Luận án Nghiên cứu tạo kháng nguyên tái tổ hợp của virus gây bệnh cúm A/H7N9 bằng phương phápbiểu hiện tạm thời trong cây thuốc lá (nicotiana benthamiana) thông qua vi khuẩn agrobacterium tumefaciens

) 
Hình 3.3. Kết quả thiết kế vector pCB301_35S_ HA mono_ELP 
(A): Xử lý vector pCB301-Kan bằng HindIII; (B): Xử lý vector pRTRA_35S_HA 
mono_ELP bằng HindIII; M: Marker ADN 
Các phân đoạn DNA có kích thƣớc 5,6 kb và 4,1 kb sau đó đƣợc thu nhận và 
tinh sạch để phục vụ cho phản ứng nối ghép tạo vector chuyển gen tƣơng ứng 
pCB301_35S_ HA mono_ELP. Plasmid tái tổ hợp đƣợc tạo ra từ phản ứng lai sẽ 
đƣợc biến nạp vào tế bào khả biến E.coli DH5α bằng phƣơng pháp sốc nhiệt để 
chọn lọc, nhân nhanh plasmid với số lƣợng lớn. Để biết chắc chắn plasmid đã đƣợc 
biến nạp vào chúng tôi tiến hành nuôi và tách plasmid khuẩn biến nạp vector tái tổ 
hợp (các plasmid cho kết quả dƣơng tính với PCR khuẩn lạc), sau đó kiểm tra bằng 
cắt enzyme giới hạn HindIII (Hình 3.4.A) Các kết quả kiểm tra đã chứng minh 
vector pCB301_35S_ HA mono_ELP đã đƣợc thiết kế thành công. Vector tái tổ 
hợp sau đó đƣợc biến nạp vào tế bào A. tumefaciens C58C1, đồng thời chủng 
E.coli mang vector này đƣợc giữ dòng bằng glycerol 100% bảo quản ở -80oC để 
phục vụ cho các nghiên cứu tiếp theo. 
 62 
B A 
Hình 3.4. Kết quả thiết kế vector pCB301_35S_ HA mono_ELP 
 (A): Sản phẩm cắt kiểm tra plasmid pCB301 tái tổ hợp bằng HindIII, M: Marker ADN 
(B) Sơ đồ vector pCB301 mang cassette 35S-H7-Histag-Cmyc-100xELP 
3.1.3. Kết quả tạo vector chuyển gen mã hóa kháng nguyên HA trimeric_ELP 
3.1.3.1. Tạo vector tách dòng pRTRA _35S_ HA trimeric_ELP 
Vector tách dòng pRTRA_H5pII_ Histag-Cmyc-100xELP sau khi đƣợc xử 
lý bằng enzyme BamHI và PspOMI đƣợc gắn với gen HA và đƣợc dòng hóa trong 
tế bào E.coli DH5α bằng phƣơng pháp sốc nhiệt và cấy trải trên môi trƣờng LB đặc 
có bổ sung kháng sinh ampicillin 100 µg/ml. Để chọn những dòng khuẩn lạc mang 
vector tái tổ hợp mong muốn chúng tôi tiến hành tách plasmid từ các khuẩn lạc mọc 
trên đĩa đem thực hiện phản ứng cắt bằng enzyme giới hạn BamHI và PspOMI. thì 
plasmid pRTRA tái tổ hợp sẽ cho 2 vạch băng khi kiểm tra trên gel agrose 0,8 %. Ở 
Hình 3.5 cho thấy, khuẩn lạc đƣợc tách plasmid đƣợc kiểm tra cắt bằng BamHI và 
PspOMI cho các vạch trùng với kích thƣớc tính toán lý thuyết của 
pRTRA_35S_pII_ Histag-Cmyc-100xELP là 5,05 kb và HA là 1,7 kb. Nhƣ vậy, 
 63 
qua kiểm tra bằng xử lý enzyme giới hạn cho kết quả đúng theo tính toán lý thuyết. 
