Luận án Nghiên cứu tạo gelatinase tái tổ hợp và ứng dụng trong thủy phân gelatin da cá tra

ợc vào chủng E. coli DH5α. Nuôi và kiểm tra các thể biến 
nạp. Tách plasmid từ các vi khuẩn có mang gen, xử lý bằng enzym giới hạn 
để kiểm tra kích thước của đoạn gen được chèn trong vector biểu hiện pET-
22(b+). Vector biểu hiện pET-22b-gelE sau khi đã kiểm tra được biến nạp vào 
chủng E. coli BL21(DE3). Tách plasmid từ chủng tái tổ hợp E. coli 
BL21(DE3) mang vector pET-22b-gelE để kiểm tra tính chính xác của vector 
đã được biến nạp. Chủng E. coli BL21(DE3) mang vector pET-22b-gelE được 
sử dụng để biểu hiện enzym Gelatin tái tổ hợp. 
2.4.2.6. Phương pháp kiểm tra protein tái tổ hợp 
*Điện di protein trên gel polyacryalmide SDS – PAGE ( Laemmli, 1970). 
Điện di protein được thực hiện trên gel polyacrylamide 12% theo 
phương pháp Laemmli (1970). Trộn 20 µl mẫu với 5 µl đệm mẫu (loading 
dye blue 2X gồm 0,1 M Tris HCl pH 6,8; 0,2 M DTT, 4% SDS, 20% 
glycerol; 0,2% bromophenol blue mecraptoethanol 0,25 ml) đun sôi trong 10 
phút. Sau đó 25 µl mẫu được đưa vào các giếng với các thang chuẩn protein 
(Fermentas), tiến hành điện di với cường độ dòng điện 14 mA/2 giờ. Gel sau 
khi điện di được nhuộm qua đêm bằng dung dịch coomassie brilliant blue, tẩy 
màu (giải nhuộm) trong dung dịch ethanol: axít acetic: nước (4:1:5). Sau khi 
giải nhuộm xong, protein được phát hiện nhờ các vạch màu xanh lam trên nền 
gel trong suốt. 
*Định lượng protein (Bradford, 1976) 
Lượng protein có trong mẫu cũng được định lượng theo phương pháp 
Bradford . Nguyên lý của phương pháp này dựa vào phản ứng giữa các phân 
tử protein có trong mẫu với brilliant blue G trong dung dịch Bradford tạo 
thành phức chất có khả năng hấp thụ tốt nhất trong khoảng bước sóng 465 ÷ 
595 nm. Dựa vào độ hấp thụ đo được trong khoảng bước sóng trên và trên cơ 
sở đường chuẩn xây dựng từ protein chuẩn, nồng độ protein có trong mẫu 
được định lượng. 
 61 
Hình 2.1 Đồ thị đường chuẩn xác định nồng độ protein 
Protein trong mẫu thử được xác định như sau: 
Protein (mg/ml enzym) = 1,261 * (ΔA595 nm(TN) – ΔA595 nm (KC)) – 
0,168 
Trong đó : 
+ ΔA595 nm(TN): Độ tăng mật độ quang ở bước sóng 595 nm của mẫu thí 
nghiệm. 
+ ΔA595 nm(KC): Mật độ quang ở bước sóng 595 nm của mẫu kiểm chứng. 
2.4.3. Phương pháp nghiên cứu điều kiện biểu hiện rGEL 
2.4.3.1. Nuôi cấy E. coli tái tổ hợp 
Tế bào E. coli BL21(DE3)-[pET-22b-gelE] được nuôi lắc (200 
vòng/phút) qua đêm trên môi trường LB lỏng có bổ sung ampicillin đến nồng 
độ cuối là 100 µg/ml, ở nhiệt độ thích hợp. Quá trình biểu hiện enzym tái tổ 
hợp GEL được cảm ứng bằng IPTG ở các nồng độ khác nhau, khi mật độ 
quang (OD) ở bước sóng 600 nm đạt 0,8 ÷ 1. Thu tế bào theo thời gian cảm 
ứng bằng ly tâm ở 8000 vòng/phút trong 15 phút. 
