Luận án Nghiên cứu ứng dụng công nghệ crispr/cas9 trong tạo đột biến gen GmGOLS03, GmGOLS19 trên cây đậu tương (glycine max (l.) merrill) nhằm giảm lượng đường họ raffinose trong hạt

 được lắc 200 v/p ở 28oC trong 16 giờ ở điều kiện tối hoàn toàn trên máy lắc. 
 Tạo dịch huyền phù vi khuẩn: dịch khuẩn thu từ quá trình nuôi lỏng được hòa 
loãng 2 - 3 lần và tiếp tục nuôi phục hồi 2 - 4 giờ. Sau đó dịch khuẩn được ly tâm ở 
5000 v/p trong 10 phút ở 4oC. Loại bỏ phần dịch nổi và hòa tan cặn khuẩn trong môi 
trường CCM lỏng có bổ sung AS và pha loãng cho đến khi dịch khuẩn có OD660 đạt 
0,8 - 1. Dịch huyền phù này được dùng cho biến nạp. 
- Nhiễm khuẩn và đồng nuôi cấy 
 Môi trường đồng nuôi cấy là CCM đặc có bổ sung AS. CCM được đổ trên đĩa 
petri, khi khô đặt giấy thấm đã khử trùng lên trên bề mặt môi trường. Mẫu được ngâm 
trong dịch huyền phù vi khuẩn trong thời gian 30 phút. Sau thời gian nhiễm khuẩn, 
mẫu được chuyển sang môi trường đồng nuôi cấy CCM đặc. Quá trình đồng nuôi cấy 
diễn ra trong tối, ở 25oC trong thời gian là 5 ngày. 
- Diệt khuẩn và tạo đa chồi 
 Mẫu biến nạp sau thời gian đồng nuôi cấy được lắc trong môi trường SIM lỏng 
có bổ sung 500 mg/l cefotaxime với thời gian là 10 phút, sau đó thấm khô bằng giấy 
thấm khử trùng. Dùng panh và dao cắt bỏ chồi chính xuất hiện trên các mảnh lá mầm, 
cấy mẫu lên môi trường tạo cụm chồi có bổ sung 500 mg/l cefotaxime. Sau thời gian 
2 tuần, mẫu được chuyển sang môi trường SIM đặc có bổ sung 500 mg/l cefotaxime, 
3 mg/l PPT và nuôi trong 2 tuần. 
- Tái sinh cây hoàn chỉnh 
 Các cụm chồi sống được trên môi trường chọn lọc sẽ được chuyển sang môi 
37 
trường phát triển chồi SEM có bổ sung 500 mg/l cefotaxime và 3 mg/l PPT. Khi các 
chồi phát triển đạt kích thước từ 3 - 5 cm sẽ được chuyển sang môi trường ra rễ RM 
có bổ sung 250 mg/l cefotaxime để tạo cây hoàn chỉnh. 
- Kiểm tra tính kháng thuốc trừ cỏ 
 Các cây đậu tương chuyển gen thế hệ T0 tái sinh trên môi trường chọn lọc 
được chuyển ra trồng trên giá thể và sàng lọc bằng phết thuốc trừ cỏ (200 mg/l 
glufosinate) trên lá có ba lá chét. Sàng lọc bằng phết thuốc trừ cỏ trên lá được lặp lại 
3 lần tại các vị trí khác nhau trên mỗi cây tái sinh. 
2.3.6. Phương pháp trồng và chăm sóc cây đậu tương trong điều kiện nhà lưới 
Cây đậu tương được trồng trong các chậu nhựa (chiều cao 25 cm, đường kính 
20 cm) chứa hỗn hợp TRiBAT (Công ty TNHH MTV Sài Gòn xanh, Việt Nam) và 
trồng trong điều kiện nhà kính ở 28-35°C với quang chu kỳ 16 giờ sáng/8 giờ tối. Cây 
đậu tương được bón phân hai lần với NPK (15:5:20) sau khi trồng 40 ngày và NPK 
(16:16:16) sau khi trồng 65 ngày. Hạt đậu tương được thu hoạch và bảo quản trong 
kho lạnh (độ ẩm 40%, 4oC) cho các thí nghiệm tiếp theo. Các chỉ số sinh trưởng bao 
gồm chiều cao cây (cm), số nhánh, số lóng của mỗi cây được ghi lại khi cây ở giai 
đoạn trưởng thành (giai đoạn R8). Chiều dài lá và chiều rộng lá (cm) được đo tại các 
vị trí lá khác nhau ở giai đoạn phát triển R2 của cây 
2.3.7 Phân tích sự di truyền của đột biến định hướng và gen chuyển các dòng 
đậu tương chỉnh sửa gen 
 Kiểm tra sự tính kháng thuốc trừ cỏ của dòng đột biến 
 Các dòng đậu tương T0, T1, T2 được kiểm tra sự có mặt của gen chọn lọc bar 
thông qua phương pháp phết thuốc trừ cỏ như mục 3.2.5. Lá của các dòng đậu tương 
chuyển gen ở các thế hệ khác nhau được sử dụng để tách chiết DNA tổng số theo 
phương pháp CTAB của Doyle và cộng sự (1991) và được sử dụng cho các phân tích 
tiếp theo. 
