làm giống phục vụ sản xuất vaccine

ra tính an toàn của giống gốc Hanvet1.vn trên lợn 
Đánh giá độ an toàn của giống gốc virus Hanvet1.vn nhược độc trên lợn 5 
tuần tuổi. Tiêm bắp cho lợn lần lượt với các liều: 1x105TCID50, 10x105TCID50, 
20x105TCID50, mỗi liều tiêm cho 04 lợn, lợn đối chứng không tiêm, theo dõi trong 
14 ngày. Kết quả như sau: 
Bảng 3.15. Mức độ an toàn của giống gốc Hanvet1.vn trên lợn 
STT 
Liều tiêm 
TCID50 
Số lợn 
(con) 
Tỷ lệ 
chết/tiêm 
Biểu hiện 
bệnh lý PRRS 
Kết luận 
 1 1x105 4 0/4 Không Đạt an toàn 
2 10x105 4 0/4 Không Đạt an toàn 
3 20x105 4 0/4 Không Đạt an toàn 
4 Đối chứng 4 0/4 Không Đạt an toàn 
 79 
Bảng 3.16. Mức tăng trọng của lợn 
Nhóm lợn Số lợn 
Khối lượng trước 
khi thí nghiệm 
(kg) 
Khối lượng sau 
khi thí nghiệm 
(kg) 
Tăng trọng 
(kg) 
Tăng trọng 
trung bình 
(kg) 
1x105 
TCID50 
01 10,5 14,0 3,5 
4,125 
02 9,5 13,0 3,5 
03 8,5 13,5 5,0 
04 8,0 12,5 4,5 
10x105 
TCID50 
05 8,5 13,0 4,5 
4,125 
06 10,0 13,5 3,5 
07 9,0 13,5 4,5 
08 8,5 12,5 4,0 
20x105 
TCID50 
09 9,5 13,5 4,0 
4,250 
10 10,5 14,0 3,5 
11 8,0 12,5 4,5 
12 9,0 14,0 5,0 
Đối chứng 
(không 
tiêm) 
13 9,0 13,0 4,0 
4,250 
14 10,0 14,5 4,5 
15 9,0 13,0 4,0 
16 9,0 14,5 4,5 
Kết quả kiểm tra độ an toàn của giống gốc virus PRRS Hanvet1.vn nhược độc 
Bảng 3.15 và 3.16 đã cho thấy: Giống gốc Hanvet1.vn không gây các biểu hiện bệnh 
lý của lợn mắc PRRS, rất an toàn đối với lợn, khả năng tăng trọng trung bình của lợn 
sau khi tiêm giữa các lô thí nghiệm và lô đối chứng không tiêm lợn đều phát triển 
bình thường, mức tăng trọng tương đương nhau giữa các lô từ 4,125 đến 4,250 kg (kể 
cả khi được tiêm với liều virus cao gấp 20 lần liều sử dụng thông thường đối với liều 
vaccine PRRS nhược độc theo tiêu chuẩn). 
3.4.3. Khả năng kích thích sinh kháng thể của giống gốc Hanvet1.vn nhược độc 
Tiếp tục đánh giá tính kích thích tạo đáp ứng miễn dịch của chủng 
Hanvet1.vn nhược độc, đây là một trong những chỉ tiêu cơ bản của giống virus phục 
vụ cho sản xuất vaccine, thí nghiệm được tiến hành như sau: 
Sử dụng 24 lợn 5 tuần tuổi khỏe mạnh, chia làm 6 nhóm để gây miễn dịch 
bằng virus PRRS Hanvet1.vn nhược độc ở các liều virus khác nhau. 
Sau khi tiêm miễn dịch 28 ngày, tất cả lợn của 6 nhóm được lấy máu để kiểm 
tra hiệu giá kháng thể bằng phương pháp IPMA. Lợn được thử thách với liều 
 80 
106TCID50 chủng virus PRRS VN07196 độc lực phân lập tại Việt Nam. Sau khi 
công cường độc tiến hành theo dõi các biểu hiện lâm sàng, thân nhiệt, khả năng tăng 
trọng của lợn và lấy máu lợn ở các thời điểm 3, 5, 7, 10, 14, 21 ngày sau khi công 
cường độc để phân lập và xác định virus huyết bằng kỹ thuật rRT-PCR. 