2.4.3.2. Thu nhận GEL từ E. coli tái tổ hợp 
Tế bào E. coli BL21(DE3) [pET -22b -gelE] thu được sau quá trình biểu 
hiện được ly tâm ở 8000 vòng/phút trong 15 phút ở 4°C, hòa sinh khối trong 
đệm phosphate pH 8,0; 50 mM và siêu âm phá vỡ tế bào. Tiếp đó, ly tâm ở 
12000 vòng/phút trong 15 phút để thu dịch protein hòa tan và thu protein 
không hòa tan. Phần xác tế bào sau đó được hòa lại trong 500µl dung dịch 
 62 
PBS. Protein pha tan và xác tế bào còn lại được biến tính và kiểm tra bằng 
điện di protein trên gel polyacrylamide 12%. 
2.4.3.3. Ảnh hưởng của các điều kiện biểu hiện 
* Ảnh hưởng của pH đến biểu hiện rGEL 
 Chủng vi khuẩn tái tổ hợp E. coli BL21(DE3) [pET 22b -gelE] được 
nuôi cấy trong môi trường LB, nhiệt độ 37oC với các pH từ 5; 6; 7; và 8. Quá 
trình biểu hiện enzym tái tổ hợp GEL được cảm ứng bằng IPTG 0,1 mM khi 
mật độ quang (OD) ở bước sóng 600 nm đạt 0,8 ÷ 1. Thu tế bào theo thời gian 
cảm ứng bằng ly tâm ở 8000 vòng/phút trong 15 phút và thu GEL theo 
phương pháp trình bày trong mục 2.4.3.2. Dịch protein thô được điện di kiểm 
tra hoạt tính gelatinase và điện di kiểm tra trên SDS – PAGE theo phương 
pháp trình bày trong mục 2.4.2.6. 
* Ảnh hưởng của nhiệt độ đến biểu hiện rGEL 
Chủng vi khuẩn tái tổ hợp E. coli BL21(DE3) [pET22b - gelE] được 
nuôi cấy trong môi trường LB, bổ sung ampicillin 100 g/ml; pH=7. Khi mật 
độ quang (OD) ở bước sóng 600 nm đạt 0,8 ÷ 1, cảm ứng bằng IPTG nồng độ 
0,1 mM và điều chỉnh nhiệt độ lên men ở các mức 25, 28, 34 và 37°C. Thu tế 
bào theo thời gian cảm ứng bằng ly tâm ở 8000 vòng/phút trong 15 phút và 
thu GEL theo phương pháp trình bày trong mục 2.4.3.2. Dịch protein thô 
được điện di kiểm tra hoạt tính gelatinase và điện di kiểm tra trên SDS – 
PAGE theo phương pháp trình bày trong mục 2.4.2.6. 
*Ảnh hưởng của nồng độ IPTG đến biểu hiện rGEL 
Chủng vi khuẩn tái tổ hợp E. coli BL21(DE3) [pET 22b - gelE]được 
nuôi cấy trong môi trường LB, bổ sung ampicillin 100 g/ml; pH=7. Khi mật 
độ quang (OD) ở bước sóng 600 nm đạt 0,8 ÷ 1, cảm ứng bằng IPTG thay 
đổi từ 0,01; 0,02; 0,05; 0,1; 0,2; 0,3; 0,4 và 0,5 mM và hạ nhiệt độ xuống 
34°C. Mẫu được đánh giá bằng kiểm tra hoạt tính và protein tái tổ hợp trên 
gel polyacrylamide sau 8 giờ cảm ứng. 