 Kiểm tra sự có mặt của gen chuyển 
 Các dòng đậu tương T1, T2 được kiểm tra sự có mặt của gen chuyển thông 
qua phản ứng PCR với cặp mồi đặc hiệu cho gen pcoCas9 và gen bar (Bảng phụ lục 
1), với 35 chu kỳ khuếch đại. Sản phẩm PCR của các dòng đột biến được điện di trên 
gel agarose 1% để kiểm tra sự có mặt của gen chuyển. 
38 
 Kiểm tra sự di truyền và phân ly của các đột biến trên các dòng đậu tương 
chỉnh sửa gen 
 DNA của các dòng đột biến thế hệ T1, T2 được sử dụng cho phân tích biến 
tính hồi tính trên gel polyacrylamide 15% theo phương pháp của Zhou và cộng sự 
(2014) [96] như trình bày ở mục 2.3.4. Sản phẩm PCR cũng được tinh sạch, tách dòng 
trong vector pJET1.2 (Thermo Scientific, Waltham, MA, USA) và giải trình tự bằng 
hệ thống ABI PRISM® 3100 Avant Genetic Analyzer tại tại Phòng thí nghiệm trọng 
điểm Công nghệ gen – Viện Công nghệ sinh học – Viện Hàn lâm khoa học và Công 
nghệ Việt Nam. 
 Xây dựng các chỉ thị phân tử để phát hiện các đột biến mất đoạn có kích thước 
nhỏ ở thế hệ T2 giống Maverick 
 Các chỉ thị phân tử được sử dụng cho việc sàng lọc và kiểm tra sự di truyền 
của các dòng đột biến phân ở thế hệ T2, xây dựng dựa trên nguyên tắc bổ sung với 
sợi khuôn DNA như Hình 2.2A, đồng thời kết hợp với kết quả giải trình tự của đột 
biến các gen GmGOLS ở thế hệ T1 của giống Maverick theo phương pháp của Đỗ 
Tiến Phát và cộng sự (2019) [87]. 
Hình 2.2. Sơ đồ minh họa nguyên lý thiết kế các chỉ thị phân tử dùng trong sàng lọc 
đột biến phân ly 
A. Minh hoạ các chỉ thị phân tử bám được vào trình tự gen và không bám được vào 
trình tự gen do đột biến; B.Minh họa sản phẩm PCR trên bản gel agarose, ô màu 
thể hiện sự xuất hiện băng vạch trên bản gel, và ô nét đứt thể hiện sự không xuất 
hiện băng vạch tương ứng trên bản gel 
39 
Kí hiệu và trình tự các chỉ thị phân tử như sau: 
GOLS-seg F (5’-TGGAGTCACACCCCTCAGTA-3’), Tm: 560C; 
GOLS-seg F1 (5’-AGACATGGAGTCACACCCCG-3’), Tm: 600C; 
GOLS-seg F3 (5’-AGACATGGAGTCACACATGC-3’), Tm: 560C. 
Khi kết hợp các chỉ thị phân tử này với các mồi đặc hiệu cho gen GmGOLS 
G03R (5’- CCCCGTATATCTCCATGGCTTGG-3’); Tm: 560C 
G19R (5’- GCGCCAGAGCATGGCAAGGAC-3’); Tm: 560C 
 Trong đó, GOLS-seg F được thiết kế đặc hiệu để nhận biết alen WT (tức là alen 
không đột biến) và alen đột biến mất 22 bp (Δ-22 bp); GOLS-seg F1 được thiết kế để 
nhận biết alen mang đột biến Δ-33 bp; và GOLS-seg F3 được thiết kế để nhận biết 
alen mang đột biến Δ-30 bp. Khi chỉ thị phân tử kết hợp với một mồi đặc hiệu cho 
gen GmGOLS03 hoặc GmGOLS19, thông qua PCR, các alen được khuếch đại và xuất 
hiện băng vạch khi điện di trên gel agarose (Hình 2.2 B). 
