Luận án Nghiên cứu tạo giống gốc và thử nghiệm sản xuất Vacxin vô hoạt phòng hội chứng rối loạn sinh sản và hô hấp ở lợn từ chủng virus phân lập tại Việt Nam

rus và định lượng protein 
Các chủng virus được lựa chọn để làm nguyên liệu cho các bước nghiên 
cứu tiếp theo được chúng tôi nhân lên với số lượng lớn để tiến hành tinh chế 
kháng nguyên. Virus sau khi được gây nhiễm vào tế bào Marc 145, khi bệnh tích 
tế bào đạt yêu cầu thì tiến hành thu virus bảo quản trong điều kiện âm sâu và tiến 
hành đông tan tế bào 3 lần để thu được hàm lượng virus nhiều nhất. Huyễn dịch 
virus được ly tâm ở 3000 vòng/4oC/30 phút để loại bỏ cặn tế bào, thu lấy dịch 
trong phía trên, cho vào fancol. 
Siêu ly tâm dịch thu được ở trên: Trước khi tiến hành siêu ly tâm, phải 
khởi động máy siêu ly tâm trước khoảng 30 phút tạo môi trường ly tâm lạnh cho 
mẫu nghiên cứu, đồng thời cài đặt chế độ siêu ly tâm phù hợp. 
Hỗn hợp dịch kháng nguyên thu được để trong khay đá vảy để bảo 
quản chất lượng kháng nguyên, ly tâm ở tốc độ cao 35.000 vòng/4oC/2 giờ 
để thu cặn virus. 
Cặn thu được sẽ được hoà tan trong PBS 1X được hỗn dịch kháng nguyên. 
Hỗn dịch này sẽ được ly tâm tốc độ cao (35.000 vòng/4oC/2 giờ) qua gradient 
đường với các nồng độ khác nhau (10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%). Thu vạch 
band xuất hiện sau khi ly tâm, đây chính là kháng nguyên virus. Tiến hành định 
lượng protein kháng nguyên bằng máy quang phổ nhiệt khả kiến. 
3.5.10. Phương pháp gây tối miễn dịch trên chuột 
Kháng nguyên gây miễn dịch là protein kháng nguyên của virus PRRS đã 
được tinh chế và định lượng. Kháng nguyên gốc được pha loãng trong dung dịch 
PBS theo tỷ lệ thích hợp tùy vào hàm lượng protein kháng nguyên, thường tiến 
hành tiêm với liều lượng từ 20-100ng. 
 46 
+ Chuẩn bị dung dịch tiêm và tiến hành tiêm: 
Phối trộn kháng nguyên và nhũ dầu theo tỷ lệ nhất đinh: Hỗn hợp kháng 
nguyên/nhũ dầu với tỷ lệ 1/1,5. Kháng nguyên gốc được pha trong PBS 1x theo 
tỷ lệ tùy mẫu kháng nguyên. 
Nhũ dầu (Adjuvant) loại complete hoặc incomplete, loại complete dùng 
cho lần gây nhiễm virus đầu tiên với từng lô thí nghiệm, loại incomplete thì dùng 
cho những lần gây nhiễm tiếp theo (lần 2, lần 3). 
+ Xác định vị trí tiêm, đường tiêm: Tiêm dưới da vùng lưng, hông (đối với 
chuột lang) của từng chuột thí nghiệm, phân bố tiêm ở 2, 3 vị trí khác nhau với 
lượng kháng nguyên đã chuẩn bị. 
 Sau khi tiêm thì tiến hành đánh dấu và ghi chép lại để theo dõi. Hai tuần 
sau, gây nhiễm lần 2 để tăng cường đáp ứng miễn dịch trên chuột, hai tuần tiếp 
theo gây nhiễm lần 3. Cuối cùng sau 2 tuần tiếp thì tiến hành gây mê, lấy máu 
thu kháng thể và mổ khám chuột thí nghiệm. 
3.5.11. Phương pháp trung hòa virus (phương pháp virus cố định và huyết 
thanh pha loãng) 
Nguyên tắc cơ bản của phản ứng trung hòa là ở chỗ bệnh phẩm chứa virus 
trộn lẫn với huyết thanh miễn dịch và sau một thời gian nhất định giữ hỗn hợp 
trong tủ ấm thì virus bị trung hòa và không có khả năng gây bệnh tích cho tế bào. 