 63 
* Xác định thời gian thu hồi rGEL 
Chủng vi khuẩn tái tổ hợp E. coli BL21(DE3) [pET 22b - gelE]được 
nuôi cấy trong môi trường LB, bổ sung ampicillin 100 g/ml; pH=7. Khi mật 
độ quang (OD) ở bước sóng 600 nm đạt 0,8 ÷ 1, cảm ứng bằng 0,05 mM và 
hạ nhiệt độ xuống 34°C. Cách 1 giờ lấy mẫu kiểm tra hoạt tính gelatinase và 
đo giá trị OD600nm. 
2.4.4. Phương pháp thu hồi, tinh sạch và đặc tính của rGEL 
2.4.4.1. Thu hồi và tinh sạch rGEL 
rGEL được thu hồi theo phương pháp trình bày trong mục 2.4.3.2. 
Protein tái tổ hợp được tinh sạch sử dụng kit tinh sạch bằng cột 
Probond™(Invitrogen). Cột tinh sạch 10ml theo kit được cho 2 ml resin vào, 
resin lắng xuống nhờ trọng lượng và hút nhẹ dịch nổi ra. Cột Ni2+ được rửa 2x 
bằng nước khử ion và đệm gắn cột (250 mM NaH2PO4, 2,5M NaCl và 10 mM 
imidazol, pH 8). Sau đó 8ml dịch protein (dịch nổi) cần tinh sạch được đưa 
lên cột, đặt lên một máy lắc nhẹ để các hạt resin luôn giữ ở trạng thái lơ lửng 
trong dịch protein trong 30÷60 phút để gelatinase gắn vào hạt resin. Tiếp 
theo, các hạt resin được để lắng và loại bỏ dịch trong cột. Cột được rửa 3 lần 
với đệm rửa (250 mM NaH2PO4, 2,5 M NaCl và 20 mM imidazol, pH 8). 
Protein gắn cột được thôi ra bằng dung dịch thôi (250 mM NaH2PO4, 2,5M 
NaCl và 250 mM imidazol, pH 8) với 11 phân đoạn, mỗi phân đoạn 1 ml. 
Hàm lượng protein được xác định trong mỗi phân đoạn. Sản phẩm tinh sạch 
được kiểm tra bằng phương pháp điện di trên gel polyacrylamide như trình 
bày trong mục 2.4.2.6. 
2.4.4.2. Ảnh hưởng của nhiệt độ và độ bền nhiệt của rGEL 
Gelatinase tái tổ hợp sau tinh sạch được sử dụng để xử lý gelatin ở các 
nhiệt độ 20, 30, 37, 40, 45, 50°C trong 30 phút. Ảnh hưởng của nhiệt độ 
được xác định bằng hoạt độ tương đối tính bằng cách so sánh hoạt tính của 
mẫu thí nghiệm với hoạt tính tại nhiệt độ tối ưu. Độ bền nhiệt của gelatinase 
 64 
được theo dõi trong 6 giờ ở điều kiện xử lý nhiệt là 37oC; 40°C và 45oC cứ 
mỗi 30 phút, hoạt tính enzym được đánh giá một lần. 
2.4.4.3. Ảnh hưởng của pH và độ bền pH của rGEL 
Ảnh hưởng của pH và độ bền pH đến hoạt tính của gelatinase: 
Gelatinase sau tinh sạch được sử dụng để xử lý gelatin ở pH thay đổi từ 5÷12. 
Ảnh hưởng của pH được xác định bằng hoạt độ tương đối tính bằng cách so 
sánh hoạt tính của pH thí nghiệm và tại pH tối ưu. rGEL được giữ trong đệm 
pH 5; pH7; pH7,5 và pH8,5 trong thời gian 0,5÷ 6 (bước nhảy 0,5 giờ) và thử 
hoạt tính. Độ bền pH được xác định bằng hoạt độ còn lại của enzym so với 
thời điểm ban đầu trong thời gian 6 giờ. 
