Luận án Nghiên cứu tổng hợp vật liệu polyme trên cơ sở Polyvinyl Ancol (PVA) biến tính với tinh bột, ứng dụng làm màng sinh học trong xử lý và điều trị vết thương

ia X
Phổ nhiễu xạ tia X (X-ray) được thực hiện trên thiết bị Bruker D 5005 (Đức).
2.3.4 Phương pháp phân tích nhiệt DSC và TGA
Tính chất nhiệt của polyme được xác định trên thiết bị Perkin Elmer-Moldel Pyris
Sapphire (Nhật). Mẫu đựng trong chén plantin, được gia nhiệt với tốc độ tăng nhiệt
10oC/phút, trong môi trường khí nitơ từ nhiệt độ 200C lên 500oC. Trước khi tiến hành phân
tích mẫu được sấy chân không ở 600C trong 10 giờ.
2.3.5 Phương pháp kính hiển vi điện tử quét SEM
Xác định cấu trúc bề mặt của mẫu bằng cách chụp trên kính hiển vi điện tử quét
(SEM) JEOL JMS 6360LV của Nhật Bản.
50
Cách tiến hành: Mẫu được cắt trên máy Microtom, sau đó phủ lớp dẫn điện Ag trên
máy Agar Auto Sputter Coater trước khi chụp.
2.3.6 Xác định khối lượng phân tử của polyme
Để xác định khối lượng phân tử của các loại PVA ban đầu có thể thực hiện bằng
nhiều phương pháp khác nhau dựa vào sự phụ thuộc của một đặc trưng vật lý nào đó của
hợp chất polyme với khối lượng phân tử khối của nó. Các đặc trưng đó có thể là áp suất
thẩm thấu, độ phân tán ánh sáng, độ nhớt, độ giảm nhiệt độ đông đặc, độ tăng nhiệt độ
sôi... Phương pháp đo độ nhớt là phương pháp đơn giản về mặt thực nghiệm, đồng thời cho
phép đánh giá phân tử khối trong khoảng tương đối rộng (M = 104 106) tuy phương pháp
này không hoàn toàn chính xác. Bằng cách xác định thời gian chảy của dung dịch PVA( có
nồng độ từ 0.1 đến 1.0 g/dl) trong chloroform ở 25oC với nhớt kế Ostwald hay Ubbelohde.
Các dung dịch đo được pha theo tỷ lệ 0.1 -1.0% và mỗi phép đo được lập lại 5 lần rồi lấy
kết quả trung bình. Các giá trị thu được sẽ được sử dụng để xác định độ nhớt đặc trưng []
từ đây ta có thể xác định khối lượng phân tử trung bình của polyme qua phương trình
Mark-Houwink [32]:
[] = k.M 
Trong đó k và là các hằng số đặc trưng cho tầng hệ và được xác định bằng các phương
pháp chuẩn khác. Trong đó khối lượng phân tử trung bình trọng lượng Mw của PVA có
các hằng số k= 73,1 x 10-5 và α = 0,616.
2.4 CÁC PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU TÍNH CHẤT CƠ LÝ CỦA POLYME
2.4.1 Phương pháp đo độ bền kéo đứt của màng
Độ bền kéo được xác định theo tiêu chuẩn ASTM D882 đo trên máy LLOYD
INSTRUMENT 5kN của Anh, tốc độ kéo 20mm/phút, nhiệt độ 250C độ ẩm 75%. Tất cả các
mẫu đo có kích thước theo tiêu chuẩn hình mái chèo, chú ý chọn những mẫu đều đặn - không
khuyết tật. Mỗi mẫu tiến hành thực hiện 3 phép đo. Kết quả lấy giá trị trung bình của ba
phép đo. Mẫu đo độ bền kéo đứt có dạng như hình vẽ:
Mẫu đo độ bền kéo đứt
Độ bền kéo được tính theo công thức sau:
K = F/A [MPa]
Trong đó: F là lực tác dụng [N]
51
A là tiết diện ngang của mẫu [mm2]
2.4.2 Phương pháp xác định độ bền kháng thủng của màng
Độ bền kháng thủng xác định theo tiêu chuẩn ASTM D4833-00 trên máy LLOYD
INSTRUMENT 5kN của Anh, đường kính trụ chọc thủng màng là 8mm.