Bảng 2.3. Dự kiến khả năng phát hiện các alen đột biến thông qua phản ứng PCR sử 
dụng các chỉ thị phân tử 
Dạng đột biến 
 Chỉ thị phân tử 
GmGOLS03 GmGOLS19 
-22 -33 -22/-33 -30 WT -22 WT 
GOLS-seg F + G03 R (Tm: 560C) + + + 
GOLS-seg F + G19 R (Tm: 560C) + + 
GOLS-seg F1 + G03 R (Tm: 600C) + + + 
GOLS-seg F1 + G19 R (Tm: 600C) 
GOLS-seg F3 + G03 R (Tm: 560C) + + 
 Ghi chú: (+) Kết quả dương tính với phản ứng PCR; WT. Alen không mang đột biến 
Phương thức tiến hành như sau: từ các mẫu DNA của dòng đậu tương mang 
gen đột biến thế hệ T2, vùng gen GmGOLS03 và GmGOLS19 được khuếch đại bằng 
các chỉ thị phân tử với thành phần phản ứng bao gồm: 7,5µl DreamTaq green 
mastermix 2X (Thermo Scientific, Mỹ), 5 pM mồi xuôi, 5 pM mồi ngược, 100 ng 
DNA và 6,5 µl deion -H2O (đã khử DNAse và RNAse). Chu trình khuếch đại được 
thực hiện như sau: biến tính khởi đầu ở 94ºC trong 3 phút, khuếch đại trong 35 chu 
kỳ theo các bước lần lượt sau (1) biến tính ở 94ºC trong 30 giây, gắn mồi ở Tm (nhiệt 
độ gắn mồi) tùy thuộc chỉ thị phân tử trong 30 giây, (2) kéo dài ở 72ºC trong 30 giây, 
40 
(3) kéo dài kết thúc ở 72ºC trong 7 phút. Sản phẩm PCR được điện di trên gel agarose 
2 %, các băng vạch DNA xuất hiện sẽ được dùng trong đánh giá sự di truyền của đột 
biến và hiệu quả của các chỉ thị phân tử. 
Kết hợp kết quả xác định trình tự đột biến các gen GmGOLS ở thế hệ cây T1 
và kết quả di truyền và phân ly của các đột biến thông qua phân tích PCR dự đoán sẽ 
thu được như Bảng 3.4. 
2.3.8. Kiểm tra độ nảy mầm của hạt 
 Kiểm tra độ nảy mầm của hạt được thực hiện theo phương pháp xử lý nước 
của Blöchl và cộng sự (2007) [18]với các hạt phân ly ở thế hệ hệ T2 của cây mang 
đột biến đơn gen GmGOLS03 (gồm các dòng DT1.1-7-2, DT1.1-14-1, DT1.1-14-3) 
và đột biến kép hai gen GmGOLS03, GmGOLS19 (gồm các dòng DT1.1-5-3, DT1.1-
13-1, DT1,1-14-10), hạt ĐT26 không mang đột biến sử dụng làm đối chứng. Cụ thể 
hạt của các dòng mang đột biến gen có hàm lượng raffinose thấp và hạt ĐT 26 không 
mang đột biến (WT) được ngâm trong nước và theo dõi, so sánh tỉ lệ nảy mầm qua 
các mốc thời gian (24 giờ, 48 giờ, 72 giờ, 96 giờ và 120 giờ). Thí nghiệm lặp lại 3 
lần cho mỗi dòng với 50 hạt mỗi lần lặp. Tốc độ nảy mầm được ghi lại sau mỗi 24 
giờ cho đến 120 giờ, tính từ lúc thực hiện nảy mầm hạt. 