2.4.4.4. Ảnh hưởng của ion kim loại 
rGEL sau tinh sạch được sử dụng để xử lý gelatin ở 50°C trong dung 
dịch các ion Co2+, Ca2+, Mg2+, Mn2+, Fe2+, Cu2+, ethylenediamine tetraacetid 
axít (EDTA) và β-mercaptoetanol ở nồng độ 5 mM. Ảnh hưởng của các ion 
kim loại và chất tẩy rửa được xác định bằng hoạt độ tương đối tính bằng cách 
so sánh tỷ lệ hoạt độ của mẫu thí nghiệm và mẫu đối chứng âm không bổ 
sung các ion. 
2.4.4.5. Ảnh hưởng của chất tẩy rửa 
rGEL sau tinh sạch được sử dụng để xử lý gelatin ở 50°C trong dung 
dịch có chứa các chất tẩy như Tween 20, Triton X-100, SDS ở các nồng độ 
0,3; 0,5; 1%. Ảnh hưởng của các hóa chất tẩy rửa được xác định bằng hoạt độ 
tương đối tính bằng cách so sánh hoạt tính của mẫu thí nghiệm và mẫu đối 
chứng âm không bổ sung các ion. 
2.4.4.6. Động học của rGEL với cơ chất gelatin 
 Động học của phản ứng enzym rGEL được xác định qua hằng số 
Michaelis- Menten: Km và vận tốc phản ứng tối đa Vmax. Km lớn, ái lực giữa 
enzym và cơ chất thấp và ngược lại, ở những điều kiện hoàn toàn xác định về 
nhiệt độ, pH, Km của một enzym đối với một cơ chất là hằng số. Nếu enzym 
 65 
có thể xúc tác với các cơ chất khác nhau thì Km có thể khác nhau tùy thuộc 
vào loại cơ chất. 
Xác định Km dựa vào phương trình Lineawever – Burk: 
) 
Trong đó: V0: vận tốc ban đầu; Vmax: vận tốc cực đại; Km: hằng số Michaelis. 
2.4.5. Ứng dụng rGEL thủy phân gelatin da các tra 
2.4.5.1. Phương pháp nghiên cứu thủy phân gelatin da cá Tra bằng rGEL 
*Phương pháp xử lý mẫu da cá Tra 
Nhằm tránh gây biến đổi những tính chất của da cá, ngay sau khi chế 
biến phi lê, da cá thu được cần cắt nhỏ đến 0,2 ÷ 0,5cm/mẫu, tiếp theo da cá 
sẽ được đem đi làm đông và trữ đông ở nhiệt độ -20 ± 2oC. Chính vì vậy, 
trong quá trình nghiên cứu, việc đầu tiên phải làm đối với nguyên liệu là da cá 
tra đó là công đoạn “rã đông, rửa sạch”. Để tăng hiệu quả của quá trình, da cá 
sau khi được chuyển từ nhà máy chế biến về phòng thí nghiệm dưới dạng 
đông lạnh sẽ được đem đi tan giá, kết hợp với rửa sạch bằng nước ấm ở nhiệt 
độ 50ºC ÷ 60ºC, sau đó được để cho khô ráo trước khi tiến hành xử lý ở bước 
tiếp theo. 
*Phương pháp trích ly gelatin 
 Sau khi xử lý da sạch (30 g) trong 60 phút với NaOH 0,1M, chúng 
được ráo nước và rửa 3 lần bằng nước máy. Sau đó, các mẫu được xử lý trong 
60 phút với axit lactic 25mM. Các mẫu được xả và xả 3 lần bằng nước máy. 