2.4.3 Phương pháp xác định hàm lượng phần gel
Hàm lượng phần gel của màng PVA biến tính tinh bột đã khâu mạch được xác định bằng
phương pháp trích ly trong bộ Soxhlet bằng etanol 96%, trong 16 giờ. Phần gel là phần tạo
thành mạng lưới không gian không bị trích ly bởi etanol trong dụng cụ Soxhlet với thời
gian 15 – 20 giờ.
+ Quá trình xác định : Giấy lọc trước khi cân phải trích ly bằng etanol trên dụng cụ Soxhlet
koảng 3 giờ. Sau đó sấy khô tới khối lượng không đổi và để trong bình hút ẩm. Cân khối
lượng giấy lọc (c) , khối lượng mẫu và giấy lọc (b) trên cân phân tích trước khi trích ly
trong etanol. Sau đó cho vào dụng cụ Soxhlet để trích ly với thời gian 16 giờ. Khi đã đạt
thời gian trích ly, lấy ra và sấy khô đến khối lượng không đổi và để vào bình hút ẩm. Cân
xác định khối lượng mẫu sau khi trích ly (a).
Hàm lượng phần gel được tính :
Trong đó : a – khối lượng mẫu sau khi trích ly bao gồm cả giấy lọc [g]
b – khối lượng mẫu trước khi trích ly bao gồm cả giấy lọc [g]
c - khối lượng giấy lọc [g]
2.4.4 Phương pháp xác định độ hút ẩm của vật liệu
Các mẫu có hình chữ nhật có kích thước 1x12 cm với độ dày 1mm được sấy khô
tới khối lượng không đổi, để nguội trong bình hút ẩm trong khoảng 8 giờ. Sau đó cân khối
lượng chính xác đến 0,1 mg bằng cân phân tích. Sau đó đặt mẫu trong môi trường hơi bão
hòa dung dịch KNO3 ở nhiệt độ phòng 25oC. Nhiệt độ trong 20 ngày khảo sát có thay đổi
chút ít, nhưng không ảnh hưởng đáng kể đến độ ẩm của môi trường khảo sát. Sau từng
khoảng thời gian xác định lấy mẫu ra, cân lại chính xác khối lượng bằng cân phân tích. Độ
hút ẩm được xác định theo công thức sau:
Th = 100
1
12 m
mm [%]
Trong đó Th: độ hút ẩm của vật liệu , [%].
m1: khối lượng mẫu ban đầu, [g]
52
m2: khối lượng mẫu tại thời điểm xác định sau 1 khoảng
thời gian xác định, [g].
2.5 CÁC PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU CẤU TRÚC, TÍNH CHẤT POLYME
2.5.1 Phương pháp xác định độ trương
Độ trương của màng PVA/TB được xác định theo TCVN 2752-78. Để thử độ trương nở
của cao su và chất dẻo dùng phương pháp khối lượng, phương pháp thể tích thủy tĩnh và
thể tích tỷ trọng.
+ Phương pháp khối lượng
Độ trương nở của màng PVA/TB trong chất lỏng, dung môi sử dụng là nước cất. Mẫu
màng có kích thước 20x20x2mm được ngâm trực tiếp trong nước và lấy ra xác định độ
tăng khối lượng. Mẫu sau khi trương được làm khô ở 37oC, trong chân không đến khối
lượng không đổi . Độ trương cân bằng được tính theo công thức:
Độ trương = 100
1
12 m
mm [%]
Trong đó: m1: khối lượng mẫu sau khi làm khô [g].
m2: khối lượng của mẫu sau khi ngâm trong dung dịch[g].
2.5.2 Phương pháp xác định mật độ khâu mạch, khối lượng phân tử trung bình giữa
hai nút lưới và kích thước lưới
Thông số cơ bản để mô tả cấu trúc của PVA khâu mạch với tinh bột tạo mạng lưới
là mật độ khâu mạch, khối lượng phân tử trung bình giữa các nút mạng và kích thước lưới.