Để làm phản ứn trung hòa phải chế huyễn dịch tiêu chuẩn chứa virus, chất huyễn 
dịch này được đựng trong các ống vô trùng mỗi ống chứa 1 ml và được bảo quản 
ở -800C. Tùy theo yêu cầu sử dụng mà lấy các ống đó ra thực hiện phản ứng 
trung hòa. Huyết thanh miễn dịch dùng trong phản ứng trung hòa phải trong suốt 
được bảo quản tốt và có thể đông khô được. Việc chuẩn bị virus và huyết thanh 
cũng như pha loãng chúng phải thực hiện trong điều kiện vô trùng. 
Trong nghiên cứu này, chúng tôi tiến hành pha loãng huyết thanh theo cơ 
số 2 và sử dụng virus trung hòa ở nồng độ 100TCID50/mL. Huyết thanh đã pha 
loãng trộn với virus và giữ ở nhiệt độ phòng trong 30 phút, mỗi độ pha loãng gây 
nhiễm cho 5 giếng tế bào MARC-145. Đọc kết quả: hiện tượng trung hòa được 
xác định theo bệnh tích trên tế bào một lớp cảm thụ. Virus được trung hòa khi 
không có bệnh tích tế bào trên tế bào cảm thụ MARC-145. Virus không được 
trung hòa khi xuất hiện bệnh tích tế bào trên giếng tế bào MARC-145. 
 47 
3.5.12. Phương pháp IPMA 
Các bước tiến hành của phương pháp bao gồm: 
Bước 1: Chuẩn bị tế bào MARC-145 trên giếng 96 
- Chuẩn bị dung dịch tế bào MARC-145 (5x104 tế bào/ml, 10ml mỗi 
khay) trong DMEM 5% FCS. 
- Chia 100μl của dung dịch tế bào này vào các giếng. 
- Ủ ở 37oC trong 1-2 ngày cho đến khi các tế bào trở nên đơn lớp. 
Bước 2: Gây nhiễm tế bào với virus PRRS 
- Pha loãng virus để được 500 TCID50 /ml 
- Thêm 100μl virus đã pha loãng vào tất cả các giếng. 
- Ủ ở 37oC trong 2 ngày. 
Bước 3: Cố định các tế bào Marc 145 bị nhiễm virus 
- Loại bỏ môi trường nuôi cấy tế bào 
- Thêm 100µl PBS có 10% formalin và 1% NP40 
- Ủ ở 37oC trong 30 phút 
- Rửa khay 2 lần với đệm PBS có 0,5% Tween 80 
Bước 4: gắn kháng thể 1 
- Pha loãng huyết thanh theo tỉ lệ thích hợp 
* Đối với mục đích sàng lọc 1/160 
* Đối với kháng thể chuẩn độ pha loãng 4 lần (1/40, 1/160, 1/640, 1/2560) 
- Chuyển 50µl của huyết thanh pha loãng vào từng giếng của khay thí 
nghiệm. 
- Ủ ở 37oC cho 30 phút. 
- Rửa khay 3 lần với đệm PBS có 0,5% Tween 80 
Bước 5: gắn kháng thể thứ 2; Kháng thể kháng IgG của lợn được gắn 
peroxidase 
- Pha loãng kháng thể thứ 2 với tỉ lệ 1/600 với dung dịch đệm 
- Thêm 50µl kháng thể thứ 2 đã pha loãng vào từng giếng. 
- Ủ ở 370C trong 30 phút. 
 48 
- Rửa khay 3 lần với đệm PBS có 0,5% Tween 80 
Bước 6: Cho cơ chất 
- Thêm 50µl dung dịch AEC vào từng giếng. 
- Ủ ở nhiệt độ phòng trong 30 phút. 
- Quan sát kết quả với kính hiển vi soi ngược. 
- Giếng dương tính khi có phát màu của cơ chất 
- Giếng âm tính khi không quan sát được màu của cơ chất 
3.5.13. Phương pháp kiểm tra vô trùng của giống PRRS (master seed và 
working seed) 
3.5.13.1. Môi trường kiểm tra vi khuẩn hiếu khí 
Môi trường thạch thường gồm các thành phần sau: 
- Nước thịt pepton: 500ml 
- Thạch thường: 20 - 25g 
- Nước cất 2 lần vừa đủ 1000ml 
Môi trường nước thịt thường gồm các thành phần sau: 
- Cao thịt bò: 5g 
- Pepton bột: 10g 
- NaCl: 5g 
- Nước cất 2 lần vừa đủ 1000ml 
Các loại môi trường trên phải được hấp vô trùng trước khi sử dụng. 