Quá trình chuẩn bị ở trên được thực hiện tại 4°C. Cuối cùng, các mẫu được 
trộn với nước cất (tỷ lệ da / nước: 1/8 w/v) và gelatin được chiết ở nhiệt độ 
45oC trong 10 giờ (Jongjareonrak và cộng sự, 2010; Nguyễn Đỗ Quỳnh và 
cộng sự, 2015). Sau khi trích ly thu đươc một dung dịch sệt, tiến hành lọc 
bằng vải có 4 lớp để loại bỏ lớp màng da. Đem dung dịch đó lọc qua máy lọc 
chân không với chất trợ lọc celite để loại bỏ bớt tạp chất và mỡ. Cô đặc dung 
dịch ở nhiệt độ tương ứng trong thời gian 5 – 6 giờ để bay bớt hơi nước tạo 
 66 
điều kiện thuận lợi cho công đoạn sấy. Dịch lọc được đổ ra khay sấy ở nhiệt 
độ 60 ÷ 700C, sản phẩm được sấy và nghiền mịn, sau đó được sử dụng cho 
nghiên cứu tiếp theo. 
*Phương pháp khảo sát điều kiện thủy phân gelatin da cá Tra bằng rGEL 
Khảo sát tỷ lệ nước 
Trong các nghiên cứu trước đã xác định được điều kiện thích hợp cho 
hoạt tính của gelatinase tái tổ hợp là: nhiệt độ 50oC, pH =7,0; 100 g cơ chất 
được thủy phân với nồng độ enzym 75U trong 24 giờ, với các tỷ lệ nước khảo 
sát như sau: 0%, 30%; 50%, 70%, 100%. Sản phẩm sau thủy phân sẽ được 
tiến hành đo các chỉ số đạm để tính hiệu suất thủy phân và hiệu suất thu 
nhận đạm hòa tan. 
Khảo sát ảnh hưởng của nhiệt độ 
Với tỷ lệ nước tối ưu đã xác định và điều kiện thủy phân như trên. Các 
nhiệt độ được khảo sát bao gồm: 40; 45; 50; 55 và 60oC. Sản phẩm sau thủy 
phân sẽ được tiến hành đo các chỉ số đạm để tính hiệu suất thủy phân và 
hiệu suất thu nhận đạm hòa tan. 
Khảo sát với các nồng độ enzym 
Với các điều kiện tỷ lệ nước và nồng độ muối đã xác định và điều kiện 
thủy phân như trên, tiến hành thay đổi nồng độ enzym với các hoạt độ 
khảo sát như sau: không có enzyme; 25 U; 50 U; 75 U; 100 U và 125 U. 
Sản phẩm sau thuỷ phân sẽ được tiến hành đo các chỉ số đạm để tính 
hiệu suất thủy phân và hiệu suất thu nhận đạm hòa tan. Từ đó, chọn ra hoạt 
độ enzym tối ưu để tiến hành các khảo sát tiếp theo. 
Khảo sát ảnh hưởng của thời gian 
Với các điều kiện đã xác định ở các thí nghiệm trên, tiến hành khảo sát 
thời gian thủy phân 2; 6; 8; 12 và 24 giờ. Dịch sau thủy phân sẽ được tiến 
hành đo các chỉ tiêu đạm để tính hiệu suất thủy phân. 
* Phương pháp xác định mức độ thủy phân 
 Hiệu suất thủy phân (DH- Degree of hydrolysis) được xác định theo 
phương pháp của Hoyle and Merritt (1994). 20 ml protein thủy phân được bổ 
 67 
sung 20ml trichloroacetic axít (TCA) để tạo dung dịch đạm chứa 10% TCA. 
Giữ hỗn hợp trong 30 phút cho quá trình kết tủa rồi ly tâm ở tốc độ 8000 
vòng/phút trong 15 phút. Dịch nổi được phân tích theo phương pháp Kjeldahl 
(AOAC, 2000). Mức độ thủy phân được tính theo công thức: 
* Phương pháp định lượng axit amin trong sản phẩm thủy phân 
Phương pháp định lượng axít amin bằng ninhydrin 0,1 ml dịch lọc được 
cho vào ống nghiệm, bổ sung 1 ml pyridine 20% và 1 ml ninhydrin 2%, ủ 
mẫu tại nhiệt độ 70 ÷ 75oC trong 7-10 phút, sau đó lấy ra để nguội ở nhiệt độ 
phòng. Sau 30 phút, xác định độ hấp thụ của mẫu bằng đo quang phổ ở bước 
sóng A570 nm và dựa vào đường chuẩn glutamic để xác định hàm lượng axít 
amin có trong mẫu thử. 
