Luận án Nghiên cứu thu nhận hoạt chất kìm hãm α- Glucosidaza từ ASPergillus Oryzae và hướng ứng dụng luận

cơ chất là bột ngô, bột đỗ tương, cám gạo và gạo). Sau 3 ngày nuôi tĩnh ở nhiệt độ 30 
± 20C, xác định mật độ tế bào của A.oryzae T6 (mục 2.2.1). 
2.3.3.2. Ảnh hưởng của thành phần tỷ lệ trấu trong môi trường rắn đến sinh trưởng 
của A.oryzae T6 
Nuôi cấy A.oryzae T6 vào các bình chứa môi trường M5 (mục 2.1.3.4) có thành phần 
cám gạo : gạo là 1 : 1 (100 g môi trường trong bình tam giác 250 ml) với thành phần ở tỷ lệ 
trấu: 5; 10; 50; 15; 20; 25; 30; 35 và 40%. Sau 72 giờ nuôi tĩnh ở nhiệt độ 30 ± 20C, xác 
định mật độ tế bào của A.oryzae T6 (mục 2.2.1). 
2.3.3.3. Ảnh hưởng độ ẩm ban đầu của môi trường nhân giống đến sinh trưởng 
của A.oryzae T6 
Nuôi cấy A.oryzae T6 vào các bình chứa môi trường M5 (mục 2.1.3.4) được chỉnh 
độ ẩm ban đầu theo các thang 45; 50; 55; 60 và 65% (100 g môi trường trong bình tam 
giác 250 ml). Sau 120 giờ nuôi tĩnh ở nhiệt độ 30 ± 20C, xác định mật độ tế bào của 
A.oryzae T6 (mục 2.2.1). 
2.3.3.4. Ảnh hưởng pH ban đầu của môi trường nhân giống đến sinh trưởng của 
A.oryzae T6 
Nuôi cấy A.oryzae T6 vào các bình chứa môi trường M5 (mục 2.1.3.4) được chỉnh 
pH ban đầu theo các thang 3,5; 4,0; 4,5; 5,0; 5,5; 6,0; 6,5 và 7,0 (100 g môi trường trong 
bình tam giác 250 ml). Sau 72 giờ nuôi tĩnh ở nhiệt độ 30 ± 20C, xác định mật độ tế bào 
của A.oryzae T6 (mục 2.2.1). 
2.3.3.5. Ảnh hưởng của nhiệt độ nhân giống đến sinh trưởng của A.oryzae T6 
Nuôi cấy A.oryzae T6 vào các bình chứa môi trường M5 (mục 2.1.3.4) ở các nhiệt 
độ: 20 ± 2; 25 ± 2; 30 ± 2; 35 ± 2 và 40 ± 20C (100 g môi trường trong bình tam giác 250 
ml). Sau 72 giờ xác định mật độ tế bào (mục 2.2.1). 
53 
2.3.3.6. Ảnh hưởng của độ dày khối môi trường nhân giống đến sinh trưởng của 
A.oryzae T6 
Nuôi cấy A.oryzae T6 vào trong các khay (kích thước 50 x 30 x 25 cm) chứa môi 
trường môi trường M5 (mục 2.1.3.4) được chỉnh độ dày khối môi trường theo các thang 
2,0; 3,0; 4,0; 5,0; 6,0; 7,0; 8,0 và 9,0 cm. Sau 120 giờ nuôi ở nhiệt độ 30 ± 20C, xác định 
mật độ tế bào (mục 2.2.1). 
2.3.3.7. Ảnh hưởng của thời gian nhân giống đến sinh trưởng của A.oryzae T6 
Nuôi A.oryzae T6 trong các khay với 6 cm độ dày khối môi trường M5 (mục 
2.1.3.4), pH 5,5 và độ ẩm 55%, nuôi ở nhiệt độ 30 ± 20C. Xác định mật độ tế bào (mục 
2.2.1) ở các mốc thời gian: 2; 3; 4; 5; 6; 7; 8 và 9 ngày. 