Qua đó chúng tôi có thể khẳng định đã hoàn thành giai đoạn nhân dòng HA trong 
vector pRTRA_35S_pII_ Histag-Cmyc-100xELP, và vector này đã đƣợc biến nạp 
thành công vào vi khuẩn E.coli DH5α. 
Hình 3.5. Kết quả điện di sản phẩm xử lý vector tách dòng bằng enzyme giới 
hạn BamHI/PspOMI . 
 M: Marker DNA, (1) pRTRA_35S_ HA trimeric_ELP. 
3.1.3.2. Tạo vector chuyển gen pCB301_35S_ HA trimeric_ELP. 
Vector tách dòng trung gian pRTRA35S_ HA trimeric_ELP và pBC301cùng 
đƣợc xử lý bằng enzyme HindIII nhằm thu đƣợc đoạn gen mục tiêu bao gồm 
promoter 35S_ HA trimeric_ELP và vector mở vòng. Đối với vector pCB301, để 
tránh hiện tƣợng đóng vòng, sản phẩm cắt sau khi tinh sạch đƣợc xử lý tiếp với 
enzyme SAP. Kết quả điện di cho thấy, với sản phẩm cắt vector pCB301 cho 1 băng 
nằm ở kích thƣớc khoảng 5,6 kb theo đúng tính toán lý thuyết (Hình 3.6A); sản 
phẩm cắt vector pRTRA35S_ HA trimeric_ELP, cho 2 băng, 1 băng có kích thƣớc 
 64 
khoảng 4,2 kb tƣơng ứng với cassette 35S_ HA trimeric_ELP và băng còn lại có 
kích thƣớc khoảng 2,6 kb là đoạn khung vector còn lại (Hình 3.6B). 
Hình 3.6. Kết quả phân tích kiểm tra vector chuyển gen pCB301_35S_ HA 
trimeric_ELP 
(A): Ảnh điện di kiểm tra sản phẩm cắt plasmid pCB301 tái tổ hợp bằng HindIII 
(B): Xử lý vector pRTRA_35S_ HA trimeric_ELP bằng HindIII ; M: Marker ADN 
 Các phân đoạn DNA có kích thƣớc 5,6 kb và 4,2 kb sau đó đƣợc thu nhận và 
tinh sạch để phục vụ cho phản ứng nối ghép tạo vector chuyển gen tƣơng ứng 
pCB301_35S_ HA trimeric_ELP. Plasmid tái tổ hợp đƣợc tạo ra từ phản ứng lai sẽ 
đƣợc biến nạp vào tế bào khả biến E.Coli DH5α bằng phƣơng pháp sốc nhiệt để 
chọn lọc, nhân nhanh plasmid với số lƣợng lớn. Để biết chắc chắn plasmid đã đƣợc 
biến nạp vào chúng tôi tiến hành nuôi và tách plasmid khuẩn biến nạp vector tái tổ 
hợp (các plasmid cho kết quả dƣơng tính với PCR khuẩn lạc), sau đó kiểm tra bằng 
cắt enzyme giới hạn HindIII (Hình 3.6A) Các kết quả kiểm tra đã chứng minh 
vector pCB301_35S_ HA trimeric_ELP đã đƣợc thiết kế thành công. Vector tái tổ 
hợp sau đó đƣợc biến nạp vào tế bào A. tumefaciens C58C1, đồng thời chủng 
 65 
E.coli mang vector này đƣợc giữ dòng bằng glycerol 100% bảo quản ở -80oC để 
phục vụ cho các nghiên cứu tiếp theo. 
Hình 3.7. Kết quả kiểm tra vector pCB301_35S_ HA trimeric_ELP bằng 
enzyme cắt giới hạn. 