3.4.3.1. Hiệu giá kháng thể của lợn được miễn dịch với giống gốc Hanvet1.vn 
Bảng 3.17. Hiệu giá kháng thể của lợn ở các liều miễn dịch với 
 virus giống gốc PRRS Hanvet1.vn nhược độc 
Nhóm lợn Lợn số 
Liều miễn dịch 
(TCID50/lợn) 
Hiệu giá kháng thể 
(X-1) 
Hiệu giá kháng thể 
trung bình 
Đối chứng 
1 
Không tiêm 
Âm tính 
Âm tính 
2 Âm tính 
3 Âm tính 
4 Âm tính 
Miễn dịch 1 
5 
103 
2.560 
1.522,185 
6 2.560 
7 1.280 
8 2.560 
Miễn dịch 2 
9 
104 
5.120 
2.560,000 
10 2.560 
11 2.560 
12 1.280 
Miễn dịch 3 
13 
105 
5.120 
4.305,389 
14 10.240 
15 2.560 
16 2.560 
Miễn dịch 4 
17 
106 
5.120 
3.620,386 
18 2.560 
19 2.560 
20 5.120 
Miễn dịch 5 
21 
2 106 
2.560 
3.620,386 
22 5.120 
23 2.560 
24 5.120 
Kết quả hiệu giá kháng thể của lợn miễn dịch với giống gốc virus PRRS 
Hanvet1.vn nhược độc, có thể nhận thấy ở liều miễn dịch 103TCID50 và 104TCID50 
mỗi lô có 1/4 lợn có hiệu giá kháng thể thấp 1/1.280, hiệu giá kháng thể trung bình 
thấp nhất lần lượt là 1/1.522,185 và 1/2.560,000. Ở liều miễn dịch 105TCID50 đến 
2x106TCID50 cho hiệu giá kháng thể cao nhất với cả 3 lô lợn, hiệu giá từ trung bình 
 81 
đạt từ 1/3.620,386 đến 1/4.305,389, không có lợn nào có hiệu giá kháng thể thấp dưới 
1/2.560. Như vậy, ở liều miễn dịch 105TCID50/lợn, giống virus PRRS Hanvet1.vn 
nhược độc bắt đầu tạo kháng thể miễn dịch cao và ổn định. 
3.4.3.2. Phân lập virus từ huyết thanh lợn miễn dịch sau công cường độc 
Kết quả phân lập virus từ máu lợn sau khi công cường độc: Một đặc trưng 
của hội chứng rối loạn sinh sản và hô hấp ở lợn là virus huyết. Virus huyết có thể 
xác định bằng phân lập, có giá trị về bệnh sinh và truyền nhiễm, ngoài ra có thể xác 
định bằng phương pháp sinh học phân tử rRT- PCR, có giá trị xác định sự hiện diện 
của virus, thậm chí là dấu vết của virus còn tồn dư. Kiểm tra theo hai cách để đánh 
giá virus huyết, là cơ sở cho nhận xét về tính bảo hộ của vaccine chế tạo từ chủng 
virus PRRS Hanvet1.vn nhược độc sau này. 
Phân lập được virus PRRS từ huyết thanh của các lợn thí nghiệm tại các thời 
điểm 3, 6, 10, 14, 21 ngày sau khi công cường độc. Lô lợn đối chứng có virus huyết 
cao và hiệu giá virus trong máu giảm dần bắt đầu từ ngày thứ 10, đến thời điểm 21 
ngày sau khi công cường độc không còn phân lập được virus nhưng giám định virus 
bằng rRT-PCR từ huyết thanh vẫn còn 2/4 lợn. Các lô lợn gây miễn dịch bằng 
chủng giống gốc Hanvet1.vn nhược độc không phân lập được virus nhưng kết quả 
giám định virus bằng rRT-PCR vẫn có rải rác ở 1 vài lợn ở 4 lô lợn đến ngày thứ 7 
sau công cường độc. Kết quả thể hiện ở Bảng 3.18. 