2.3.4. Một số yếu tố ảnh hưởng đến khả năng hình thành AGIs bằng A.oryzae T6 
2.3.4.1. Ảnh hưởng của nguồn cơ chất môi trường lên men đến khả năng hình 
thành AGIs bằng A.oryzae T6 
Cấy A.oryzae T6 vào các bình chứa cơ chất môi trường (100 g môi trường trong bình 
tam giác 250 ml): đỗ đen trắng lòng, đỗ đen xanh lòng, đỗ tương, đỗ xanh, cám gạo và gạo 
(mục 2.1.3.3). Sau 48 giờ lên men ở nhiệt độ 30 ± 20C, xác định hoạt tính kìm hãm α-
glucosidase của môi trường sau lên men (mục 2.2.2.1). 
2.3.4.2. Ảnh hưởng của thành phần tỷ lệ cám gạo bổ sung vào môi trường lên 
men đến khả năng hình thành AGIs bằng A.oryzae T6 
Cấy A.oryzae T6 vào các bình chứa môi trường đỗ đen xanh lòng (mục 2.1.3.3) có bổ 
sung cám gạo theo các tỷ lệ: 0 (đối chứng); 5; 10; 15; 20 và 25% (100 g môi trường trong 
bình tam giác 250 ml). Sau 48 giờ lên men ở nhiệt độ 30 ± 20C, xác định hoạt tính kìm 
hãm α-glucosidase của môi trường sau lên men (mục 2.2.2.1). 
2.3.4.3. Ảnh hưởng của thành phần K2HPO4; KCL và MgSO4 bổ sung vào môi 
trường lên men đến khả năng hình thành AGIs bằng A.oryzae T6 
Cấy A.oryzae T6 vào các bình chứa môi trường đỗ đen xanh lòng (mục 2.1.3.3) có bổ 
sung K2HPO4; KCL và MgSO4 theo các tỷ lệ trình bày ở Bảng 2.1 (100 g môi trường trong 
bình 250 ml). Sau 60 giờ lên men ở nhiệt độ 30 ± 20C, xác định hoạt tính kìm hãm α-
glucosidase của môi trường sau lên men. 
Bảng 2.1 Hàm lượng một số chất khoáng trong môi trường lên men 
54 
Nguồn 
muối 
khoáng 
Tỷ lệ g/ kg môi trường 
MT0 MT1 MT2 MT3 MT4 MT5 MT6 MT7 MT8 MT9 MT10 
K2HPO4 0 0,2 0,3 0,4 0,5 0,4 0,4 0,4 0,4 0,4 0,4 
KCL 0 0,08 0,08 0,08 0,08 0,06 0,07 0,09 0,08 0,08 0,08 
MgSO4 0 0,4 0,4 0,4 0,4 0,4 0,4 0,4 0,2 0,3 0,5 
2.3.4.4. Ảnh hưởng pH ban đầu của môi trường lên men đến khả năng hình thành 
AGIs bằng A.oryzae T6 
Cấy A.oryzae T6 vào các bình chứa môi trường đỗ đen xanh lòng (mục 2.1.3.3) được 
chỉnh pH ban đầu theo các thang pH 3,5; 4,0; 4,5; 5,0; 5,5; 6,0; 6,5; 7,0 và 7,5 (100 g môi 
trường trong bình tam giác 250 ml). Sau 60 giờ lên men ở nhiệt độ 30 ± 20C, xác định hoạt 
tính kìm hãm α-glucosidase của môi trường sau lên men (mục 2.2.2.1). 
2.3.4.5. Ảnh hưởng độ ẩm ban đầu của môi trường lên men đến khả năng hình 
thành AGIs bằng A.oryzae T6 
Cấy A.oryzae T6 vào các bình chứa môi trường đỗ đen xanh lòng (mục 2.1.3.3) được 
chỉnh độ ẩm ban đầu theo các thang 45; 50; 55; 60 và 65% (100 g môi trường trong bình 
tam giác 250 ml). Sau 60 giờ lên men ở nhiệt độ 30 ± 20C, xác định hoạt tính kìm hãm α-
glucosidase của môi trường sau lên men (mục 2.2.2.1). 