(A) Sản phẩm cắt kiểm tra plasmid pCB301 tái tổ hợp bằng HindIII; M: Marker 
AND; (B) Sơ đồ vector pCB301 mang cassette 35S-HApII-Histag-Cmyc-100xELP 
3.1.4. Kết quả tạo vector chuyển gen mã hóa kháng nguyên HA trimeric 
3.1.4.1. Tạo vector tách dòng pRTRA _35S_ HA trimeric 
Vector tách dòng pRTRA_H5pII sau khi đƣợc xử lý bằng enzyme BamHI 
và PspOMI đƣợc gắn với gen HA và đƣợc dòng hóa trong tế bào E.coli DH5α 
bằng phƣơng pháp sốc nhiệt và cấy trải trên môi trƣờng LB đặc có bổ sung 
kháng sinh chọn lọc. Để chọn những dòng khuẩn lạc mang vector tái tổ hợp 
mong muốn chúng tôi tiến hành tách plasmid từ các khuẩn lạc mọc trên đĩa đem 
thực hiện phản ứng cắt bằng enzyme giới hạn BamHI và PspOMI. thì plasmid 
pRTRA tái tổ hợp sẽ cho 2 vạch băng khi kiểm tra trên gel agrose 0,8 %. Kết quả 
ở (Hình 3.8) cho thấy, khuẩn lạc đƣợc tách plasmid cắt kiểm tra bằng BamHI và 
PspOMI cho các vạch trùng với kích thƣớc tính toán lý thuyết của 
pRTRA_35S_pII_ là 3,6 kb và HA là 1,7 kb. Qua đó chúng tôi có thể khẳng định 
 66 
đã hoàn thành giai đoạn nhân dòng HA trong vector pRTRA_35S_pII, và vector 
này đã đƣợc biến nạp thành công vào vi khuẩn E.coli DH5α. 
Hình 3.8. Kết quả điện di sản phẩm xử lý vector tách dòng bằng enzyme giới 
hạn BamHI/PspOMI . 
 (1) pRTRA_35S_ HA trimeric; M: Marker ADN 
3.1.4.2. Tạo vector chuyển gen pCB301_35S_ HA trimeric. 
Vector tách dòng trung gian pRTRA_35S_ HA trimeric và pBC301cùng đƣợc 
xử lý bằng enzyme HindIII nhằm thu đƣợc đoạn gen mục tiêu bao gồm promoter 
35S_ HA trimeric. Với pCB301, để tránh hiện tƣợng đóng vòng, sản phẩm cắt sau 
khi tinh sạch đƣợc xử lý tiếp với enzyme SAP. Với vector pRTRA 35S_HApII khi 
đƣợc xử lý bằng HindIII sẽ cho 2 băng DNA cùng kích thƣớc khoảng hơn 2,5 kb 
(không thể phân tách khi điện di trên gel agarose) nên sản phẩm cắt tiếp tục đƣợc xử 
lý với enzyme ScaI kết quả sản phẩm cắt vector pRTRA 35S_ HA trimeric cho 3 
băng: 1 vạch có kích thƣớc khoảng 2,5 kb tƣơng ứng với cassette 35S_ HA trimeric, 
2 băng còn lại có kích thƣớc khoảng 1,7 kb và 0,9 kb là đoạn khung vector còn lại 
 67 
(Hình 3.9A).. Kết quả điện di cho thấy, với sản phẩm cắt vector pCB301 cho 1 băng 
nằm ở kích thƣớc khoảng 5,6 kb theo đúng tính toán lý thuyết (Hình 3.9B). 
Hình 3.9. Kết quả phân tích kiểm tra vector chuyển gen pCB301_35S_ HA 
trimeric. bằng HindIII. 