Bảng 3.18. Kiểm tra virus huyết bằng rRT-PCR và phân lập tại các 
thời điểm sau công cường độc 
STT 
Ngày lấy mẫu huyết thanh kiểm tra virus PRRS 
N0 N3 N6 N10 N14 N21 
Lô 1 
(103TCID50) 
Lợn 1 
Phân lập - - - - - - 
rRT-PCR - + - - - - 
Lợn 2 
Phân lập - - - - - - 
rRT-PCR - - - - - - 
Lợn 3 
Phân lập - - - - - - 
rRT-PCR - - - - - - 
Lợn 4 
Phân lập - - - - - - 
rRT-PCR - + - - - - 
Lô 2 
(104TCID50) 
Lợn 5 
Phân lập - - - - - - 
rRT-PCR - - - - - - 
Lợn 6 
Phân lập - - - - - - 
rRT-PCR - - - - - - 
 82 
STT 
Ngày lấy mẫu huyết thanh kiểm tra virus PRRS 
N0 N3 N6 N10 N14 N21 
Lợn 7 
Phân lập - - - - - - 
rRT-PCR - + + - - - 
Lợn 8 
Phân lập - - - - - - 
rRT-PCR - - - - - - 
Lô 3 
(105TCID50) 
Lợn 9 
Phân lập - - - - - - 
rRT-PCR - - - - - - 
Lợn 10 
Phân lập - - - - - - 
rRT-PCR - + - - - - 
Lợn 11 
Phân lập - - - - - - 
rRT-PCR - - - - - - 
Lợn 12 
Phân lập - - - - - - 
rRT-PCR - + - - - - 
Lô 3 
(106TCID50) 
Lợn 13 
Phân lập - - - - - - 
rRT-PCR - - - - - - 
Lợn 14 
Phân lập - - - - - - 
rRT-PCR - - - - - - 
Lợn 15 
Phân lập - - - - - - 
rRT-PCR - + + - - - 
Lợn 16 
Phân lập - - - - - - 
rRT-PCR - - - - - - 
Lô 4 
(2x106 TCID50) 
Lợn 17 
Phân lập - - - - - - 
rRT-PCR - + - - - - 
Lợn 18 
Phân lập - - - - - - 
rRT-PCR - - - - - - 
Lợn 19 
Phân lập - - - - - - 
rRT-PCR - + + - - - 
Lợn 20 
Phân lập - - - - - - 
rRT-PCR - - - - - - 
Lô đối chứng 
Lợn 21 
Phân lập - + + + + - 
rRT-PCR - + + + + + 
Lợn 22 
Phân lập - + + + + - 
rRT-PCR - + + + + + 
Lợn 23 
Phân lập - + + + + - 
rRT-PCR - + + + + + 
Lợn 24 
Phân lập - + + + + - 
rRT-PCR - + + + + + 
Kết quả thí nghiệm trên lợn cho thấy: Giống gốc virus PRRS Hanvet1.vn gây đáp 
ứng miễn dịch tốt cho lợn, hiệu giá kháng thể trung bình của lợn đạt 1/1.522,185 ở liều 
gây miễn dịch 103TCID50, và cao nhất ở liều miễn dịch 105TCID50 hiệu giá từ trung 
 83 
bình đạt đến 1/4.305,389 đã giúp lợn chống được các biểu hiện bệnh tích của PRRS như 
sốt, triệu chứng lâm sàng, mức độ nhiễm virus huyết. 
3.4.4. Đánh giá đặc tính ổn định của giống gốc virus PRRS Hanvet1.vn 
Để kiểm tra đặc tính ổn định của giống virus PRRS Hanvet1.vn nhược 
độc, tiến hành gây nhiễm giống virus PRRS Hanvet1.vn nhược độc lên tế bào 
Marc 145, theo dõi bệnh tích tế bào (CPE) và thu dịch nuôi cấy của từng đời cấy 
truyền để chuẩn độ xác định hiệu giá virus, mỗi đời nuôi cấy trên 3 chai T25. 