2.3.4.6. Ảnh hưởng độ đầy khối môi trường lên men đến khả năng hình thành 
AGIs bằng A.oryzae T6 
Cấy A.oryzae T6 vào trong các khay (kích thước 50 x 30 x 25 cm) chứa môi trường 
đỗ đen xanh lòng (mục 2.1.3.3) được chỉnh độ dày khối môi trường theo các thang 2,0; 3,0; 
4,0; 5,0; 6,0; 7,0; 8,0 và 9,0 cm. Sau 60 giờ lên men ở nhiệt độ 30 ± 20C, xác định hoạt tính 
kìm hãm α-glucosidase của môi trường sau lên men (mục 2.2.2.1). 
2.3.4.7. Ảnh hưởng của lượng giống ban đầu lên men đến khả năng hình thành 
AGIs bằng A.oryzae T6 
Cấy A.oryzae T6 vào các bình chứa môi trường đỗ đen xanh lòng (mục 2.1.3.3) với 
các tỷ lệ tiếp giống ban đầu: 102; 103; 104; 105; 106; 107; 108 và 109 CFU/g (100 g môi 
trường trong bình tam giác 250 ml). Sau 60 giờ lên men ở nhiệt độ 30 ± 20C, xác định hoạt 
tính kìm hãm α-glucosidase của môi trường sau lên men (mục 2.2.2.1). 
55 
2.3.4.8. Ảnh hưởng của nhiệt độ lên men đến khả năng hình thành AGIs bằng 
A.oryzae T6 
A.oryzae T6 được nuôi trong các bình chứa môi trường đỗ đen xanh lòng (mục 
2.1.3.3) ở các nhiệt độ: 25 ± 2oC, 30 ± 2oC, 35 ± 2oC, 40 ± 2oC (100 g môi trường trong 
bình tam giác 250 ml). Sau 60 giờ lên men, xác định hoạt tính kìm hãm α-glucosidase của 
môi trường sau lên men (mục 2.2.2.1). 
2.3.4.9. Sự biến động AGIs trong quá trình lên men bằng A.oryzae T6 
Cấy A.oryzae T6 vào trong các khay (kích thước 50 x 30 x 25 cm) chứa môi trường 
có tỷ lệ khối lượng đỗ đen xanh lòng : cám gạo : K2HPO4 : KCL : MgSO4 tương ứng: 900 : 
100 : 0,4 : 0,08 : 0,4; độ ẩm ban đầu là 55%; pH ban đầu là 5,5; tỷ lệ tiếp giống A.oryzae 
T6 là 106 CFU/g; độ dày khối môi trường là 6 cm, lên men ở nhiệt độ 30 ± 20C. Xác định 
hoạt tính kìm hãm α-glucosidase của các môi trường sau lên men (mục 2.2.2.1) ở các mốc 
thời gian: 24; 26; 28; 30; 32; 34; 36; 38; 40; 42; 44; 46; 48; 50; 52; 54; 56; 58; 60; 62; 64; 
66; 68 và 70 giờ. 
2.3.5. Chiết xuất AGIs từ đỗ đen lên men bằng sử dụng sóng siêu âm 
2.3.5.1. Ảnh hưởng của dung môi đến khả năng chiết xuất AGIs từ đỗ đen lên 
men 
Mỗi mẫu 2,857 kg bột đỗ đen lên men (cỡ hạt 0,8 mm, độ ẩm 5%) (mục 2.1.3.5), 
chiết xuất với dung môi ở tỷ lệ dung môi : bột đỗ đen lên men là 6 lít / kg, được khảo sát 
xác định dung môi chiết xuất AGIs từ đỗ đen lên men, gồm: dung môi chiết xuất là ethanol 
96%, methanol 96%, isopropyl alcohol 96% và nước cất. Chiết xuất cùng điều kiện là ở 
nhiệt độ 600C, siêu âm cường độ 8W/cm2 ở tần số 20 kHz bể / siêu âm dung tích 20 lít, 
chiết xuất 6 phút. Dịch chiết được xác định hoạt tính kìm hãm α-glucosidase (mục 2.2.2). 