(A): Xử lý vector pRTRA_35S_ HA trimeric bằng HindIII; (B): Sản phẩm cắt 
plasmid pCB301 tái tổ hợp bằng HindIII; M: Marker ADN 
Các phân đoạn DNA có kích thƣớc 5,6 kb và 2,5 kb sau đó đƣợc thu nhận và 
tinh sạch để phục vụ cho phản ứng nối ghép tạo vector chuyển gen tƣơng ứng 
pCB301_35S_ HA trimeric. Plasmid tái tổ hợp đƣợc tạo ra từ phản ứng lai sẽ đƣợc 
biến nạp vào tế bào khả biến E.Coli DH5α bằng phƣơng pháp sốc nhiệt để chọn lọc, 
nhân nhanh plasmid với số lƣợng lớn. Để biết chắc chắn plasmid đã đƣợc biến nạp 
vào chúng tôi tiến hành nuôi và tách plasmid khuẩn biến nạp vector tái tổ hợp (các 
plasmid cho kết quả dƣơng tính với PCR khuẩn lạc), sau đó kiểm tra bằng cắt 
enzyme giới hạn HindIII (Hình 3.10A). Các kết quả kiểm tra đã chứng minh vector 
pCB301_35S_ HA trimeric đã đƣợc thiết kế thành công. Vector tái tổ hợp sau đó 
 68 
đƣợc biến nạp vào tế bào A. tumefaciens C58C1, đồng thời chủng E.Coli mang 
vector này đƣợc giữ dòng bằng glycerol 100% bảo quản ở -80oC để phục vụ cho các 
nghiên cứu tiếp theo. 
Hình 3.10. Kết quả kiểm tra vector pCB301_35S_ HA trimeric. 
(A): Sản phẩm cắt plasmid pCB301 tái tổ hợp bằng HindIII; M: Marker AND; (B) 
Sơ đồ vector pCB301 mang cassette 35S- HA trimeric 
3.1.5. Tạo cấu trúc vector chuyển gen thực vật mang gen HA trimeric-IgMFc 
3.1.5.1. Tạo vector tách dòng mang gen mã hóa protein HA trimeric-IgMFc 
Thiết kế vector tách dòng pRTRA_35S_SP_His_ HA trimeric-IgMFc. Xử lý 
đồng thời đoạn gen HA trimeric-IgMFc đã khuếch đại và vector 
pRTRA_35S_SP_His_ HA trimeric-IgMFc bằng cặp enzyme BamHI và PspOMI. 
Gen HA đã xử lý enzyme và đoạn khung vector sau khi loại bỏ gen mã hóa 
kháng nguyên H5 (khoảng 1,5 kb) còn lại có chiều dài gần 4,3 kb đƣợc thu nhận 
và tinh sạch (Hình 3.11 A,B) phục vụ cho phản ứng nối ghép bằng T4-DNA 
ligase để tạo vector tái tổ hợp pRTRA_35S_SP_His_ HA trimeric-IgMFc. Sản 
phẩm nối ghép đƣợc nhân dòng trong E.coli DH5α. Để sàng lọc các dòng khuẩn 
lạc mang plasmid tái tổ hợp mong muốn, chúng tôi tiến hành kiểm tra bằng 
phƣơng pháp PCR khuẩn lạc sử dụng cặp mồi HA_F/ HA_R khuếch đại một phân 
 69 
đoạn gen HA trimeric-IgMFc có kích thƣớc 690 bp (Hình 3.11C); đồng thời cắt 
kiểm tra bằng cặp enzyme giới hạn BamHI và PspOMI. Kết quả điện di sản 
phẩm cắt cho 2 băng vạch khoảng 1,5 kb và 4,3 kb theo đúng tính toán lý thuyết 
(Hình 3.11D). Nhƣ vậy đã thiết kế thành công vector pRTRA_35S_SP_His_ HA 
trimeric-IgMFc. 
Hình 3.11. Kết quả thiết kế vector pRTRA_35S_SP_His_ HA trimeric-IgMFc xử 
lý vector bằng BamHI và PspOMI 
 (A, B): Sản phẩm tinh sạch đoạn gen HA (1) và khung vector (2) sau khi đã xử lý 
bằng BamHI và PspOMI (C): PCR khuẩn lạc chọn lọc các khuẩn lạc mang plasmid 
tái tổ hợp (D): cắt kiểm tra vector bằng BamHI và PspOMI. 