3.5.13.2. Môi trường kiểm tra vi khuẩn yếm khí 
Môi trường nước thịt gan yếm khí: 
Gan lợn được bóc bỏ màng, cắt thành miếng vuông to, luộc chín ở 
1000C/30 phút, để nguội, cắt thành miếng vuông nhỏ hạt lựu, rửa sạch cho hết 
bột gan để môi trường không bị đục, tráng qua nước lọc rồi cho vào ống nghiệm, 
mỗi ống cho khoảng 3 - 4 miếng, sau đó đổ nước thịt pepton vào, nước thịt 
pepton này có độ pH = 7,8 - 8,2. Sau đó cho một lượng dầu paraffin lên trên môi 
trường. Hấp ướt 1210C trong vòng 30 phút. 
3.5.13.3. Môi trường kiểm tra nấm 
Môi trường thạch Sabouraud: 
 49 
- Casein pancreatic: 5g 
- Pepton: 5g 
- Glucose: 40g 
- Thạch: 18g 
- Nước cất: vừa đủ 1000ml 
- pH: 5,4 – 5,8 
Thêm 100mg Benzyl penicilin và 100mg tetracyclin vào 1000ml môi 
trường đã tiệt trùng hoặc 50 mg cloramphenicol/ 1000 ml trước khi tiệt trùng. 
3.5.13.4. Môi trường kiểm tra vi khuẩn dung huyết 
Môi trường thạch máu: 
- Thạch thường: 100ml 
- Máu cừu, thỏ (đã bỏ sợi huyết): 10ml 
Đun sôi cách thủy cho tan hết thạch, chuẩn bị hộp lồng đã vô trùng. Đợi 
thạch nguội xuống 600C thì dùng ống hút, hút máu cho vào thạch theo tỷ lệ trên 
và lắc đều sau đó đổ ra hộp lồng. Để yên trong 15 phút cho đông đặc rồi gói lại, 
để vào tủ ấm 370C để kiểm tra xem có vô trùng không, sau đó cất trong tủ lạnh. 
3.5.13.5. Phương pháp kiểm tra 
Mỗi mẫu giống gốc hoặc virus được cấy vào các loại môi trường thạch 
thường, nước thịt, thạch máu, nước thịt gan yếm khí và thạch nấm. Mỗi loại môi 
trường cấy 4 ống/mẫu. Đến cuối quá trình theo dõi mà tất cả các ống thử đều 
trong suốt, mầu sắc môi trường không đổi, kết quả là âm tính. 
Nếu có một trong các ống thử có biểu hiện nhiễm trùng thì phải tiến hành 
nhuộm và soi kính để xác định loại vi khuẩn, đồng thời kiểm tra lại lần 2 với số 
mẫu như trên. Nếu lần 2 âm tính thì mẫu được coi là âm tính. Nếu lần 2 cũng 
dương tính và cùng loại tạp khuẩn như lần 1 thì mẫu đó được coi là dương tính. 
Loạt vacxin hay lô có mẫu kiểm tra phải loại bỏ. 
Nếu lần 2 dương tính nhưng với loại tạp khuẩn khác thì phải tiến hành 
thêm lần 3 với cách thức như trên. 
 50 
3.5.14. Phương pháp kiểm tra thuần khiết của giống (master seed và 
workingseed) bằng kỹ thuật PCR/RT-PCR 
Sử dụng kỹ thuật sinh học phân tử phát hiện các loại virus Lở mồm long 
móng, PCV2, dịch tả lợn, PED, TGE. 
3.5.15. Phương pháp nuôi cấy tế bào MARC-145 trên hệ thống Bioreactor 
Các bước tiến hành: 
Bước 1: Chuẩn bị tế bào cho vào túi nuôi cấy: Đếm tế bào với nồng độ 
0,3x106 tế bào/ml môi trường. Kiểm tra pH môi trường trong túi nuôi cấy trước 
khi cho tế bào vào túi. Hút môi trường trong túi ra đo pH=7,4. 
- Bước 2: Cho tế bào vào túi. Lắp kín đầu ống dẫn và bịt lại bằng parain 
xịt cồn 700. 