2.3.5.2. Ảnh hưởng của nồng độ ethanol đến khả năng chiết xuất AGIs từ đỗ đen 
lên men 
Mỗi mẫu 2,857 kg bột đỗ đen lên men (cỡ hạt 0,8 mm, độ ẩm 5%) (mục 2.1.3.5) 
được khảo sát xác định theo nồng độ dung môi ethanol chiết xuất AGIs từ đỗ đen lên men, 
gồm: 96, 80, 70, 60, 50, 40, 30 và 20% ethanol. Chiết xuất cùng điều kiện tỷ lệ dung môi : 
bột đỗ đen lên men là 6 lít / kg, ở nhiệt độ 600C, siêu âm cường độ 8W/cm2 ở tần số 20 
kHz / bể siêu âm dung tích 20 lít, chiết xuất 6 phút. Dịch chiết được xác định hoạt tính kìm 
hãm α-glucosidase (mục 2.2.2). 
56 
2.3.5.3. Ảnh hưởng của tỷ lệ dung môi ethanol và đỗ đen lên men đến khả năng 
chiết xuất AGIs 
Mỗi mẫu khảo sát xác định tỷ lệ dung môi ethanol với đỗ đen lên men đến khả năng 
chiết xuất AGIs có tỷ lệ dung môi 50% ethanol : lượng bột đỗ đen lên men (mục 2.1.3.5) 
với tỷ lệ 3; 4; 5; 6; 7; 8; 9 và 10 lít / kg. Chiết xuất cùng điều kiện ở nhiệt độ 600C, siêu âm 
cường độ 8W/cm2 ở tần số 20 kHz / bể siêu âm dung tích 20 lít, chiết xuất 6 phút. Lấy mẫu 
phân tích ở các thí nghiệm khảo sát với lượng mẫu tương ứng cùng lượng bột đỗ đen lên 
men là 100 g, mẫu đem lọc thu dịch chiết và xác định hoạt tính kìm hãm α-glucosidase 
(mục 2.2.2), chỉ khác các mẫu phân tích sau khi cô chân không thu cao khô, đều được hòa 
tan trong nước cất đạt cùng thể tích (600 ml). 
2.3.5.4. Nghiên cứu ảnh hưởng của nhiệt độ đến khả năng chiết xuất AGIs từ đỗ 
đen lên men: 
Mỗi mẫu 2,857 kg bột đỗ đen lên men (mục 2.1.3.5), được khảo sát xác định chiết 
xuất ở các nhiệt độ, gồm: 30 ± 2; 50 ± 2; 60 ± 2; 70 ± 2; 80 ± 2 và 90 ± 20C. Chiết xuất 
cùng điều kiện: Dung môi 50% ethanol : bột đỗ đen lên men là 6 lít / kg, siêu âm cường độ 
8W/cm2 ở tần số 20 kHz / bể siêu âm dung tích 20 lít, chiết xuất 6 phút. Dịch chiết thô 
được xác định hoạt tính kìm hãm α-glucosidase (mục 2.2.2.). 
2.3.5.5. Ảnh hưởng của thời gian và cường độ sóng siêu âm đến khả năng chiết 
xuất AGIs từ đỗ đen lên men 
Mỗi mẫu 2,857 kg bột đỗ đen lên men (mục 2.1.3.5), được khảo sát xác định chiết 
xuất ở các thời gian và cường độ siêu âm khác nhau: 0 (không siêu âm), 1, 2, 4, 6 và 8 
W/cm2, thời gian siêu âm chiết xuất là 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18 và 20 phút. Chiết xuất 
cùng điều kiện: Dung môi 50% ethanol : bột đỗ đen lên men là 6 lít / kg, tần số siêu âm 
20kHz, bể siêu âm dung tích 20 lít. Dịch chiết thô được xác định hoạt tính kìm hãm α-
glucosidase (%) (mục 2.2.2.2.) và hoạt lực kìm hãm α-glucosidase ( IC50 ) của chất hòa tan 
trong dịch chiết (mục 2.2.2.4). 