3.1.5.2. Tạo vector chuyển gen pCB301_35S_SP_His_HA trimeric-IgMFc 
Plasmid pRTRA_35S_SP_His_ HA trimeric-IgMFc và pCB301- Kan cùng 
đƣợc xử lý bằng enzyme HindIII nhằm thu đƣợc đoạn gen mục tiêu bao gồm 
35S_SP_His_ HA trimeric-IgMFc và khung vector pCB301 mở vòng. Kết quả điện 
 70 
di cho thấy, với sản phẩm cắt vector pCB301 cho 1 băng nằm ở kích thƣớc khoảng 
5,5 kb theo đúng tính toán lý thuyết (Hình 3.12.A1); trong khi đó sản phẩm cắt 
vector pRTRA_35S_SP_His_ HA trimeric-IgMFc cho 2 vạch băng: 1 vạch có kích 
thƣớc gần 3,2 kb tƣơng ứng với cassette 35S_SP_His_ HA trimeric-IgMFc, vạch 
băng còn lại có kích thƣớc gần 2,7 kb là đoạn khung vector còn lại (Hình 3.12.A2). 
Các phân đoạn DNA có kích thƣớc 5,5 kb và 3,2 kb sau đó đƣợc thu nhận và tinh 
sạch để phục vụ cho phản ứng nối ghép tạo vector chuyển gen pCB301_35S_SP_His_ 
HA trimeri-IgMFc. Vector tái tổ hợp này đƣợc kiểm chứng bằng xử lý enzyme giới 
hạn HindIII (Hình 3.12B). Đồng thời để chọn đƣợc vector chứa gen mã hóa protein 
HA trimeric-IgMFc có chiều biểu hiện ngƣợc chiều gen kháng kháng sinh, chúng tôi 
đã cắt kiểm tra bằng enzyme NcoI (Hình 3.12C). Các kết quả trên đã chứng minh 
vector pCB301_35S_SP_His_ HA trimeric-IgMFc đã đƣợc thiết kế thành công. 
Hình 3. 12. Kết quả thiết kế vector pCB301_35S_SP_His_ HA trimeric-IgMFc 
 (A): Xử lý vector pCB301-Kan (1) và RTRA_35S_SP_His_HA trimeric-IgMFc (2) 
bằng HindIII (B): Cắt kiểm tra vector pCB301_35S_SP_His_HA trimeric-IgMFc 
bằng HindIII; (C): Cắt kiểm tra vector pCB301_35S_SP_His_ HA trimeric-IgMFc 
bằng NcoI. 
 71 
Từ các kết quả nghiên cứu đạt đƣợc, có thể khẳng định đã thiết kế thành công các 
cấu trúc mang vector chuyển gen, bao gồm: pCB301 35S-HA mono_ELP, pCB301 
35S-HA trimeric_ELP, pCB301 35S-HA trimeri, pCB301_35S-HA trimeric-IgMFc 
và tạo thành công các chủng vi khuẩn A. tumefaciens C58C1 mang vector chuyển gen 
tƣơng ứng. Các chủng vi khuẩn này sẽ đƣợc sử dụng để biến nạp vào lá thuốc lá bằng 
phƣơng pháp biểu hiện tạm thời các gen mang kháng nguyên HA trong mô lá thuốc lá; 
tách chiết các protein, tinh sạch và thử đáp ứng miễn dịch trên chuột, hƣớng tới làm 
vacxin kháng virus cúm. 