2.5.2.1 Xác định mật độ khâu mạng và khối lượng phân tử giữa các nút mạng theo
phương pháp ngâm trương nở bão hòa
Các mẫu màng có kích thước 20x20x2mm được ngâm trong nước, sau những
khoảng thời gian nhất định lấy mẫu ra lau bằng vải bông sạch, sấy ở nhiệt độ 50oC đến
khối lượng không đổi. Mật độ khâu mạng (n) được xác định theo công thức Flory
Rehner[52]:
-[ln(1 - ʋ2) + ʋ2 + χ1. ʋ22] = ʋ1.n. (ʋ21/3 - ʋ2/2)
Trong đó χ1 là hệ số tương tác của màng polyme với dung môi nước (χ1=0,49); ʋ1 là
thể tích mol riêng phần của màng polyme với dung môi nước (18,1cm3/mol) ; ʋ2 = Vo/ Vbh
(với Vo là thể tích ban đầu của mẫu màng polyme, Vbh là thể tích của mẫu màng polyme
ngâm bão hòa trong nước; n là mật độ mạng (mol/cm3). Khối lượng phân tử trung bình
giữa các nút mạng (Mc) được xác định theo công thức [52]:
Mc = ρ / (2.n)
Trong đó: ρ là khối lượng riêng của polyme lưới (g/cm3).
53
Khối lượng trung bình giữa hai nút lưới Mc còn được tính theo phương trình cân bằng của
Peppas vàMerrill liên quan đến mật độ khâu mạch [52].
Trong đó Mn: khối lượng phân tử trung bình số của PVA biến tính tinh bột
υ: thể tích riêng của PVA(0,788cm3/mol); V1: thể tích mol của nước(=18,1cm3/mol)
υ2m: phần thể tích polyme biến tính ở trạng thái trương
χ: hệ số tương tác giữa PVA và nước = 0,494
υr: phần thể tích polyme trong gel ở trạng thái tự do
υ2m = Vpol (khô)/Vpol (tự do) ; Φ = 3
Hệ số tương tác giữa PVA biến tính khâu mạng và nước χ = 0,504 – 0,527.
Khối lượng phân trung bình số của một mạch giữa các liên kết có thể được tính từ phép đo
cơ lý. Vì vậy, so sánh giá trị thực nghiệm, giá trị Mc được tính chính xác hơn từ modun
đàn hồi hoặc số liệu độ trương theo công thức:
Trong đó: ρ2 là tỷ trọng của polyme lưới và (υe/Vo ) là mức độ tạo lưới hiệu quả.
2.5.2.2 Xác định kích thước các mắt lưới (ξ)
Từ giá trị Mc có thể tính kích thước lưới theo công thức [52]:
trong đó: Cn: tỷ lệ số đặc trưng Flory =8,3 cho PVA biến tính;
Mr : Khối lượng phân tử trung bình trên 1 đơn vị lặp lại của [-CH2-CHOH-] = 44; 1 đơn vị
lặp của tinh bột = 144; l= chiều dài liên kết C-C là = 1,54Ao
2.5.3 Cách xác định tỷ trọng của polyme lưới
Tỷ trọng của polyme lưới được xác định theo tiêu chuẩn ISO 1183-1:2004, được tính theo
công thức:
ρg = (Wa . ρh )/ (Wa – Wh)
Trong đó: Wa: khối lượng của mẫu trong không khí, g.
Wh: khối lượng của mẫu trong chất lỏng (n-heptan).
54
ρh: tỷ trọng của chất lỏng (ρh của n-heptan = 0,684).
ρg: tỷ trọng của polyme lưới
2.5.4 Phương pháp xác định hệ số khuếch tán axit salicylic
- Khuếch tán là sự chuyển động của các tiểu thể (phân tử, ion..) của chất phân tán từ nơi có
nồng độ cao đến nơi có nồng độ thấp hơn cho đến lúc cân bằng nồng độ.Thẩm thấu là hiện
tượng khuếch tán mà trên đường di chuyển các phân tử của vật chất đang khuếch tán gặp
phải một màng ngăn.