2.3.9. Xác định thành phần hạt 
 Hạt đậu tương thế hệ T3 thu được từ các dòng T2 trồng trong nhà kính được 
nghiền và tiến hành định lượng tại viện nghiên cứu IPK, Đức: 
- Phân tích hàm lượng ban đầu RFO tổng số từ các thành phần (Raffinose/ 
Sucrose / D-Glucose) trong hạt: thủy phân từng phần tạo các dạng đường đơn giản, 
sau đó phân tích chúng bằng bộ Megazyme Raffinose / Sucrose / D-Glucose 
(Megazyme Co, Bray, Ireland) theo hướng dẫn của nhà sản xuất. 
- Phân tích về hàm lượng từng loại đường hòa tan bằng sắc ký lỏng cao áp (ICS-
3000, Thermo-Fisher). Các mẫu hạt T3 trưởng thành được nghiền và chiết bằng 
metanol (80% v/v) theo phương pháp của Weber và cộng sự (2000). Việc tách chiết 
mẫu được thực hiện trên cột PA1 (2 × 250 mm) và cột bảo vệ (PA1 2 × 50 mm) ở 
40°C bằng cách chạy đẳng tích với 100 mM NaOH ở tốc độ dòng không đổi là 0,35 
ml/phút. Thành phần các loại đường sẽ được xác định căn cứ vào thời gian lưu giữ 
tương ứng với các tiêu chuẩn đã cài đặt trước đó. Hiệu chuẩn bên ngoài đã được áp 
dụng bằng cách sử dụng các tiêu chuẩn đã xác thực. 
41 
- Phân tích hàm lượng chất béo, tinh bột, protein và độ ẩm của hạt bằng máy 
quang phổ kế (MPA; Bruker), được hiệu chuẩn theo quy trình của nhà cung cấp. 
2.3.10. Phân tích các đột biến ngoài mục tiêu (off target) 
 DNA của các dòng đậu tương T2 từ cùng cây T1 có hàm lượng cacbohydrate 
thay đổi được nhóm lại với nhau và kiểm tra hiện tượng off-target có thể xảy ra. Các 
off-target được dự đoán bởi chương trình dự đoán trực tuyến CCTop theo phương 
pháp của Stemmer và cộng sự (2015). Sản phẩm PCR của các dòng đột biến được 
tách dòng và giải trình tự gen theo phương pháp Sanger như trình bày bên trên. Việc 
giải trình tự được thực hiện tại Phòng thí nghiệm trọng điểm Công nghệ gen – Viện 
Công nghệ sinh học – Viện Hàn lâm khoa học và Công nghệ Việt Nam. 
2.3.11. Phân tích thống kê 
Các số liệu được phân tích bởi SPSS (version 16.0) và Microsoft Excel 2007 
(Microsoft, Redmond, WA, Hoa Kỳ). ANOVA một chiều được sử dụng để phân tích 
các nhóm đột biến và t-test để phân tích các giá trị trung bình những dòng đột biến 
đơn; với mức ý nghĩa thống kê ở p = 0,05. Đối với phân tích thành phần hạt giống 
HPLC, mỗi kiểu gen đột biến gây ra được biểu thị bằng hạt từ hai dòng; phép đo của 
mỗi dòng được thực hiện trong bốn lần. 
42 
CHƯƠNG 3 
KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU 
3.1 Thiết kế hệ thống chỉnh sửa CRISPR/Cas9 nhằm gây tạo đột biến các gen 
GmGOLS trên đậu tương 
 Lựa chọn trình tự gen mã hóa Galactinol synthase (GmGOLS) và thiết kế cấu 
trúc chỉnh sửa hệ gen CRISPR/Cas9. Thông qua công cụ tìm kiếm BLAST, chúng tôi 
đã phân tích, kiểm tra mối quan hệ phát sinh loài giữa các GmGOLS đậu tương và 
các loài thực vật khác. Dựa trên trình tự protein Arabidopsis GOLS, 6 gen GmGOLS 
giả định đã được xác định từ cơ sở dữ liệu hệ gen của đậu tương SoyBase.org (Hình 
3.1). 