- Bước 3: Sau khi cho tế bào vào túi nuôi cấy bật máy để máy ở chế độ lắc 
làm liên tục như vậy trong 6h. Sau đó thay đổi chế độ lắc cho phù hợp. 
- Bước 4: Trong quá trình nuôi cấy thường xuyên kiểm tra sự bám của tế 
bào lên hạt cytodex. Kiểm tra pH và thay môi trường cho tế bào. 
- Bước 5: Nhiễm virus sau 2-3 ngày nuôi cấy. Kiểm tra mật độ tế bào 
trước khi gây nhiễm. Sau đó hút hỗn hợp môi trường tế bào cho vào buồng đếm 
để đếm tế bào. Sau khi đếm được tế bào, tiến hành cho virus cần gây nhiễm với 
lượng 1,4 × 106 virus/ml. 
- Bước 6: Sau khi cho virus vào để máy lắc liên tục 14 rpm/5°, hàng ngày 
kiểm tra bệnh tích tế bào và sau 72h thì tiến hành thu virus. 
3.5.16. Phương pháp cô đặc virus PRRS bằng lọc tiếp tuyến 
Virus PRRS được nuôi cấy trên môi trường tế bào MARC-145 bằng máy 
Wave Bioreactor. Virus sau khi được nhân lên với số lượng lớn được cô đặc bằng 
máy lọc tiếp tuyến. Sau cô đặc tiến hành hiệu giá lại virus sau cô đặc. Mỗi một 
lần cô đặc có thể lọc tiếp tuyến tối đa một lít virus, sau khi lọc thu được 500µl 
virus đã cô đặc và hiệu giá virus thường tăng 101 so với trước lọc. 
Phương pháp vận hành máy lọc tiếp tuyến MINIPORE 
Loc̣ virus: 
1. Nối ống Sta-puer trắng: môṭ đầu vào đầu RET, môṭ đầu vào đầu FEED 
2. Tháo đầu silicone retentate từ đầu RETIN cho vào bocan 
 51 
3. Mở van retentate bằng cách văṇ ngươc̣ chiều kim đồng hồ. 
4. Cho NaOH 0,1N đa ̃chuẩn bi ̣ vào bình chứa. 
5. Mở van tank (Cho doc̣ theo đường ống). 
6. Bâṭ pumpspeed ở tốc đô ̣2 cho chảy đến 250ml thì dừng. 
7. Kết nối laị ống retentate vào đầu RETIN. Bâṭ bản tốc đô ̣2 và cho chaỵ 
15 – 30 phút sau đó tắt hẳn. 
8. Tháo ống Sta-pure từ đầu ra của bản (đầu PEEDIN) và đăṭ vào bình 
chứa. Bâṭ bản cho chảy hết. 
Loc̣: 
1. Tháo Sta-pure ra và lắp màng loc̣ vào. 
2. Tháo retentate tubing từ đầu RETIN cho vào bocan. 
Điều chỉnh van retentate theo chiều ngươc̣ kim đồng hồ. 
Cho 500ml môi trường vào bình. 
Mở van tank và điều chỉnh van Retentate cho đến 20 psi. 
Bâṭ pump chảy đến 350 thì dừng laị. Kết nối dây retentate tubing vào đầu 
Ret In. bâṭ máy cho chaỵ hết (chú ý van đồng hồ chỉ 20psi). 
3. Cho virus vào bình và bâṭ máy chaỵ (500ml virus - 75ml) thì dừng laị. 
Tháo đầu Feed In cho vào cen 4 bâṭ pump rồi thu virus. 
4. Rửa máy sau khi lọc bằng nước cất và NaOH 0,1N. 
3.5.17. Phương pháp vô hoạt virus 
Virus vacxin PRRS thu hoạch từ môi trường tế bào Marc 145 được lọc, cô 
đặc và vô hoạt bằng formalin ở nồng độ thích hợp nhất. Dung dịch virus sau khi vô 
hoạt được đánh giá kết quả vô hoạt theo quy trình kiểm tra sau vô hoạt nêu dưới đây. 