Sơ đồ màng ngăn sử dụng đo hệ số khuếch tán [88] như sau:
Hình 2.2 Sơ đồ màng ngăn sử dụng đo hệ số khuếch tán axit salixylic (SA)
Trong ngăn có 2 khoang ngăn cách bởi màng PVA/TB dày 0,2 mm. Màng PVA/TB
được ngâm trong nước 2 giờ trước khi thí nghiệm. Ở khoang đầu tiên chứa 10ml dung dịch
SA(8mg/10ml), ở khoang thứ hai chứa 100ml nước cất. Sau đó, khoang thứ nhất hạ xuống
sao cho màng polyme chạm đúng chất lỏng khoang thứ hai. Hệ thống được đặt trong một
chậu nước có nhiệt độ không đổi (30oC). Một pipet được dùng để lấy mẫu hút 0,5ml dung
dịch từ khoang thứ nhất và 1ml mẫu từ khoang thứ hai. Các mẫu thu hồi được thay thế
bằng nước cất.
Sau đó, mẫu được đưa đi phân tích bằng máy quang phổ hấp thụ Cintra 40 UV-
Visible Spectrometer GBC (Canada) tại Viện Hóa Học- VKHCNVN (18-Hoàng Quốc
Việt) ở bước sóng 294nm để xác định nồng độ SA trong các khoang.
Hệ số khuếch tán (D) được tính toán từ các kết quả này. Trong khoảng tốc độ
khuấy, giá trị nồng độ trong hai khoang có thể sử dụng để tính hệ số khuếch tán theo
phương trình cân bằng sau[88]:
Với :
Màng PVA/TB Khoang 1 chứa dung dịch
khuếch tán axit salicylic (SA)
Dung dịch axit salicylic
(nồng độ C(mg/ml)
Môi trường hòa tan
Khoang 2 hấp thụ
55
Trong đó: CD(0) : nồng độ ban đầu của dung dịch trong khoang thứ nhất.
CR(0) : nồng độ ban đầu của dung dịch trong khoang thứ hai.
CD(t) : nồng độ của dung dịch trong khoang thứ nhất sau khoảng thời gian t.
CR(t) : nồng độ của dung dịch trong khoang thứ hai sau khoảng thời gian t.
AH : diện tích cắt ngang khuếch tán hiệu quả của màng PVA/TB.
WH : Bề rộng của màng
V1 : Thể tích của dung dịch trong khoang thứ nhất.
V2 : Thể tích của dung dịch trong khoang thứ hai.
2.5.5 Độ thẩm thấu hơi nước của màng PVA/TB
Độ thấm thấu hơi nước được xác định theo tiêu chuẩn ASTM E96.
2.6 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU SỰ THỦY PHÂN IN VITRO
2.6.1 Chuẩn bị mẫu
Để nghiên cứu sự phân hủy thủy phân, các mẫu màng đã được chuẩn bị như sau: tiến
hành tổng hợp PVA/TB trong dung dịch có nồng độ 0.16g/ml. Sau đó tạo màng bằng cách
đổ dung dịch đã pha lên đĩa thủy tinh rồi đem đi sấy ở 60oC ở điều kiện chân không
(~120mmHg). Sau khoảng 5 giờ sau khi sấy nước đã bay hết màng PVA/TB hình thành
trên đĩa được bóc tách và đem đi sấy khô ở 60oC trong chân không sau 24h trước khi tiến
hành nghiên cứu sự phân hủy thủy phân trong in vivo. Đĩa có đường kính là 20mm, mỗi
màng tạo thành có khối lượng xấp xỉ 0.5g.
2.6.2 Sự phân hủy thủy phân của vật liệu trong in vitro
Các mẫu chính cho nghiên cứu phân hủy thủy phân chuẩn bị trước được ngâm trong
dung dịch muối đệm pH=7,4 tại 37oC. Thành phần dung dịch muối đệm bao gồm: 9 g
NaCl; 10,73g Na2HPO4x7H2O; 2,12 g NaH2PO4 được pha trong 1 lít nước cất, pH của
dung dịch đệm được điều chỉnh tới 7,4 bằng cách thêm NaOH. Các mẫu thí nghiệm được
thực hiện trong 10ml dung dịch muối đệm. Để ngăn chặn sự phát triển của vi khuẩn, 1 ml
của dung dịch NaN3 nồng độ 0,04 % đã được thêm vào. Các mẫu được lắc đều nhẹ nhàng
trên máy lắc ngang trong suốt thời gian phân hủy. Sau các khoảng thời gian nhất định là 1,
2, 5, 7 tuần các mẫu được lấy ra phân tích. Để phân tích xác định các sản phẩm phân hủy, 2
ml dung dịch muối đệm đã đặt mẫu được lấy ra phân tích trên thiết bị GC để xác định
thành phần phân hủy. Màng polyme còn lại được rửa bằng nước cất và sấy khô trước khi
phân tích các thông số khác.