Hình 3.1. Mối quan hệ phát sinh loài giữa các protein GOLS đã được xác định 
trong cây Arabidopsis, cà chua, ngô 23 trình tự protein GOLS 
(đã được sử dụng để xây dựng cây phát sinh loài bằng phương pháp phân tích 
Neighbor Joining, sử dụng phần mềm MEGA X với 1000 lần lấy mẫu) 
 Đồng thời, tham khảo cơ sở dữ liệu về mức độ phiên mã của các gen GmGOLS 
khác nhau trong các mô khác nhau và ở các giai đoạn phát triển khác nhau của hạt ở 
Hình 3.2, chúng tôi nhận thấy có sáu gen GmGOLS (Glyma.03G222000, 
43 
Glyma.19G219100, Glyma.03G229800, Glyma.20G094500, Glyma.10G145300, 
Glyma.19G227800) được nhóm lại cùng nhau tạo thành ba cặp tương đồng là 
AtGOLS1, AtGOLS2 và AtGOLS3. Trong đó, biểu hiện của Glyma.03G222000 
(GmGOLS03) tăng mạnh khi hạt chín và cho thấy mức độ biểu hiện ở hạt cao nhất 
trong số tất cả các gen GmGOLS [91]. Gen GmGOLS03 kích thước 2478 bp nằm trên 
chromosome 3 gồm 3 exon mã hóa cho đoạn polypeptide 339 axit amin. 
Glyma.19G219100 (GmGOLS19) kích thước 2176 bp nằm trên chromosome 19 gồm 
3 exon mã hóa cho đoạn polypeptide 339 axit amin. Bên cạnh đó, gen GmGOLS19 
có mức độ biểu hiện tương đương với gen GmGOLS03 ở đầu giai đoạn phát triển của 
hạt (tức là cho đến giai đoạn R6) nhưng giảm xuống ở các giai đoạn phát triển sau. 
Các dữ liệu này chỉ ra rằng gen GmGOLS03 có khả năng là gen mã hóa chính cho 
enzyme galactinol synthase tham gia vào quá trình sinh tổng hợp RFOs trong quá 
trình phát triển hạt đậu tương. Do đó, trong nghiên cứu này, chúng tôi đã gây đột biến 
gen GmGOLS03 và gen tương đồng với gen GmGOLS03 là gen GmGOLS19 bằng hệ 
thống CRISPR/Cas9 để kiểm tra chức năng của GmGOLS trong quá trình sinh tổng 
hợp RFOs trong hạt đậu tương. 
Hình 3.2. Phân tích transcriptomics cho GOLS trong đậu tương 
Dữ liệu được lấy từ atekb.org 
 Căn cứ vào dữ liệu của thí nghiệm trước, chúng tôi đã chọn một giống đậu tương 
44 
ưu tú của Việt Nam (ĐT26) và giống Mr làm vật liệu để gây đột biến có mục tiêu. Sử 
dụng trình tự bộ gen giống đối chứng Williams 82 và kết quả giải trình tự sơ bộ cho 
thấy các trình tự các gen GmGOLS03 và GmGOLS19 trong giống Mr và ĐT26 tương 
đồng 100% với các trình tự tương ứng trong bộ gen giống đối chứng William 82 [92]. 
 Dựa trên các trình tự đã khai thác được trên hai giống vật liệu, hai trình tự 
RNA định hướng (sgRNAs) đã được chọn từ các vị trí đích tiềm năng trên 
GmGOLS03 và GmGOLS19. Hai trình tự đích này giống nhau và nằm trong exon 2 
của cả hai gen GmGOLS (Hình 3.3A và 3.3B) 
Hình 3.3. Cấu trúc gen GmGOLS và vị trí của các trình tự gRNA 
A. Trình tự sgRNA và PAM trên gen đích; B. Cấu trúc gen GmGOLS03, 
GmGOLS19, vị trí các gRNA và vị trí các cặp mồi sử dụng trong phân tích xác định 
các đột biến. 
 Sau khi xác định được các sgRNA, trình tự mã hóa các sgRNA này được tổng 
hợp nhân tạo và ghép nối vào vector chuyển gen đã chứa trình tự mã hóa protein Cas9 
để tạo thành cấu trúc chuyển gen hoàn chỉnh như Hình 3.4. 
Hình 3.4. Sơ đồ minh họa cấu trúc vector chỉnh sửa gen CRISPR/Cas9 được thế kế 
để chuyển gen vào đậu tương 
45 
3.2 Kiểm tra hoạt động của cấu trúc chuyển gen và chỉnh sửa gen 
CRISPR/Cas9 thông qua hệ thống cảm ứng rễ tơ 
 Như đã đề cập ở bên trên, nhằm kiểm tra và đánh giá khả năng tạo đột biến 
định hướng trên gen quan tâm của các cấu trúc CRISPR/Cas9 đã thiết kế được, chúng 
tôi tiến hành thiết lập hệ thống chuyển gen thông qua rễ tơ trên một số giống đậu 
tương lựa chọn. Tiếp theo, các cấu trúc chỉnh sửa gen sẽ được chuyển vào các dòng 
rễ tơ và đánh giá khả năng gây tạo đột biến. Mục đích của công việc này là đảm bảo 
khả năng hoạt động và tính hiệu quả của các cấu trúc đã thiết kế trước khi tiến hành 
chuyển gen ổn định vào các giống đậu tương lựa chọn để tạo dòng đột biến định 
hướng. 