Gây nhiễm và cấy truyền liên tục giống virus PRRS Hanvet1.vn qua 10 đời trên 
tế bào Marc 145 (từ P1 đến P10). 
3.4.4.1. Đánh giá độ ổn định về đặc tính nhân lên của giống gốc virus PRRS Hanvet1.vn 
Chuẩn độ dịch virus thu được từ các chai nuôi cấy của 10 đời cấy truyền, kết 
quả thu được Bảng 3.19 và Hình 3.13. 
Qua các đời nuôi cấy virus, quá trình phát triển và xuất hiện bệnh tích tế bào 
(CPE) đều ổn định, thời gian thu dịch virus dao động từ 96 giờ đến 120 giờ. Nguyên 
dịch virus thu được qua các đời nuôi cấy luôn ổn định, dao động từ 106,33TCID50/ml 
đến 106,70TCID50/ml. 
Bảng 3.19. Hiệu giá giống gốc Hanvet1.vn qua 10 đời cấy truyền 
Đời cấy truyền Chai nuôi 
Hiệu giá virus 
10XTCID50/ml 
Hiệu giá virus 
trung bình 
10XTCID50/ml 
P1 
Chai 1 6,8 
6,67 ± 0,11 Chai 2 6,6 
Chai 3 6,6 
P2 
Chai 1 6,6 
6,57 ± 0,15 Chai 2 6,4 
Chai 3 6,7 
P3 
Chai 1 6,4 
6,47 ± 0,06 Chai 2 6,5 
Chai 3 6,5 
P4 
Chai 1 6,8 
6,70 ± 0,17 Chai 2 6,8 
Chai 3 6,5 
 84 
Đời cấy truyền Chai nuôi 
Hiệu giá virus 
10XTCID50/ml 
Hiệu giá virus 
trung bình 
10XTCID50/ml 
P5 
Chai 1 6,4 
6,47 ± 0,31 Chai 2 6,2 
Chai 3 6,8 
P6 
Chai 1 6,3 
6,47 ± 0,15 Chai 2 6,6 
Chai 3 6,5 
P7 
Chai 1 6,2 
6,33 ± 0,15 Chai 2 6,3 
Chai 3 6,5 
P8 
Chai 1 6,6 
6,60 ± 0,10 Chai 2 6,5 
Chai 3 6,7 
P9 
Chai 1 6,4 
6,47 ± 0,12 Chai 2 6,4 
Chai 3 6,6 
P10 
Chai 1 6,6 
6,43 ± 0,15 Chai 2 6,3 
Chai 3 6,4 
Hình 3.13. Hiệu giá virus PRRS Hanvet1.vn nhược độc ở 10 đời cấy truyền (P1-P10) 
3.4.4.2. Kết quả đánh giá độ ổn định về an toàn giống gốc Hanvet1.vn nhược độc 
khi tiếp đời liên tục trên lợn 
Giống gốc Hanvet1.vn nhược độc có đảm bảo an toàn đối với lợn và có 
nguy cơ cường độc trở lại hay không? Thí nghiệm được tiến hành để kiểm tra độ 
 85 
ổn định về an toàn của giống khi tiếp truyền giống liên tục qua 5 đời lợn: Tiêm 
bắp sau vành tai cho 04 lợn 5 tuần tuổi với liều 106TCID50 giống gốc Hanvet1.vn 
nhược độc, sau 7 ngày lấy máu 04 lợn, mỗi con 1ml tiêm truyền tiếp sang 04 lợn 
khác. Quá trình tiếp truyền được tiến hành lặp lại liên tục 5 đời lợn (đời 01 đến đời 
05). Kết quả thể hiện ở Bảng 3.20. 