2.6.3 Phương pháp phân tích sắc ký khí
Phương pháp sắc ký khí (GC) được sử dụng để phân tích định lượng các sản phẩm
tạo thành từ quá trình phân hủy của màng PVA/TB trong invtro. Các mẫu được phân tích
56
trên thiết bị GC với cột BD-5MS kích thước 30m x 0,25mm; Heli được sử dụng làm chất
mang. Tất cả các mẫu được phân tích theo cùng một chương trình nhiệt của cột, nhiệt độ
được giữ ở 40oC trong vòng 10 phút và sau đó cho phép tăng từ 40oC lên 250oC với tốc độ
10oC/phút. Mẫu được bơm vào tại nhiệt độ 200oC.
2.6.4 Phương pháp xác định độ tổn hao khối lượng của vât liệu
Mẫu có dạng hình chữ nhật, kích thước 1 x 12 cm với độ dày 0,4 - 0,6cm được ngâm
trong môi trường nước hoặc chôn trong đất, hoặc ngâm trong môi trường chứa vi sinh vật
có khả năng phân huỷ. Sau những khoảng thời gian nhất định, lấy mẫu, rửa sạch, sấy chân
không ở 600C trong 24 giờ, cân mẫu trên cân phân tích để xác định tổn hao trọng lượng.
Độ tổn hao khối lượng của mẫu được tính theo công thức:
% tổn hao
khối lượng =
m1 - m2 .100
m1
m1: khối lượng mẫu ban đầu, g
m2: khối lượng mẫu sau khi lấy ra khỏi môi trường phân huỷ, g
2.7 CÁC PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU CHỈ TIÊU SINH HÓA
2.7.1 Phương pháp xác định các chỉ tiêu hàm lượng kim loại nặng
Xác định hàm lượng kim loại nặng của vật liệu bao viên theo QCVN 8-
1:2011/BYT. Các mẫu đo hàm lượng kim loại nặng bằng thiết bị hấp thụ nguyên tử
VARIAN 240F3AAS Agilent (Mỹ).
2.7.2 Phương pháp thử độ vô khuẩn
Sản phẩm sau khi được đóng gói kín, được khử trùng bằng bức xạ tia γ với liều lượng
15kGy, trong 10 giờ tại trung tâm chiếu xạ Hà Nội (Viện Năng lượng-Viện KH&CNVN),
sau đó được đem thử độ vô khuẩn theo dược điển Việt Nam, 2002.
Chuẩn bị mẫu: Các mẫu màng PVA/TB được khử trùng , sau đó được gửi đi kiểm
tra độ vô khuẩn theo dược điển Việt Nam IV (2009) tại Trung tâm Kỹ thuật Tiêu chuẩn Đo
lường Chất lượng 1 – Số 8 Đường Hoàng Quốc Việt, Cầu Giấy, Hà Nội.
2.7.2.1 Môi trường để phát hiện các vi khuẩn hiếu khí và kỵ khí
Môi trường thioglycolat có thạch:
L - Cystin
Natri clorid
Dextrose (C6H12O6.H2O)
Thạch bột (có độ ẩm nhỏ hơn 15%)
Cao nấm men (có khả năng tan trong nước)
Casein thủy phân bởi pancreatin
0,50 g
2,50 g
5,50 g
0,75 g
5,00 g
15,00 g
57
Natri thioglycolat (hoặc acid thioglycolic 0,3 ml)
Resazurin (dung dịch 0,1% mới pha)
Nước
pH sau khi tiệt khuẩn: 7,1 0,2
0,50 g
1,0 ml
1000 ml
Trộn tất cả các thành phần theo thứ tự đã ghi ở trên (trừ resazurin và natri thioglycolat)
trong cối nghiền, thêm vào một ít nước nóng, trộn kỹ, chuyển sang dụng cụ thích hợp.