2.3.6. Tinh sạch và định lượng AGIs từ đỗ đen lên men 
2.3.6.1. Khảo sát dung môi cho tinh sạch sơ bộ AGIs 
Mỗi mẫu 2,28 gam chế phẩm AGIs (chiết xuất từ 100 gam đỗ đen lên men bề mặt) 
hòa tan trong 100 ml nước cất, sau đó kết tủa từng mẫu trong 900 ml: (ethanol, methanol 
và isopropyl alcohol), để ở nhiệt độ 250C, sau 24 giờ đem ly tâm tách từng phần kết tủa và 
57 
dịch lọc mỗi mẫu. Sau đó đem sấy khô để loại dung môi ở từng phần của các mẫu rồi xác 
định lượng chất khô và hoạt tính kìm hãm α-glucosidase (mục 2.2.2) 
2.3.6.2. Khảo sát nồng độ ethanol cho tinh sạch sơ bộ AGIs 
Mỗi mẫu 2,28 gam chế phẩm AGIs hòa tan trong 100 ml nước cất, sau đó kết tủa 
từng mẫu trong 900 ml ethanol 70, 75, 80, 85, 90 và 95%, để ở nhiệt độ 250C sau 24 giờ 
đem ly tâm tách từng phần kết tủa và dịch lọc mỗi mẫu. Sau đó đem sấy khô để loại dung 
môi ở từng phần của các mẫu rồi xác định lượng chất khô và hoạt tính kìm hãm α-
glucosidase (mục 2.2.2). 
2.3.6.3. Thu nhận AGIs [124] 
Sử dụng các enzyme thủy phân để xác định bản chất của AGIs từ đỗ đen lên men sau 
khi tinh sạch sơ bộ bằng ethanol 90% có phải là peptide hay không. 0,32 gam bột chế 
phẩm AGIs tinh sạch sơ bộ bằng ethanol 90% hòa tan trong 100 ml nước cất, sau đó xác 
định AGIs có phải là peptide theo phương pháp của Min-Gu-Kang và cộng sự, năm 2013 
[124] là xử lý bằng các enzyme thủy phân (1%) lần lượt với pepsin, trypsin, pancreatin, α- 
amylase, α-glucosidase, sau các phản ứng với các enzyme thủy phân được vô hoạt enzyme 
ở nhiệt độ 1000C trong 10 phút, loại bỏ kết tủa, rồi thu dịch lọc bằng ly tâm tốc độ 10000 
rpm, 25 phút ở nhiệt độ 40C. Dịch lọc thu được thêm nước cất đạt 100 ml, đem xác định 
hoạt tính kìm hãm α-glucosidase (mục 2.2.2). 
2.3.6.4. Tinh sạch AGIs bằng RP - HPLC [124] 
Sau khi, chế phẩm AGIs tinh sạch sơ bộ bằng ethanol 90% và xử lý bằng 1% pepsin 
(mục 2.3.6.3) tiến hành tách phân đoạn bằng RP - HPLC (cột C18 5 mm, 4,6 x 250 mm). 
Đầu tiên cột được cân bằng với acetonitrile. AGIs sẽ được rửa giải bằng phương pháp 
gradient với dải nồng độ từ 0% đến 50% acetonitrile (v/v) trong đệm 0,1 TFA với tốc độ 
dòng là 0,8 ml/phút. AGIs được phân tích bằng cách xác định khả năng hấp thụ tại bước 
sóng 280 nm. Thể tích mỗi phân đoạn thu được là 1ml. Các phân đoạn sau khi xác định có 
hoạt tính kìm hãm α-glucosidase sẽ được làm đông khô tạo chế phẩm AGIs tinh sạch. Sau 
đó, chế phẩm được kiểm tra độ tinh sạch bằng cách phân tích định lượng trên hệ thống RP 
- HPLC. 