Bảng 3.20. Độ an toàn của giống gốc Hanvet1.vn nhược độc với lợn 
khi tiếp truyền liên tục trên 5 đời lợn 
Đời lợn tiếp 
truyền 
Đường tiêm 
Số lượng 
(con) 
Tỷ lệ 
chết/tiêm 
Biểu hiện bệnh lý lợn 
mắc PRRS 
Kết luận 
Đời 01 Bắp thịt 4 0/4 Không Đạt an toàn 
Đời 02 Bắp thịt 4 0/4 Không Đạt an toàn 
Đời 03 Bắp thịt 4 0/4 Không Đạt an toàn 
Đời 04 Bắp thịt 4 0/4 Không Đạt an toàn 
Đời 05 Bắp thịt 4 0/4 Không Đạt an toàn 
Bảng 3.21. Nhiệt độ của lợn ở các đời tiếp truyền giống gốc Hanvet1.vn trong 7 ngày 
Đời lợn Lợn số 
N0 
(oC) 
N1 
(oC) 
N2 
(oC) 
N3 
(oC) 
N4 
(oC) 
N5 
(oC) 
N6 
(oC) 
N7 
(oC) 
Đời 01 
01 39,2 39,0 39,5 39,4 39,4 39,4 39,4 39,3 
02 39,4 39,3 39,3 39,2 39,4 39,4 39,7 39,6 
03 39,2 39,2 39,2 39,4 39,6 39,5 39,3 39,6 
04 39,6 39,2 39,4 39,6 39,8 40,1 39,7 39,3 
Đời 02 
01 39,6 39,9 39,5 39,6 39,5 39,7 39,3 39,5 
02 39,3 39,4 39,3 39,3 39,6 39,4 39,3 39,1 
03 39,5 39,2 39,2 39,4 39,3 39,5 39,6 39,8 
04 39,7 39,6 39,9 39,5 39,5 39,3 39,6 39,4 
Đời 03 
01 39,4 39,4 39,2 39,0 39,5 39,4 39,3 39,6 
02 39,6 39,2 39,2 39,4 39,6 39,7 39,5 39,5 
03 39,2 39,1 39,2 39,4 39,3 39,4 39,6 39,5 
04 39,4 39,3 39,3 39,5 39,5 39,5 39,4 39,4 
Đời 04 
01 39,6 39,6 39,6 39,6 39,6 39,6 39,6 39,6 
02 39,2 39,4 39,3 39,2 39,4 39,6 39,2 39,3 
03 39,6 39,5 39,5 39,4 39,6 39,8 39,4 39,3 
04 39,2 39,4 39,3 39,5 39,6 39,5 39,5 39,6 
Đời 05 
01 39,5 39,5 39,5 39,2 39,4 39,6 39,2 39,3 
02 39,2 39,0 39,2 39,4 39,5 39,6 39,4 39,5 
03 39,3 39,3 39,6 39,4 39,4 39,4 39,2 39,4 
04 39,2 39,4 39,3 39,5 39,6 39,2 39,2 39,6 
Chú thích: N là ký hiệu Ngày đo nhiệt độ của lợn trong thời gian theo dõi thí nghiệm 
 86 
Kết quả theo dõi quá trình tiếp truyền thể hiện trên Bảng 3.20 và 3.21 cho thấy: 
Toàn bộ lợn được tiếp truyền qua các đời đều khỏe mạnh, phát triển bình thường, 
không ốm, bỏ ăn, không có những biểu hiện bệnh lý của lợn mắc PRRS, theo dõi thân 
nhiệt của lợn ở các lô thí nghiệm trong khoảng từ 39oC đến 39,8oC, lợn có tăng thân 
nhiệt nhẹ (thân nhiệt bình thường khoảng 39oC). Như vậy, giống gốc Hanvet1.vn 
nhược độc đảm bảo an toàn đối với lợn và không có nguy cơ cường độc trở lại. 