Thêm số nước còn lại, đun hỗn hợp cách thuỷ sôi đến khi tạo thành dung dịch trong. Thêm
natri thioglycolat, dùng dung dịch natri hydroxyd 1N điều chỉnh sao cho môi trường sau
khi tiệt khuẩn có pH 7,1 0,2.
Đun nóng lại dung dịch (tránh đun sôi). Lọc (nếu cần) qua giấy lọc đã thấm ướt, rồi
thêm dung dịch resazurin, trộn đều. Đóng môi trường vào các ống nghiệm (hoặc bình)
thích hợp, hấp vô khuẩn ở 121°C trong 15 phút. Lấy ra làm nguội nhanh tới 25°C, tiếp tục
bảo quản ở nhiệt độ 2°C đến 25°C, tránh ánh sáng. Nếu 1/3 thể tích phía trên của ống (hoặc
bình) môi trường có màu hồng, môi trường không thích hợp để thử nghiệm. Có thể phục
hồi lại môi trường bằng cách đun cách thuỷ cho mất màu rồi làm lạnh đột ngột. Chỉ sử
dụng môi trường đã phục hồi này một lần.
Môi trường thioglycolat không có thạch
Dùng cho thử nghiệm những chế phẩm đục hoặc đặc sền sệt dạng cao.
L-Cystin
Natri clorid
Dextrose (C6H12O6.H2O)
Cao nấm men(có khả năng tan trong nước)
Casein thủy phân bởi pancreatin
Natri thioglycolat
(hoặc acid thioglycolic 0,3 ml)
Resazurin (dung dịch 0,1% mới pha)
Nước
pH sau khi tiệt khuẩn: 7,1 0,2
0,50g
2,50g
5,50g
5,00g
15,0g
0,50g
1 ml
1000 ml
Cách pha chế giống như môi trường thioglycolat có thạch.
2.7.2.2 Môi trường phát hiện vi khuẩn hiếu khí và nấm
Môi trường Soybean - casein
Casein thủy phân bởi pancreatin
Bột đậu tương thủy phân bởi papain
Natri clorid
17,0 g
3,0 g
5,0 g
58
Dikali hydrophosphat
Dextrose monohydrat
Nước
pH sau khi tiệt khuẩn: 7,3 0,2
2,5 g
2,5 g
1000 ml
Hòa tan tất cả các chất rắn trong nước, đun nóng nhẹ để cho tan hoàn toàn. Để
nguội ở nhiệt độ phòng. Dùng dung dịch natri hydroxyd 1 N để điều chỉnh (nếu cần) sao
cho pH sau khi tiệt khuẩn từ 7,1 đến 7,5. Lọc (nếu cần) để cho môi trường trong. Phân chia
vào những dụng cụ thích hợp, hấp tiệt khuẩn ở 121°C trong 15 phút.
2.7.2.3. Kiểm tra chất lượng môi trường
a) Độ vô khuẩn
Lấy ngẫu nhiên một vài ống (hoặc bình) môi trường mới sản xuất, đem ủ ở nhiệt độ
30°C đến 35°C trong 14 ngày đối với những loại môi trường dùng nuôi cấy vi khuẩn hiếu
khí và kỵ khí; ủ ở nhiệt độ 20°C đến 25°C trong 14 ngày đối với những loại môi trường
dùng nuôi cấy vi khuẩn, nấm. Các loại môi trường phải không được có vi khuẩn, nấm mốc.
Mẫu có độ vô khuẩn đạt tiêu chuẩn nếu so với mẫu chứng không phát hiện các
chủng vi khuẩn trên hay xuất hiện nấm mốc.
b) Khả năng dinh dưỡng
Cấy vào môi trường dùng để thí nghiệm khoảng 100 tế bào sống của những loại vi
khuẩn sau:
Loại hiếu khí dùngStaphylococcus aureus ATCC 6538.
Loại vi khuẩn hiếu khí có nha bào dùng Bacillus subtilis ATCC 6633.
Loại vi khuẩn kỵ khí dùng Clostridium sporogenesATCC 9404.
Loại nấm dùng Candida albicans ATCC 10231, Aspergillus niger ATCC 16404.