2.4.5.2. Đánh giá hiệu quả bổ sung chế phẩm axit amin vào thức ăn ương cá 
Mú chấm đen 
*Bố trí thí nghiệm 
Thí nghiệm được bố trí theo kiểu một nhân tố ngẫu nhiên hoàn toàn. 
Trong đó, sử dụng 21 giai lưới để thí nghiệm, mỗi giai có diện tích 1m2, các 
giai được đặt trong cùng một ao nước lợ có diện tích 2000m2, độ sâu mực 
nước 1 ± 1,2m (Hình 2.2b). Cá có kích thước 7 cm được ương nuôi trong 35 
ngày. Mật độ 40 con/m2. 
Hình 2.2a. Cá Mú chấm đen 
(Epinephelus malabaricus) 
Hình 2.2b. Hệ thống giai ương thí 
nghiệm 
 68 
Hình 2.3. Thức ăn 
công nghiệp dùng 
cho cá Mú chấm đen 
Bảng 2.1. Thành phần dinh dưỡng thức ăn 
Thành phần dinh dưỡng thức ăn Hàm lượng 
Độ ẩm 11% 
Protein thô tối thiểu 46% 
Protein tiêu hóa tối thiểu 36% 
Béo thô tối thiểu 10% 
Tro tối đa 15% 
Xơ thô tối đa 1% 
Canxi tối đa 2,5% 
Photpho tổng số tối đa 1,5% 
Lysine tổng số tối thiểu 1,7% 
Methyonine + Cystine tổng số tối 
thiểu 
0,83% 
Thí nghiệm được tiến hành với 7 công thức thức ăn và 3 lần lặp. ở các 
công thức thí nghiệm cụ thể như sau: 
+ CT1: Thức ăn công nghiệp + 0% chế phẩm axit amin (Đối chứng) 
+ CT2: Thức ăn công nghiệp + 0,2% chế phẩm axit amin 
+ CT3: Thức ăn công nghiệp + 0,4% chế phẩm axit amin. 
+ CT4: Thức ăn công nghiệp + 0,6% chế phẩm axit amin. 
+ CT5: Thức ăn công nghiệp + 0,8% chế phẩm axit amin. 
+ CT6: Thức ăn công nghiệp + 1,0% chế phẩm axit amin 
+ CT7: Thức ăn công nghiệp + 1,2% chế phẩm axit amin 
Điều kiện phi thí nghiệm: nhiệt độ nước: 25÷30oC; pH: 7,5÷8,3; độ mặn: 
20÷32 ppt; DO: 4÷8 mg/l. 
* Phương pháp bổ sung chế phẩm vào thức ăn công nghiệp: thức ăn dạng viên 
khô, chế phẩm dạng ướt nên được phun trộn đều vào lượng thức ăn cho cá theo 
từng lần cho ăn. Chế độ cho ăn: vào lúc 6 và 16 giờ. Khẩu phần cho cá ăn: 5% 
khối lượng thân cá. 
 69 
* Phương pháp phân tích thành phần dinh dưỡng của thức ăn thí nghiệm sau 
khi bổ sung chế phẩm axit amin. 
- Vật chất khô: Xác định theo phương pháp TCVN 4326 - 2001. 
- Protein thô: Xác định theo phương pháp TCVN 4328 - 2007. 
 - Lipid thô: Xác định theo phương pháp TCVN 4331 - 2007. 
 - Khoáng tổng số: Xác định theo phương pháp TCVN 4327-2007 
 - Acid amin: Xác định theo phương pháp AOAC 2007 (994.12). 