- Chuẩn bị đệm Phosphate: Potassium phosphate được cân chính xác khoảng 6,8 gam 
và bổ sung nước cất đến 1000 ml. 
58 
- Chuẩn bị pha động: Pha động đã được chuẩn bị bằng cách trộn 50 thể tích 
acetonitrile và 50 thể tích 0,05 M phosphate buffer cùng với 0,1% TFA. Dung dịch cho pha 
động được lọc khí bằng siêu âm, lọc qua màng lọc 0,45mm và khử khí. 
- Tiến hành phân tích: Đưa dịch mẫu sau khi được sử lý sơ bộ bằng ethanol và 
pepsin lên cột bằng kim tiêm tự động với tốc độ 0,5 ml/phút. Chạy chương trình gradient 
với dải nồng độ từ 0% đến 50% của dung dịch pha động với tốc độ 0,8 ml/phút. Sử dụng 
bộ phận thu mẫu tự động để thu các phân đoạn với thể tích là 1ml/phân đoạn. Các phân 
đoạn thu được sẽ đem đánh giá lại hoạt tính. Các phân đoạn có hoạt tính sẽ được đem 
đông khô và kiểm tra lại độ tinh sạch bằng RP - HPLC, xác định được hoạt tính của 
AGIs. 
2.3.6.5. Xác định khối lượng phân tử và trình tự amino acid của AGIs bằng khối 
phổ 
Xác đinh được khối lượng phân tử và trình tự amino acid của AGIs. Mẫu chế phẩm 
AGIs tinh sạch, xử lý xử lý mẫu bằng trypsin, chiết xuất được peptide và phân tích bằng 
thiết bị MALDI-TOF/TOF mass spectrometer theo phương pháp của Bringans và cộng 
sự năm 2008 [49]. Phổ AGIs được phân tích bằng phần mềm Mascot và dữ liệu ngân 
hàng Ludwig NR hoặc SwissPro. (Phân tích mẫu được thực hiện bởi Proteomics 
International Pty Ltd. Địa chỉ: Box 3008, Broadway, Nedlands, Western Australia 6009) 
(Phụ luc KQ KP). 
2.3.6.6. Định lượng peptide AGIs bằng RP - HPLC [72] 
Peptide AGIs sau khi tinh sạch bằng RP - HPLC (xem mục 2.3.6.4) có được sản 
phẩm peptide AGIs tinh sạch dưới dạng đông khô, dùng peptide AGIs này làm chất chuẩn, 
tiến hành sắc ký, dựng đường chuẩn peptide AGIs và thông qua diện tích của các píc sắc 
ký đồ chạy RP - HPLC tương ứng với các nồng độ khác nhau của sản phẩm AGIs, tính 
được hàm lượng peptide AGIs. 
- Chuẩn bị đệm Phosphate và chuẩn bị pha động (xem mục 2.3.6.4) 
- Chuẩn bị dung dịch chuẩn: Dung dịch chuẩn được chuẩn bị bằng cách cân chính 
xác 125 mg AGIs đã được phân tích khối phổ và hòa tan trong 5 ml pha động. 
- Tiến hành phân tích: Đưa mẫu dung dịch chuẩn lên cột bằng kim tiêm tự động ở 
các thể tích khác nhau 10, 20, 30, 40, 50 µl tốc độ 0,5 ml/phút. Chạy chương trình gradient 
(xem mục 2.3.6.4). Sau khi tạo được đường chuẩn độ của AGIs dựa vào diện tích píc của 
59 
từng nồng độ. Đưa mẫu dịch sau khi được sử lý sơ bộ bằng ethanol và pepsin lên cột bằng 
kim tiêm tự động với tốc độ 0,5 ml/phút. 