3.4.4.3. Nghiên cứu môi trường nuôi cấy thích hợp cho tế bào và sự phát triển của 
giống gốc Hanvet1.vn 
Để lựa chọn loại môi trường nuôi cấy tối ưu nhất cho sự phát triển của của tế 
bào cũng như sự nhân lên của virus, thử nghiệm nuôi cấy tế bào Marc 145 được tiến 
hành trên 3 loại môi trường khác nhau là MEM, DMEM, M199, theo dõi sự phát 
triển của tế bào và đánh giá các chỉ tiêu: 
- Năng xuất nhân lên của tế bào 
- Hiệu giá virus thu được 
Để đánh giá năng suất nhân lên của tế bào Marc 145 trên các loại môi trường 
khác nhau, thí nghiệm nuôi tế bào trên các chai T75cm2 với lượng tế bào cấy vào 
ban đầu cố định là 2,5x106 tế bào/chai và sử dụng 3 loại môi trường khác nhau như 
đã nêu ở trên. Thí nghiện được lặp lại 3 lần với các điều kiện giống nhau. Kết quả 
được thể hiện trong Bảng 3.22. 
Bảng 3.22. Năng suất nhân lên của tế bào Marc 145 trên các loại 
 môi trường khác nhau 
Môi trường 
nuôi cấy 
Lượng tế bào 
cấy vào (triệu) 
Lượng tế bào thu 
hoạch (triệu) 
Năng suất 
(%) 
Năng suất 
trung bình (%) 
MEM 
Lần 1 2,5 9,80 392 
417,33 ± 19,69 Lần 2 2,5 11,0 440 
Lần 3 2,5 10,5 420 
DMEM 
Lần 1 2,5 9,60 384 
416,00 ± 23,55 Lần 2 2,5 10,6 424 
Lần 3 2,5 11,0 440 
M199 
Lần 1 2,5 11,2 448 
425,33 ± 16,76 Lần 2 2,5 10,5 420 
Lần 3 2,5 10,2 408 
Qua khảo sát, cho thấy năng suất nhân lên của tế bào trên các môi trường có 
sự sai khác không đáng kể (p = 0,885). Trên môi trường M199 tế bào đạt năng suất 
 87 
nhân cao nhất (425,33%), trên môi trường DMEM năng xuất là nhỏ nhất 
(416,00%). Kết quả thu được cũng cho thấy năng suất nhân lên của tế bào Marc 145 
trên các môi trường thí nghiệm vẫn chưa đạt năng suất cao nhất như các tài liệu đã 
nghiên cứu (khoảng 500%-600%). Vì vậy chúng tôi tiếp tục nghiên cứu và thử 
nghiệm bổ sung thêm một số chất, kết quả thu được nêu trong Bảng 3.23. 
Bảng 3.23. Năng suất nhân lên của tế bào Marc 145 khi bổ sung 
 một số chất vào môi trường nuôi cấy 
Thành phần môi trường 
Lượng tế bào 
cấy vào (triệu) 
Lượng tế bào 
thu hoạch 
(triệu) 
Năng 
suất (%) 
Năng suất 
trung bình 
(%) 
MEM 
+ 0,03% Glutamin 
+ 0,3% TPB 
Lần 1 2,5 13,2 528 
529.33 
±8.22% 
Lần 2 2,5 13,0 520 
Lần 3 2,5 13,5 540 
DMEM 
+ 0,03% Glutamin 
+ 0,3% TPB 
Lần 1 2,5 11,5 460 
469.33 
±8.22% 
Lần 2 2,5 12,0 480 
Lần 3 2,5 11,7 468 
M199 
+ 0,03% Glutamin 
+ 0,3% TPB 
Lần 1 2,5 11,3 452 
461.33 
±8.22% 
Lần 2 2,5 11,5 460 
Lần 3 2,5 11,8 472 
Ghi chú: TPB là Tryptose Photphat Broth; các loại môi trường trên có bổ sung thêm 5% FBS 
Khi phân tích thống kê các kết quả nghiên cứu thể hiện trên Bảng 3.23 bằng 
phương pháp phân tích phương sai một nhân tố cho thấy với môi trường MEM có 
bổ sung thêm Glutamin và TPB hiệu suất nhân lên của tế bào Marc 145 tăng lên 
đáng kể. Với môi trường MEM bình thường năng suất nhân của tế bào chỉ đạt 
417,33%, khi bổ sung thêm Glutamine và TPB năng suất nhân virus đã tăng lên 
529,33%, vượt trội hơn so với môi trường DMEM và môi trường M199. Vì vậy, 
môi trường MEM có bổ sung thêm Glutamine và TPB là môi trường tối ưu nhất 
được lựa chọn để nuôi cấy tế bào Marc 145 (p = 0,00). 