Các mẫu thức ăn được phân tích thành phần dinh dưỡng và thành phần axit 
amin, các chỉ số được thể hiện ở bảng 2.2, bảng 2.3. 
Bảng 2.2. Thành phần dinh dưỡng các công thức thức ăn thí nghiệm 
Côn
g 
thức 
Mức bổ 
sung bột 
axit 
amin 
(%) 
Protein 
thô (%, 
DM) 
Lipit 
thô 
(%, 
DM) 
Xơ 
thô 
tối 
đa 
(%) 
Can 
xi 
tối 
đa 
(%) 
Tro 
tối 
đa 
(%) 
Lysine 
tổng số 
tối 
thiểu 
(%) 
Methyo
nine + 
Cystine 
tổng số 
tối thiểu 
(%) 
1 0 46 10 1 2,5 15 1,6 0,83 
2 0,2 46,2 10 1 2,5 15 1,64 0,84 
3 0,4 46,4 10 1 2,5 15 1,68 0,84 
4 0,6 46,5 10 1 2,5 15 1,72 0,85 
5 0,8 46,6 10 1 2,5 15 1,76 0,86 
6 1,0 46,8 10 1 2,5 15 1,8 0,86 
7 1,2 47,0 10 1 2,5 15 1,84 0,87 
Bảng 2.3. Thành phần axit amin trong các loại thức ăn thí nghiệm 
Axit amin (% ) 
Thức ăn thí nghiệm + bổ sung axit amin (%) 
0 0,2 0,4 0,6 0,8 1,0 1,2 
Aspartic 4,05 4,15 3,91 4,02 3,95 4,13 4,13 
Glutamic 8,13 8,41 8,01 7,81 8,09 8.38 8,38 
Serine 1,96 1,99 1,9 2,0 1.89 2.1 2,07 
 70 
Histidine 1,32 1,28 1,21 0,96 1,05 1,14 1,08 
Glycine 2,81 2,77 2,55 2,52 2,19 2,22 2,22 
Threonine 1,50 1,41 1,30 1,36 1,27 1,36 1,36 
Alanine 2,42 2,40 2,18 2,17 1,87 1,94 1,94 
Arginine 2,59 2,62 2,45 2.53 2,25 2,46 2,46 
Tyrosine 1,45 1,40 1,61 1.64 1,38 1,35 1,35 
Valine 1,60 1,65 1,54 1,53 1,42 1,52 1,52 
Methionine 0,83 0,84 0,84 0,85 0,86 0,86 0,87 
Lysine 1,6 1,64 1,68 1,72 1,76 1,8 1,84 
Phenylalanine 1,49 1,55 1,49 1,60 1,40 1,62 1,62 
Isoleucine 1,17 1,18 1,18 1,19 1,03 1,14 1,14 
Leucine 2,66 2,49 2,39 2,46 2,24 2,43 2,43 
Proline 1,01 1,07 0,94 0,94 0,98 1,11 1,11 
Phương pháp xác định tăng trưởng của cá Mú thí nghiệm: định kỳ 7 ngày 
kiểm tra một lần về khối lượng, chiều dài thân cá, từ đó xác định: 
-Tốc độ tăng trưởng trung bình ngày (ADG) : 
Wt– W0 
 ADG = (g/ngày) 
 t 
Trong đó: - W0: khối lượng ban đầu 
 - Wt: khối lượng tại thời điểm t thí nghiệm 
 - t: ngày thí nghiệm 
-Tốc độ tăng trưởng đặc trưng (SGR) 
 LnWt – LnW0 
SGR = x 100 (%/ngày) 
 t 
Trong đó: - W0: khối lượng cá ban đầu 
 - Wt: khối lượng cá tại thời điểm kết thúc thí nghiệm 
 - t: ngày thí nghiệm 
Cuối đợt thí nghiệm đánh giá hệ số sử dụng thức ăn (FCR): 
FCR= Tổng lượng thức ăn đã sử dụng/ Khối lượng tăng trưởng của cá nuôi 
 71 
Xác định hệ số phân đàn (CV): Đánh giá tại thời điểm thả cá và thời điểm kết 
thúc thí nghiệm. CV (%) = Độ lệch chuẩn/ giá trị trung bình x 100 
-Xác định tỷ lệ sống của cá Mú ương: số cá thả ở các giai ương ban đầu đều 
bằng nhau, sau khi kết thúc thí nghiệm thu đếm số cá còn lại ở mỗi giai để 
biết được hiệu quả ương nuôi. 