Có được đường chuẩn peptide AGIs, xác định được diện tích píc của sản phẩm 
peptide AGIs trong dịch lên men. Từ đây suy ra được nồng độ peptide AGIs cần tìm trong 
dịch chiết đỗ đen lên men. 
2.3.7. Ứng dụng AGIs 
2.3.7.1. Ảnh hưởng của nhiệt độ cô, sấy tạo chế phẩm đến chất lượng chế phẩm 
AGIs 
Mỗi mẫu 1 lít dịch từ dịch chiết của đỗ đen lên men (chiết xuất ở điều kiện: nhiệt độ 
600C/ 10 phút siêu âm 20kHz với cường độ 8 W/cm2, chiết xuất ở tỷ lệ ethanol 50% / bột 
đỗ đen lên men (hạt bột Φ 0,8 mm) là 6 lít / kg,) được khảo sát xác định cô sấy ở các nhiệt 
độ khác nhau: 50 ± 2; 60 ± 2; 70 ± 2; 80 ± 2; 90 ± 2 và 100 ± 20C. Cô sấy cùng điều kiện - 
0,8 atm, cao cô sấy khô đến độ ẩm 3,5%, được nghiền tạo chế phẩm AGIs, chế phẩm AGIs 
thu được đem xác định hoạt tính kìm hãm α-glucosidase (mục 2.2.2) và cảm quan chế 
phẩm AGIs tạo ra. 
2.3.7.2. Đánh giá chỉ tiêu chất lượng, cảm quan và an toàn thực phẩm của chế 
phẩm AGIs 
Từ 5 kg chế phẩm AGIs tạo ra, lấy mẫu để phân tích: 
- Các chỉ tiêu hoạt tính kìm hãm α-glucosidase, độ ẩm, hàm lượng proterin, lipit, tro 
tổng số, cảm quan, an toàn thực phẩm về kim loại nặng, vi sinh vật, aflatoxin dược xác 
định theo phương pháp xem mục 2.2.3; mục 2.2.4 và mục 2.2.6. 
- Thử độc tính cấp chế phẩm theo phương pháp của Đỗ Trung Đàm, 1996 [4]: Chuột 
nhắt trắng thực nghiệm được nuôi ổn định trong điều kiện phòng thí nghiệm 5 ngày trước 
khi thí nghiệm để chuột thích nghi điều kiện thí nghiệm. Chuột đạt yêu cầu về cân nặng 20 
± 2 g sẽ được đưa vào thí nghiệm. Đường dùng thuốc: đường uống, cho chuột uống bằng 
cách dùng bơm tiêm có kim đầu tù để đưa thuốc một cách nhẹ nhàng vào dạ dầy chuột. 
Tiến hành thử nghiệm trên các lô chuột (mỗi lô 10 con) theo mức liều 0,25ml dịch 
chiết/ 10g chuột/ 1 lần. Khoảng cách giữa hai lần uống liên tiếp là 2 giờ. Chuột được để 
nhịn đói 15 giờ trước khi tiến hành thí nghiệm, cho uống nước theo nhu cầu. Theo dõi 
chuột liên tục trong vòng 6 giờ, tỉ lệ chết trong 72 giờ và các dấu hiệu khác trong vòng 7 
ngày sau khi dùng chế phẩm thử. 
60 
Các chỉ tiêu theo dõi bao gồm: Tình trạng chung của chuột: hoạt động tự nhiên, tư 
thế, màu sắc (mũi, tai, đuôi), lông, phân, nước tiểu; Tỉ lệ chuột chết trong 72 giờ và các 
dấu hiệu khác trong vòng 7 ngày sau khi thử nghiệm; Xác định LD50 (nếu có) theo 
phương pháp Litchfield – Wilcoxon. 
Tìm liều tối đa mà không có chuột nào của lô thí nghiệm chết (LD0) và liều tối thiểu 
để 100% chuột của lô thí nghiệm chết (LD100). Thử thêm 3-4 liều trung gian giữa 2 liều nói 
trên để xác định LD50. 