3.2. Tối ƣu các điều kiện biểu hiện và tinh sạch protein HA tái tổ hợp 
3.2.1. Tối ưu các điểu kiện biểu hiện protein HA tái tổ hợp 
3.2.1.1. Ảnh hưởng của vector hỗ trợ 
Để đánh giá mức độ hoạt động của vector mang gen mã hóa cho protein tái tổ 
hợp HA và vector hỗ trợ mang gen mã hóa cho protein HcPro_PRSV ức chế bất 
hoạt gen hoạt động dƣới sự kiểm soát của promotor CaMV35S, hai thí nghiệm khác 
nhau đƣợc thực hiện đồng thời sử dụng chủng Agrobacterium tumefaciens mang 
vector hỗ trợ trên. Ở thí nghiệm đầu tiên chủng vi khuẩn mang gen mã hóa cho 
protein tái tổ hợp HA đƣợc nuôi đến khi nồng độ khuẩn OD600 đạt 0,5 và đƣợc xâm 
nhiễm vào cây thuốc lá (4-6 tuần tuổi) bằng phƣơng pháp hút chân không. Ở thí 
nghiệm thứ 2 chủng vi khuẩn mang gen mã hóa cho protein tái tổ hợp HA đƣợc 
nuôi đến khi nồng độ khuẩn OD600 đạt 0,5 và đƣợc xâm nhiễm vào cây (4-6 tuần 
tuổi) cùng với vector hỗ trợ pIBT/HC-Pro PRSV bằng phƣơng pháp hút chân 
không. Mẫu lá sẽ đƣợc thu sau 6 ngày xâm nhiễm để tách protein. Mức độ biểu hiện 
của HA khi không có vector hỗ trợ và có vector hỗ trợ đƣợc đánh giá bằng phƣơng 
pháp lai miễn dịch. 
Trên (Hình 3.13) Westert-blot chỉ ra vạch băng màu nâu có kích thƣớc khoảng 
108,8 kDa ở các giếng 1, 2, 3,4 đúng với kích thƣớc của protein HA theo tính toán 
lý thuyết. Nhƣ vậy, protein HA đã đƣợc biểu hiện thành công ở lá bằng phƣơng 
pháp biểu hiện tạm thời. Kết quả này một lần nữa khẳng định chúng tôi đã thiết kế 
 72 
thành công các vector mang gen mã hóa cho protein HA đã hoạt động dƣới sự kiểm 
soát của promotor CaMV35S. 
Hình 3.13. Kết quả đánh giá biểu hiện kháng nguyên HA 
 (A): Dịch chiết protein khi không sử dụng vector hỗ trợ ; (B): Dịch chiết protein 
khi sử dụng vector hỗ trợ HcPro PRSV. 
Từ kết quả lai miễn dịch, chúng tôi cũng đã tính toán đƣợc mức độ biểu hiện 
của protein HA khi không sử dụng vector hỗ trợ và có sử dụng vector hỗ trợ Hcpro 
PRSV. Kết quả thể hiện ở Bảng 3.1. 
Bảng 3.1. Nồng độ protein HA trong mẫu lá biểu hiện tạm thời protein HA khi 
không sử dụng vector hỗ trợ và có sử dụng vector hỗ trợ HcPro PRSV/2bCMV 
STT Mẫu protein 
Nồng độ protein HA (ng/µg TSP)* 
Có sử dụng vector hỗ 
trợ Hcpro PRSV 
Không sử dụng vector hỗ 
trợ Hcpro PRSV 
1 HA trimeric 2,45 0,84 
2 HA trimeric-IgMFc 2,83 0,68 
3 HA trimeric_ELP 1,78 0,43 
4 HA mono_ELP 1,02 0,16 
Kết quả biểu hiện HA cho thấy mức độ biểu hiện của gen đích đã tăng gấp 3 
lần khi biểu hiện đồng thời với vector hỗ trợ Hcpro PRSV. Điều này có thể giải 
 73 
thích là do cơ chế bất hoạt gen ở thực vật hoạt động và ức chế sự biểu hiện protein 
ngoại lai. Protein Hc-Pro là những protein ức chế sự bất hoạt RNA giúp tăng 
cƣờng biểu hiện tạm thời protein tái tổ hợp ở thực vật. Protein Hc-pro là một trong 
những protein ức sự câm RNA đầu tiên đƣợc tìm thấy. Các gen mã hóa cho protein 
Hc-pro phân lập từ virus gây bệnh ở thuốc lá Tobacco etch potyvirus (TEV), virus 
ở khoai tây Potato virus Y (PVY), và virus khảm tuy lip Turnip mosaic virus 
(TuMV) (Zhong và cs.,2005), virus khảm đƣờng mía Sugarcane mosaic virus 
(SCMV) ( Shukla và cs.,1992; Shukla and Ward, 1989 ) đã đƣợc nghiên cứu và 
chứng minh cho khả năng tăng cƣờng biểu hiện protein tái tổ hợp ở thực vật. 