2.4.6. Phương pháp thu thập và xử lý số liệu 
Toàn bộ số liệu được thu thập trong quá trình thí nghiệm và được xử lý 
bằng phương pháp thống kê sinh học trên phần mềm Excell 2007, SPSS 16.0. 
Dùng phép kiểm định Duncan, LSD0,05. 
 72 
CHƯƠNG 3. KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN 
3.1. SÀNG LỌC NGUỒN GEN MÃ HÓA GELATINASE 
3.1.1. Tuyển chọn các chủng vi khuẩn sinh tổng hợp gelatinase cao 
Trong những năm gần đây, nhiều nghiên cứu công bố về phân lập và tách 
dòng gen gelE mã hóa gelatinase từ các chủng VSV trong tự nhiên, đặc biệt là từ 
các chủng vi khuẩn gây bệnh trên người, côn trùng và động vật như 
Enterococcus faecalis, Pseudomonas aeruginosa, Staphylococcus aureus, 
Clostridium perfringens và Serratia marcescens. (Shanmugasundaram và 
cộng sự, 2012). Tổng hợp các kết quả cho thấy vi khuẩn có nguồn gốc từ cá bị 
bệnh hoặc từ nguồn gelatin đang bị phân hủy thường thể hiện hoạt tính 
gelatinase (GEL) cao và ái lực mạnh đối với cơ chất gelatin từ da cá. Vì vậy, 
từ Bộ sưu tập giống gồm 216 chủng vi sinh vật sinh enzym thủy phân gelatin 
phân lập từ các mẫu mẫu cá nước ngọt bị bệnh lở loét, xuất huyết, đốm đỏ, 
tuột nhớt, tuột vẩy tại các hồ nuôi cá ở Hà Nội tại phòng thí nghiệm công 
nghệ sinh học – Viện Đại học Mở Hà Nội, đã sàng lọc được 11 chủng sinh 
gelatinase cao để tìm nguồn gen mã hóa gelatinase. 
Bảng 3.1. Hoạt tính phân giải gelatin của dịch lên men 11 chủng vi khuẩn 
phân lập phân lập từ các mẫu cá nước ngọt bị bệnh sau 48 giờ nuôi cấy. 
STT Ký hiệu chủng 
Đường kính vòng 
phân giải gelatin (D-d, 
mm) 
Hoạt tính gelatinase 
(U/ml) 
1 MD1 20,50 ± 0,01 0,34±0,12 
2 MD2 26,51 ± 0,03 0,40±0,10 
3 MD3 24,60 ±0,11 0,40±0,16 
4 MD4 28,21 ± 0,16 0,64±0,11 
5 MD5 23,02 ±0,13 0,43±0,15 
6 MD6 21,01 ±0,21 0,38±0,10 
 73 
7 MD7 25,00 ±0,12 0,41±0,16 
8 MD8 25,02 ±0,15 0,39±0,12 
9 MD9 22,02 ±0,05 0,30±0,12 
10 MD10 25,01 ±0,15 0,33±0,10 
11 MD11 23,00 ±0,02 0,31±0,18 
Ghi chú: D: Đường kính vòng phân giải (mm), d: Đường kính lỗ thạch (mm) 
Hình 3.1. Khả năng thủy phân gelatin (nồng độ 7,5 g/l) sang dạng lỏn