Thời gian theo dõi: Chuột được để ở phòng thí nghiệm có khí hậu đảm bảo để mọi 
hoạt động của chuột bình thường. Theo dõi và quan sát các biểu hiện về hành vi, hoạt 
động, ăn uống, bài tiết của chuột và số chuột sống chết trong 3 ngày. 
2.3.7.3. Thử nghiệm ứng dụng chế phẩm AGIs để tạo bột uống liền AGIs 
Tiến hành thử nghiệm: Người thử: Số lượng 12 người. Tiêu chí lựa chọn người thử: 
Là người 18 - 45 tuổi. Không có bệnh về giác quan. Có tinh thần hợp tác. Không ăn các 
sản phẩm có vị mạnh, không hút thuốc trước khi tiến hành thí nghiệm 2 giờ. Không sử 
dụng các mỹ phẩm (son môi, nước hoa, xà phòng thơm) ngay trước khi làm thí nghiệm. 
Đến phòng thí nghiệm đúng giờ. 
- Phép thử: Phép thử thị hiếu cho điểm thang 9 điểm thị hiếu. Mỗi công thức tạo bột 
uống liền được khảo sát có lượng mẫu là 100 túi/liều x 300 mg/túi, tiến hành trên 5 sản 
phẩm bột uống liền có thức T1, T2, T3, T4 và T5 (Bảng 2.2). 
Bảng 2.2 Tỷ lệ phối trộn các thành phần tạo ra sản phẩm bột uống liền 
Công 
thức 
Thành phần 
Tỉ lệ 
% mg/túi 300 mg 
T1 
Stevioside 0,5 1,5 
Chế phẩm AGIs 50,0 150,0 
Lactose 49,5 148,5 
T2 
Stevioside 1,0 3,0 
Chế phẩm AGIs 50,0 150,0 
Lactose 49,0 147,0 
T3 
Stevioside 1,5 4,5 
Chế phẩm AGIs 50,0 150,0 
Lactose 48,5 145,5 
T4 
Stevioside 2,0 6,0 
Chế phẩm AGIs 50,0 150,0 
Lactose 48,0 144,0 
T5 Stevioside 2,5 7,5 
61 
Chế phẩm AGIs 50,0 150,0 
Lactose 47, 5 142,5 
- Mẫu được chuẩn bị ở khu vực riêng với khu vực tiến hành cảm quan, ngoài tầm 
quan sát của người thử. Tất cả các mẫu chuẩn bị phải giống nhau (cùng dụng cụ, cùng 
lượng sản phẩm, cùng dạng vật chứa). Bột uống liền AGIs sẽ được pha với nước cất ở 
nhiệt độ 900C, tỉ lệ 1 gói bột uống liền AGIs (300 mg) / 100 ml nước. Mẫu sẽ được giữ ở 
nhiệt độ 500C và đem ra cho người thử ở điều kiện nhiệt độ thí nghiệm. 
- Cách thức trình bày mẫu: Mẫu được mã hóa bằng 3 chữ số ngẫu nhiên, thứ tự sắp 
xếp mẫu tuân theo hình vuông Williams (Bảng 2.3) [13]. 
Bảng 2.3 Mười trật tự trình bày mẫu tuân theo nguyên tắc hình vuông Williams tương ứng với 5 
mẫu khảo sát 
STT Lần 1 Lần 2 Lần 3 Lần 4 Lần 5 STT Lần 1 Lần 2 Lần 3 Lần 4 Lần 5 
1 A B E C D 6 D C E B A 
2 B C A D E 7 E D A C B 
3 C D B E A 8 A E B D C 
4 D E C A B 9 B A C E D 
5 E A D B C 10 C B D A E 
Với A: là T3; B: là T4; C: là T1; D: là T5 và E: là T2 
- Điều kiện thí nghiệm: Phép thử được tiến h