Protein Hc-pro ức chế cơ chế bất hoạt RNA ở thực vật bằng cách ngăn cản sự phân 
giải các mRNA và RNA sợi đôi từ đó giảm lƣợng siRNA hoặc làm hỏng chức năng 
cắt của enzyme cắt sợi đôi Dicer và RISC (Zhang và cs., 2008). 
Nhƣ vậy, chúng tôi có thể kết luận khi sử dụng vector hỗ trợ đã hoạt động và 
làm tăng biểu hiện protein HA. 
3.2.1.2. Kết quả tối ưu quy trình biểu hiện tạm thời kháng nguyên HA trên cây thuốc lá 
Biểu hiện tạm thời protein tái tổ hợp nói chung và kháng nguyên HA nói riêng 
ở thực vật bằng phƣơng pháp biểu hiện tậm thời khi sử dụng máy hút chân không 
chƣa từng đƣợc tiến hành ở Việt Nam. Mặc dù quy trình thực hiện đơn giản nhƣng 
có nhiều yếu tố ảnh hƣởng đến khả năng biểu hiện của protein tái tổ hợp nhƣ: Nồng 
độ chất dẫn dụ Acetone syringone (AS), nồng độ vi khuẩn cho xâm nhiễm, vị trí lá 
xâm nhiễm, thời gian thu mẫu lá. Vì vậy, việc tiến hành xây dựng một quy trình 
chuẩn cho biểu hiện protein tái tổ hợp là rất cần thiết. Trong nghiên cứu này, chúng 
tôi tiến hành tối ƣu bốn yếu tố ảnh hƣởng đến biểu hiện tạm thời HA trong điều 
kiện có sự hỗ trợ của protein HC-pro là: Nồng độ chất dẫn dụ acetone syringone 
(AS), nồng độ khuẩn cho xâm nhiễm, vị trí lá xâm nhiễm và thời gian thu mẫu. Kết 
quả biểu hiện của HA tại các điều kiện khác nhau đƣợc đánh giá bằng lai miễn dịch 
(Hình 3.14) và phân tích bằng phần mềm ImageJ. Số liệu đƣợc xử lý trên Excel và 
ảnh hƣởng của các yếu tố đến biểu hiện của protein HA đƣợc đánh giá bằng phần 
mềm ANOVA. 
 74 
Hình 3.14. Kết quả biểu hiện protein HA ở các điều kiện thí nghiệm khác nhau 
M: Marker; 1,2,3,4,5,6,7,8,9: Dịch chiết protein từ lá biểu hiện protein tại các công 
thức thí nghiệm L1,L2,L3,L4,L5,L6,L7,L8,L9;10,11,12,13lần lượt là: 
50,100,150,200 ng ScFv-cmyc;14: Đối chứng âm là dịch chiết protein từ cây hút 
chân không với đệm MES. 