3.5.18. Phương pháp kiểm tra sau vô hoạt 
 Phải kiểm tra để chắc chắn rằng không còn virus sống trong dung dịch 
virus vacxin sau vô hoạt. Hỗn dịch virus được lấy mẫu để kiểm tra theo quy 
trình sau: Sau khi trung hoà lấy 0,1 ml dung dịch virus đã vô hoạt cấy vào môi 
trường tế bào Marc 145, để ở 370C và theo dõi bệnh tích tế bào trong 12h, 24h, 
36h, 48h, 60h,72h. Nếu mẫu dung dịch virus nào có gây bệnh tích tế bào thí có 
nghĩa là virus chưa được vô hoạt hoàn toàn cần tiến hành vô hoạt lại. Mẫu nào 
không gây bệnh tích tế bào có nghĩa là virus đã được vô hoạt cần lặp lại thí 
 52 
nghiệm lần 2 để có kết luận chính thức. Trong khi kiểm tra có bố trí tế bào đối 
chứng không gây nhiễm virus PRRS. 
3.5.19. Phương pháp nhũ hóa vacxin 
Sau khi vô hoạt thành công tiến hành phối trộn hỗn dịch virus đã vô hoạt 
với chất bổ trợ. Hỗn dịch virus vacxin được phối trộn với chất bổ trợ theo tỉ lệ 
1:1. Đồng hóa hỗn hợp này trong máy trộn tá dược (máy đồng hóa T18D của 
hãng IKA) ở 40C trong thời gian tối thiểu 30 phút. Kiểm tra hỗn hợp vacxin vô 
hoạt bằng cách để ở 20C -80C qua đêm. Hỗn hợp đồng nhất, không phân lớp, 
không lắng cặn không tách nước là đạt yêu cầu. Nếu hỗn hợp vẫn tách nước và 
phân lớp thì tiếp tục chạy máy đồng hóa cho đến khi đạt. 
3.5.20. Phương pháp kiểm tra chỉ tiêu thuần khiết của vacxin 
3.5.20.1. Kiểm tra thuần khiết theo TCVN8684:2011 
Kiểm tra tạp nhiễm vi khuẩn 
Tiến hành cấy mẫu vacxin trên 2 ống môi trường kiểm tra sau đây: Môi 
trường thioglycollat, môi trường trypticaza đậu tương, 2 đĩa môi trường thạch 
máu, lượng vacxin cấy từ 1% đến 2% (phần thể tích) so với môi trường kiểm tra. 
Ủ môi trường đã cấy trong tủ 370C, theo dõi từ 7 ngày đến 10 ngày. 
Mẫu vacxin được xem là đạt tiêu chuẩn khi không có bất cứ vi sinh vật 
nào mọc trên môi trường kiểm tra trong thời gian theo dõi. 
Kiểm tra tạp nhiễm nấm mốc 
Mẫu vacxin được ria cấy trên môi trường thạch Sabouraud hoặc môi 
trường thủy phân casein đậu tương. Theo dõi 14 ngày ở nhiệt độ phòng (từ 200C 
đến 250C). Mẫu vacxin được xem là đạt tiêu chuẩn khi không có bất cứ tạp khuẩn 
nấm mốc nào mọc trên môi trường kiểm tra trong thời gian theo dõi. 
Kiểm tra tạp nhiễm Salmonella 
Mẫu vacxin được cấy trên môi trường kiểm tra, dùng một trong các loại 
môi trường sau: thạch MacConkey, thạch Salmonella-Shigella, thạch Brilliant 
Green, thạch Desoxycholat xitrat hoặc XLD, với nồng độ từ 1% đến 2% dung 
tích môi trường kiểm tra. Ủ môi trường đã cấy vacxin trong tủ ở 370C, theo dõi 
từ 18h đến 24h sau đó cấy chuyển tiếp sang ống môi trường nước, dùng một 
trong các loại môi trường sau: canh thang selenit hoặc canh thang tetrathionat. Ủ 
 53 
trong tủ ở 370C, theo dõi đến 48h đến 72h. Mẫu vacxin được xem là đạt khi 
không có vi khuẩn Salmonella mọc trên các loại môi trường kiểm tra. 
Kiểm tra tạp nhiễmMycoplasma 
Mẫu vacxin được cấy kiểm tra trên môi trường canh thang PPLO với nồng 
độ từ 1% đến 2% vacxin trong 100ml môi trường và trên đĩa thạch PPLO có bổ 
sung huyết thanh ngựa và chất chiết nấm men với thể tích 0,1ml vacxin trên 1 
đĩa. Theo dõi môi trường lỏng trong 14 ngày ở nhiệt độ 330C đến 370C. Tại các 
thời điểm 3 ngày, 7 ngày, 10 ngày và 14 ngày, lấy canh khuẩn ở môi trường lỏng 
trên ria cấy vào môi trường thạch PPLO (2 đĩa). Ủ trong tủ ấm ở 370C có 5% khí 
CO2, theo dõi trong 28 ngày. 