3.2.1 Phát triển hệ thống cảm ứng tạo rễ tơ trong điều kiện in vitro trên một số 
giống đậu tương 
 Để ứng dụng hệ thống cảm ứng rễ tơ trong nghiên cứu hoạt động của cấu trúc 
chuyển gen và chỉnh sửa hệ gen trên giống đậu tương Việt Nam, chúng tôi phát triển 
và tối ưu hóa quy trình cảm ứng tạo rễ tơ in vitro trên cơ sở các điều kiện tại phòng 
thí nghiệm trong nước. 
3.2.1.1 Đánh giá hiệu quả cảm ứng rễ tơ của một số giống đậu tương 
 Quá trình xây dựng hệ thống cảm ứng tạo rễ tơ trong điều kiện in vitro được 
tiến hành cho hai giống đậu tương có nguồn gốc ngoài nước là Williams 82 (WL82), 
Marverick (Mr) và hai giống đậu tương được trồng phổ biến tại Việt Nam là giống 
ĐT22, ĐT26. Chủng vi khuẩn A. rhizogenes K599 mang một trong hai cấu trúc 
chuyển gen (pZY102/gus, pFGC/gfp) được sử dụng trong các thí nghiệm chuyển gen 
vào rễ tơ đậu tương. Kết quả ghi nhận về chỉ tiêu tỉ lệ mẫu tạo rễ tơ sau 5 ngày nuôi 
cấy trên môi trường cảm ứng tạo rễ cho thấy, cả bốn giống đậu tương thí nghiệm được 
biến nạp khuẩn K599- pFGC/gfp có tỉ lệ mẫu phát sinh rễ tơ đạt mức cao (Hình 3.5). 
Quan sát mẫu đặt trên môi trường cảm ứng tạo rễ, tại vị trí tạo tổn thương nhận 
thấy, mô sẹo cảm ứng sinh rễ xuất hiện ngay ở ngày thứ nhất (Hình 3.6). Sau 5 ngày 
cảm ứng tạo rễ, tỉ lệ tạo rễ tơ từ cấu trúc mang gen gfp trên giống ĐT22 đạt 100% và 
WL82 đạt 98,33% (Hình 3.7). Trong khi đó, tỉ lệ này của giống Mr là 95% và ĐT26 
chỉ đạt 93,33%. Với cấu trúc mang gen chỉ thị gus, tỉ lệ tạo rễ tơ cao nhất của hai 
giống ĐT22 và WL82 khi biến nạp chỉ đạt mức 95%. Tỉ lệ này giảm xuống 88,33% 
với giống ĐT26 và 61,67% ở giống Mr. Kết quả này cho thấy giống đậu tương cũng 
46 
như cấu trúc chuyển gen có ảnh hưởng trực tiếp tới tỉ lệ mẫu tạo rễ tơ in vitro trong 
biến nạp sử dụng vi khuẩn A. rhizogenes (Hình 3.5 và Hình 3.7). 
Hình 3.5. Tỉ lệ tạo rễ tơ của các giống đậu tương chuyển gen 
Cấu trúc pZY102/gus mang gen chỉ thị gus; cấu trúc pFGC/gfp mang 
 gen chỉ thị gfp 
Hình 3.6. Cảm ứng tạo rễ tơ của các giống đậu tương thí nghiệm 
 với cấu trúc pFGC/gfp trên môi trường đồng nuôi cấy 
A. Mô sẹo hình thành tại vị trí tổn thương sau thời gian đồng nuôi cấy; B. Rễ tơ 
cảm ứng trên môi trường tạo rễ 
47 
Hình 3.7. Cảm ứng tạo rễ tơ của các giống đậu tương thí nghiệm với cấu trúc 
pFGC/gfp sau 5 ngày trên môi trường cảm ứng tạo rễ 
A. Rễ tơ của giống Mr; B. Rễ tơ giống ĐT26; C. Rễ tơ giống WL82; 
D. Rễ tơ giống ĐT22 
Bên cạnh đó, số rễ tơ trung bình của hai giống đậu tương trong nước ĐT22 và 
ĐT26 cho thấy sự khác biệt có ý nghĩa về mặt thống kê so với hai giống nước ngoài 
WL82 và Mr. Sau 10 ngày nuôi cấy trên môi trường cảm ứng tạo rễ tơ, giống ĐT22 
và ĐT26 biến nạp với khuẩn mang cấu trúc pZY102/gus có số rễ tơ trung bình đạt 
lần lượt là 38,32 và 30,67 rễ/mẫu; và biến nạp với khuẩn mang cấu trúc pFGC/gfp số 
rễ tơ trung bình đạt là 35,13 rễ/mẫu và 31,03 rễ/mẫu. 