Acetosyringone (AS) là các hợp chất phenol do tế bào thực vật bị thƣơng tiết 
ra, có vai trò quan trọng trong việc nhận biết và gắn kết vi khuẩn với tế bào thực 
vật. Vì vậy, trong các thí nghiệm chuyển gen hay biểu hiện tạm thời sử dụng vi 
khuẩn A. tumefaciens, AS thƣờng đƣợc thêm vào nhƣ là chất dẫn dụ khuẩn giúp cho 
khuẩn dễ dàng xâm nhiễm vào cây. Chúng tôi tiến hành thí nghiệm với các nồng độ 
chất dẫn dụ khác nhau AS=0, AS=200, AS=400. Mật độ tế bào vi khuẩn đƣợc xác 
định bởi giá trị quang phổ OD ở bƣớc sóng 600 của dịch lỏng vi khuẩn, có liên quan 
tới sinh khối tế bào của chúng hay số lƣợng tế bào trong một thể tích nhất định. 
Trong nghiên cứu biểu hiện tạm thời việc xác định mật độ vi khuẩn phù hợp, giai 
đoạn vi khuẩn sinh trƣởng khỏe có ý nghĩa quan trọng để hiệu quả chuyển gen đƣợc 
cao nhất. Yếu tố thí nghiệm nồng độ vi khuẩn chúng tôi xác định ở các mức đo mật 
độ vi khuẩn OD600 0,1; 0,5 và 1. Vị trí lá trên cây ảnh hƣởng không ít đến quá trình 
biến nạp vector đích vào lá. Với đặc tính lá cây lúc còn non khả năng sinh trƣởng 
M	1	2	3	4	5	6	7	8	9	10	11	12	13	14	 
(kDa) 
72 
55 
43 
34 
26	 
17 
130 
95 
30 
108 
 75 
khỏe và khả năng tổng hợp các chất cao, lá già ngƣợc lại khả năng sinh trƣởng kém, 
đặc biệt sự tổng hợp các chất hầu nhƣ diễn ra rất chậm. Bên cạnh đó, khả năng xâm 
nhập của vi khuẩn vào lá non cũng dễ hơn lá già. Vì vậy trong thí nghiệm này 
chúng tôi kiểm tra vai trò của vị trí lá ảnh hƣởng đến quá trình biểu hiện protein 
đích trong cây. Chúng tôi phân chia đối tƣợng lá non, lá bánh tẻ và lá già. 
Một yếu tố nữa cần nghiên cứu là thời gian thu lá sau khi biểu hiện tạm thời 
cũng ảnh hƣởng nhiều đến hàm lƣợng protein tái tổ hợp trong lá. Nếu thu lá quá 
sớm thì sự tích lũy không đạt đƣợc tối đa. Ngƣợc lại, thu lá quá muộn, khi đó lá đi 
vào giai đoạn chết do tổn thƣơng của quá trình biểu hiện tậm thời dẫn đến sự phân 
hủy protein đặc biệt là các protein ngoại lai. Trong nghiên cứu này chúng tôi đã 
thí nghiệm thu lá ở 3 thời điểm khác nhau là sau 4 ngày, 6 ngày và 8 ngày sau khi 
biến nạp. Để tìm đƣợc điều kiện tối ƣu cho sự biểu hiện protein HA và đánh giá 
ảnh hƣởng của các yếu tố đến hàm lƣợng HA trong lá chúng tôi đã phân tích hàm 
lƣợng HA tại các công thức khác nhau và phân tích so sánh bằng ANOVA. Kết 
quả Bảng 3.2. 
Bảng 3.2. Kết quả phân tích phương sai của các công thức thí nghiệm trong thí 
nghiệm trực giao 
Source of variation Sum of square Degree of freedom Mean square F value 
Nồng độ AS 31,28394 2 15,64197 1.002415 
OD khuẩn 1809,302 2 904.6509 6.146359 
Vị trí lá 1708,229 2 854.1146 6.137808 
Thời gian thu mẫu 35346,6 2 17673.3 29.88034 
Qua phân tích hàm lƣợng HA ở các điều kiện thí nghiệm khác nhau bằng 
ANOVA có thể thấy mặc dù HA đều biểu hiện trong tất cả các điều kiện nhƣng vẫn 
có sự khác nhau nhiều về mức độ biểu hiện của HA giữa mỗi công thức thí nghi