Mẫu vacxin được xem là đạt khi không có khuẩn lạc Mycoplasma mọc 
trên môi trường kiểm tra. 
Bên cạnh việc kiểm tra trên canh thang PPLO có thể tiến hành kiểm tra 
nhanh bằng PCR với cặp mồi đặc hiệu. 
3.5.21. Kiểm tra chỉ tiêu an toàn 
- Sử dụng 3 lợn mẫn cảm, khỏe mạnh, không có kháng thể PRRS, lợn 
được tiêm mỗi con 2 liều vacxin (vacxin keo phèn tiêm dưới da, vacxin nhũ dầu 
tiêm bắp). Theo dõi lợn trong 21 ngày. Vacxin được coi là đạt nếu tất cả lợn phải 
sống khỏe mạnh, không có bất cứ phản ứng cục bộ hay toàn thân nào. 
3.5.22. Phương pháp kiểm tra chỉ tiêu hiệu lực của vacxin 
Có 3 phương pháp đánh giá hiệu lực vacxin: 
- Xác định hàm lượng kháng thể bằng ELISA. 
- Xác định hàm lượng kháng thể bằng IPMA. 
- Phương pháp công cường độc. 
Gây miễn dịch 
 - Tiêm cho 5 lợn, mỗi con 1 liều vacxin (tiêm 2 mũi, mũi 2 cách mũi 1 là 
21 ngày) 3 lợn đối chứng không tiêm vacxin. 
 - 28 ngày sau mũi tiêm cuối cùng 5 lợn được gây miễn dịch cùng 3 lợn đối 
chứng được tiến hành lấy máu và công cường độc bằng chính chủng virus dùng 
sản xuất vacxin KTY-PRRS-01 có TCID50 = 3,16x107. Liều công là 100TCID50. 
 54 
Đánh giá hiệu giá kháng thể kháng PRRSV bằng phản ứng ELISA 
 - Lấy máu, chắt huyết thanh tại các thời điểm 0,21 và đánh giá hàm lượng 
kháng thể bằng phản ứng ELISA. 
 - Kết quả: Đánh giá theo bộ kit được sử dụng (S/P ≥ 0,4 dương tính, S/P < 
0,4 âm tính). 
Đánh giá hiệu giá kháng thể kháng PRRSV bằng phản ứng miễn dịch có gắn 
Enzyme trên tế bào 1 lớp (IPMA - Immunoperoxidase monolayer assay) 
 - Lấy máu, chắt huyết thanh tại các thời điểm 0, 21 và đánh giá hàm lượng 
kháng thể bằng phản ứng IPMA. 
 - Kết quả: Hiệu giá kháng thể ≥ 1/640 đạt bảo hộ. 
Đánh giá kết quả công cường độc 
 * Lô miễn dịch: 100% lợn sống khỏe mạnh, có thể có biểu hiện sốt nhẹ, 
kém ăn, chảy nước mũi trong khoảng 3-5 ngày sau công cường độc, sau đó trở lại 
bình thường. 
* Lô đối chứng: Lợn có triệu chứng, bệnh tích điển hình của PRRS. 
* Đánh giá hàm lượng virus trong máu. 
Đánh giá kết quả 
 Vacxin được coi là đạt nếu đáp ứng được 03 chỉ tiêu nêu trên. 
3.5.23. Phương pháp Realtime RT-PCR 
Từ RNA của virus PRRS được tách chiết theo hướng dẫn của nhà sản xuất 
(Qiagen). Tiến hành chuẩn bị hỗn hợp phản ứng Realtime-PCR theo các thành 
phần như sau: Dw (Nước) 4,3µl, 2x Reaction buffer 7,5 µl, Primer forward 0,3, 
Primer reverse 0,3 µl, Probe 0,3 µl, Enzyme mix 0,3 µl, RNA mẫu 2 µl. Tổng thể 
tích hỗn hợp phản ứng là 15 µl. 