 Sau khi đã chọn được môi trường nuôi cấy tế bào tối ưu, tiếp tục nghiên cứu 
môi trường duy trì tế bào trong quá trình gây nhiễm virus để đạt hiệu giá virus cao 
nhất khi thu hoạch. Môi trường duy trì khi gây nhiễm là môi trường nuôi tế bào có ít 
hoặc không có huyết thanh (FBS). Môi trường duy trì có tác dụng duy trì sự sinh 
trưởng ổn định của tế bào tạo điều kiên tối ưu cho quá trình xâm nhập và nhân lên 
của virus. Trong nuôi cấy ngoài ảnh hưởng yếu tố về các thành phần môi trường thì 
yếu tố ảnh hưởng quan trọng đến sự sinh trưởng của thảm tế bào gây nhiễm virus và 
 88 
sự phát triển virus là pH môi trường. Vì vậy nghiên cứu sự ảnh hưởng của hàm 
lượng huyết thanh (FBS) và pH môi trường đến hiệu giá virus được tiến hành. Thí 
nghiệm khảo sát hiệu giá virus thu được khi sử dụng môi trường duy trì MEM có 
hàm lượng FBS khác nhau và ở các độ pH khác nhau. Kết quả hiệu giá virus thu 
được khi sử dụng các loại môi trường duy trì được trình bày trong Bảng 3.24. 
Bảng 3.24. Hiệu giá virus đạt được khi sử dụng 
môi trường duy trì ở pH khác nhau 
 Độ pH 
Huyết thanh bào 
 thai bê (% FBS) 
6,8 7,0 7,2 7,4 
0 
Lần 1 3,1 5,3 6,0 5,8 
Lần 2 3,3 4,9 5,9 6,1 
Lần 3 3,1 4,8 6,1 5,9 
TB 3,12 ± 0,12 5,0 ± 0,27 6,0 ± 0,1 5,93 ± 0,15 
1 
Lần 1 3,3 5,5 6,5 6,4 
Lần 2 3,5 5,8 6,7 6,7 
Lần 3 3,6 5,7 6,7 6,5 
TB 3,47 ± 0,15 5,67 ± 0,15 6,63 ± 0,12 6,53 ± 0,15 
2 
Lần 1 3,5 5,8 6,5 6,3 
Lần 2 3,4 5,9 6,7 6,5 
Lần 3 3,5 6,1 6,5 6,7 
TB 3,47 ± 0,06 5,93 ± 0,15 6,57 ± 0,12 6,50 ± 0,20 
3 
Lần 1 3,6 5,9 6,6 6,7 
Lần 2 3,4 5,8 6,3 6,5 
Lần 3 3,4 5,8 6,5 6,5 
TB 3,47 ± 0,12 5,83 ± 0,06 6,47 ± 0,15 6,57 ± 0,12 
Ghi chú: TB là hiệu giá virus trung bình (10X TCID50) 
Số liệu nghiên cứu thu được ở Bảng 3.24 cho thấy: pH môi trường có ảnh 
hưởng rất lớn đến sự phát triển nhân lên của virus. Ở pH 6,8 virus phát triển rất 
kém, hiệu giá virus thu được chỉ dao động trong khoảng 103,1-103,6TCID50/ml. Virus 
tỏ ra thích ứng tốt ở pH 7,2-7,4, ở điều kiện pH này hiệu giá virus thu được trên 106 
TCID50/ml. 