Trong khi đó, giống đậu tương Mr và WL82 có số rễ tơ trung bình tạo ra thấp 
khi biến nạp với cả hai chủng khuẩn thí nghiệm. Cụ thể, số rễ trung bình thấp nhất 
thu được ở giống WL82 với 20,3 rễ/mẫu khi biến nạp với cấu trúc pZY102/gus và 
18,32 rễ/mẫu với cấu trúc pFGC/gfp. 
 Tổng hợp kết quả trên cho thấy giống đậu tương ĐT22 tỉ lệ ra rễ cũng như số 
rễ tơ trung bình được tạo ra từ quá trình cảm ứng chuyển ở cả hai cấu trúc pZY102/gus 
và pFGC/gfp đạt tỉ lệ cao nhất. Hiệu quả cảm ứng tạo rễ tơ in vitro thấp nhất là giống 
WL82. 
Từ kết quả nghiên cứu của thí nghiệm này, quy trình cảm ứng tạo rễ tơ in vitro 
cho các giống đậu tương nghiên cứu được thiết lập như Hình 3.8. 
48 
Hình 3.8. Quy trình cảm ứng tạo rễ tơ in vitro trên các giống đậu tương thí nghiệm 
A. Khử trùng hạt bằng khí Clo, thời gian 16-20 giờ; B. Hạt nảy mầm trên 
môi trường MS sau 04 ngày, trong điều kiện nhiệt độ 26ºC, ánh sáng 8 giờ/ngày; C. 
Lá mầm sau khi tạo tổn thương và nhiễm khuẩn; D. Đồng nuôi cấy mẫu lá mầm 
trong 5 ngày trên giấy thấm ẩm; E. Cảm ứng tạo rễ tơ đậu tương từ lá mầm; F. Rễ 
tơ hình thành; G. Rễ tơ phát triển sau 10 ngày trên môi trường cảm ứng tạo rễ 
Các bước chi tiết của quy trình cụ thể như sau: 
Chuẩn bị 
 - Hạt khử trùng khí Clo (18-20 giờ). Gieo hạt trên MS (3-4 ngày). 
 - Vi khuẩn: nuôi khuẩn lạc trên thạch 48 giờ, chuyển sang nuôi 
phục hồi OD660 = 0,8-1 từ 6-8 giờ. Nuôi huyền phù khuẩn qua đêm 
OD660 = 0,8-1, ly tâm 3500 vòng/10 phút, thu và hoà cặn ½ MS 
khuẩn dùng biến nạp 
Cảm ứng tạo rễ tơ 
- Mẫu hạt nảy mầm: cắt và tách 2 lá mầm, hủy phần chồi mầm, tạo 
tổn thương mặt trong lá mầm dọc theo phần trụ mầm. Ngâm mẫu 
với dịch hoà khuẩn trong 30 phút 
 - Đồng nuôi cấy: chuyển mẫu lên đĩa peptri chứa giấy thấm ẩm, 
nuôi cấy trong điều kiện sáng 8 tiếng/ngày, nhiệt độ 24-260C. 
 - Tạo rễ tơ: sau 5 ngày đồng nuôi cấy, chuyển mẫu lên môi trường 
nuôi cấy tạo rễ tơ tiếp tục nuôi cấy trong điều kiện sáng hoàn toàn, 
nhiệt độ 24-260C, 5-10 ngày theo dõi sự xuất hiện của rễ 
3-4 ngày 
5 ngày 
Thu rễ và kiểm tra sự có mặt của gen chu