Virus Primer/Probe Trình tự (5’-3’) Dye huỳnh quang 
Virus 
PRRS 
Probe (FAO) CGCGTAGAACTGTGACAACAACGCTGA Hex 
Mồi xuôi (FAO) CCCAAGCTGATGACACCTTTG Nguồn: 
(TCVN-8400-21-2014) Mồi ngược (FAO) AATCCAGAGGCTCATCCTGGT 
 Đặt hỗn hợp phản ứng vào máy Realtime PCR, chọn dye phù hợp và chạy 
theo chu kỳ nhiệt như sau: 500C/15 phút, 950C/2 phút thực hiện 1 chu kỳ và 
950C/10 giây, 600C/40 giây thực hiện 40 chu kỳ. 
 55 
Đọc kết quả 
- Mẫu đối chứng dương cho giá trị Ct mong đợi (Ct < 35). 
- Mẫu đối chứng âm không cho giá trị Ct. 
- Mẫu là dương tính khi mẫu RNA cho giá trị Ct ≤ 35. 
- Mẫu nghi ngờ, khi mẫu RNA cho giá trị Ct > 35. 
- Mẫu là âm tính, khi mẫu RNA không cho giá trị Ct. 
3.5.24. Phương pháp ELISA 
- Các bước tiến hành: 
1. Để bộ KIT ở nhiệt độ phòng trước khi làm 1h. 
2. Pha loãng mẫu: 990µl Dilution buffer: 10 µl huyết thanh. 
3. Nhỏ 100 µl mẫu đã pha loãng vào mỗi giếng, cả đối chứng dương và 
đối chứng âm. 
4. Ủ 30 phút ở nhiệt độ phòng. 
5. Rửa khay ba lần bằng 300 µl/giếng bằng dung dịch rửa 1%. 
6. Loại bỏ toàn bộ dung dịch rửa trong khay. 
7. Nhỏ 100 µl HRPO Anti-Swine IgG conjugate vào mỗi giếng và ủ 30 
phút ở nhiệt độ phòng. 
8. Rửa khay ba lần bằng 300 µl /giếng bằng dung dịch rửa 1%. 
9. Nhỏ 100 µl TMB substrate. Ủ ở nhiệt độ phòng 15 phút. Màu xanh sẽ 
xuất hiện ở giếng đối chứng dương. 
10. Nhỏ 50 µl stop solution để dừng phản ứng. 
11. Đọc kết quả bằng máy đọc ELISA ở bước sóng 450nm. 
Đọc kết quả: 
Giá trị trên máy đọc ELISA: 
Đối chứng dương: OD > 0,5 
Đối chứng âm: OD < 0,3 
Tính giá trị CPC: CPC = OD đối chứng dương – OD đối chứng âm 
Tính giá trị SP: SP = (OD của mẫu – OD đối chứng âm)/CPC 
Kết quả: SP ≥ 0,4: Dương tính 
 SP < 0,4: Âm tính 
 56 
3.5.25. Phương pháp thống kê, xử lý số liệu 
Phân tích xác nhận chuỗi gen thu được thông qua chương trình Blast trên 
Ngân hàng gen (GenBank) ( Xác định sự tương 
đồng về nucleotide của phân đoạn gen thu được trong nghiên cứu bằng phần 
mềm Bioedit Version 7.2.5. Xác định nguồn gốc phát sinh chủng loại trên cơ sở 
trình tự gen của chủng virus thu nhận được bằng phần mềm MEGA Version 6.0. 
Các số liệu được xử lý trên phần mềm Excel 2010. 
 57 
PHẦN 4. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 
4.1.NGHIÊN CỨU MỘT SỐ BIỂU HIỆN BỆNH LÝ CỦA LỢN MẮC PRRS 
4.1.1. Thu thập mẫu bệnh phẩm 
Để phục vụ việc tuyển chọn virus PRRS làm giống sản xuất vacxin, chúng 
tôi tiến hành thu thập mẫu bệnh phẩm của lợn nghi mắc PRRS từ thực địa. Kết 
quả thu thập mẫu lợn nghi mắc PRRS được trình bày tại bảng 4.1. 
Bảng 4.1. Số lượng mẫu lợn nghi mắc PRRS thu thập được 
TT Nhóm lợn 
Số lượng 
(con) 
Triệu chứng lâm sàng Địa điểm thu thập 
1 Lợn con theo mẹ 13 
Sốt cao, phát ban, tiêu