Về hàm lượng huyết thanh (FBS) trong môi trường, cho thấy có sự khác biệt 
rõ rệt về hiệu giá virus khi dùng môi trường có huyết thanh và môi trường không có 
huyết thanh. Khi dùng môi trường không có huyết thanh, hiệu giá virus cao nhất thu 
được là 106,1TCID50/ml trong khi đó hiệu giá virus cao nhất thu được trong môi 
trường có huyết thanh là 106,7TCID50/ml. Tuy nhiên hiệu giá virus thu được khi 
dùng môi trường có 1%, 2%, 3% huyết thanh không có sự khác biệt rõ rệt. 
 89 
Từ kết quả thu được trong nghiên cứu về các loại môi trường cho nuôi cấy tế 
bào và gây nhiễm virus, môi trường thích hợp nhất được lựa chọn cho nuôi cấy tế 
bào là môi trường MEM có bổ sung thêm 0,03% Glutamine, 0,3% TPB, 5% FBS. 
Môi trường duy trì tế bào khi gây nhiễm là môi trường MEM như trên với pH 7,2-
7,4 và bổ sung 1% FBS. 
3.4.4.4. Liều gây nhiễm tăng sinh của giống gốc Hanvet1.vn nhược độc 
Để xác định liều gây nhiễm (MOI) thích hợp, chúng tôi tiến hành gây 
nhiễm virus giống gốc Hanvet1.vn trên các chai T75 cm2 chứa một lớp tế bào 
Marc 145. Các chai tế bào được loại bỏ môi trường nuôi cấy cũ, rửa 2 lần bằng 
PBS và nhiễm virus với các liều từ 0,001-1MOI, liều MOI được tính bằng số 
TCID50/tế bào (Ví dụ: liều gây nhiễm là 0.1MOI tức là nhiễm 1TCID50/10 tế 
bào). Virus gây nhiễm được ủ với tế bào trong thời gian 60 phút ở 37oC, 5% 
CO2. Tế bào sau nhiễm được nuôi trong môi trường MEM có 1% huyết thanh ở 
37oC, 5% CO2. Hàng ngày quan sát tế bào để đánh giá mức độ bệnh tích tế bào 
(CPE) ở các liều gây nhiễm khác nhau. Kết quả theo dõi mức độ thể hiện CPE 
của các liều gây nhiễm được thể hiện ở Bảng 3.25. 
Bảng 3.25. Mức độ thể hiện CPE của các liều gây nhiễm khác nhau 
Liều nhiễm 
(MOI) 
0,001 0,01 0,05 0.1 0.5 1 
Thời gian 
sau gây 
nhiễm 
24 h - - - - - - 
48 h - - + 2+ 2+ 2+ 
72 h - + 2+ 3+ 3+ 3+ 
96 h + 2+ 3+ 4+ 4+ 4+ 
Chú thích: Mức độ biểu hiện CPE được đánh giá và cho điểm như sau: 
- Mức “4+” đạt được khi quan sát một vi trường bất kỳ trong chai tế bào gây nhiễm thấy có nhiều cụm CPE và 
tế bào bong đáy > 80%. 
- Mức “3+” đạt được khi quan sát một vi trường bất kỳ trong chai tế bào gây nhiễm thấy có nhiều cụm CPE và 
tế bào bong đáy khoảng 50%. 
- Mức “2+” đạt được khi quan sát một vi trường bất kỳ trong chai tế bào gây nhiễm thấy có nhiều cụm CPE và 
tế bào bong đáy khoảng 30%. 
- Mức “+” đạt được khi quan sát một vi trường bất kỳ trong chai tế bào gây nhiễm thấy có các cụm CPE và tế 
bào chưa bị bong đáy. 
- Mức “- “ đạt được khi quan sát một vi trường bất kỳ trong chai tế bào gây nhiễm thấy không có các cụm CPE. 
 90 
 CPE sau khi nhiễm virus 96h Đối chứng âm 
Hình 3.14. Bệnh tích tế bào