Mỗi loại chủng chỉ thị được cấy vào loại môi trường tương ứng, rồi mang ủ ở nhiệt
độ thích hợp cho từng loại ít nhất 3 ngày đối với vi khuẩn và ít nhất 5 ngày đối với nấm.
Trên mỗi loại môi trường, sau thời gian ủ đều phải thấy vi khuẩn mọc tốt.
2.8 PHƯƠNG PHÁP THỬ NGHIỆM TRÊN ĐỘNG VẬT
2.8.1 Kiểm tra độ kích ứng da
Mô hình nghiên cứu được thiết kế và tiến hành dựa trên hướng dẫn của OECD
(Organisation for Economic Co-operation and Development: Tổ chức Hợp tác và Phát triển
Kinh tế về việc đánh giá kích ứng da dành cho các sản phẩm dược phẩm và mỹ phẩm dùng
ngoài da.
59
2.8.1.1 Nguyên lý thử nghiệm
Thử nghiệm kích ứng trên da là một phương pháp sinh học nhằm đánh giá mức độ phản
ứng của da thỏ khi tiếp xúc với mẫu thử. Phép thử được tiến hành trên da thỏ vì thỏ là động
vật có da mỏng, tương đối nhạy cảm gần giống với da tay người.
2.8.1.2 Hóa chất, dụng cụ và trang thiết bị
- Tông đơ điện hoặc dụng cụ thích hợp để cạo sạch lông thỏ.
- Kéo, panh, bông và băng dính y tế và dụng cụ gây bỏng chuyên dụng.
- Pipet, cốc và các dụng cụ thuỷ tinh.
- Nước cất và các loại dung môi không gây kích ứng.
2.8.1.3 Động vật thí nghiệm
- Thỏ chủng Newzealand White, lông trắng, trọng lượng 1,8-2,5 kg do Trung tâm cung
cấp động vật thí nghiệm Đan Phượng – Hà Tây cung cấp.
- Thỏ được nuôi trong phòng thí nghiệm của Bộ môn Dược lý – Trường Đại học Y Hà
Nội một tuần trước khi tiến hành nghiên cứu bằng rau và cám thỏ.
2.8.1.4 Tiến hành
- Chuẩn bị động vật thí nghiệm:
Trước ngày thực hiện thử nghiệm (từ 18 đến 24 giờ), cạo sạch lông thỏ ở hai bên
sườn (sát vùng cột sống) với diện tích đủ cho thử nghiệm. Số lượng : 3 con. Ký hiệu là thỏ
1; thỏ 2; thỏ 3.
- Gây bỏng thỏ thực nghiệm :Thỏ đuợc cạo sạch lông 2 bên sống lưng với kích thuớc
vùng cạo lông khoảng 12cm mỗi chiều. Cố định thỏ lên bàn chuyên dụng, gây mê bằng
dung dịch penthotal 1% với liều 1mL/kg cân nặng theo đuờng tiêm tinh mạch tai. Khi thỏ
đã mê, dùng bình nhôm hình trụ đáy phẳng có đuờng kính 3 cm đựng nuớc đang sôi với thể
tích hằng định đặt lên vùng da thỏ đã cạo lông và ép với một lực không đổi bằng cách đặt
một quả cân 1kg lên miệng bình. Thời gian tiếp xúc với nguồn nhiệt là 35 giây, tạo vết
bỏng đuờng kính 3 cm, mức độ tổn thương đuợc đánh giá theo phân loại độ bỏng của Lê
Thế Trung(1965).
- Đắp màng PVA/TB đã được khử trùng lên vết bỏng trên lưng thỏ, sau đó được
băng (không băng chặt) lại bằng băng gạc.
- Đánh giá và tính điểm các chỉ số về ban đỏ (erythema), phù nề (oedema) tại
thời điểm 1 giờ, 24, 48, 72 giờ sau khi loại bỏ màng. Nếu có tổn thương, theo
dõi thỏ 14 ngày để đánh giá khả năng phục hồi. Khi tổn thương đã hồi phục thì
ngừng theo dõi.
- Đưa thỏ về chuồng nhốt riêng, chăm sóc thỏ theo điều kiện bình thường.
60
Hình 2.3 Vị trí đặt mẫu màng trên da t