Luận án Nghiên cứu ứng dụng phương pháp công nghệ sinh học và truyền thống trong nhân giống, tạo sinh khối rễ và trồng trọt cây đan sâm (salvia miltiorrhiza bunge) tại Gia Lâm, Hà Nội

1,0 mg/l GA3 
MS + 0,5 mg/l BA 
½ MS + 
0,75 mg/l IAA 
2 tuần 
4 tuần 
30 ngày 
Cát: xơ dừa (1:1) 
100% cát 
Đất: Cát (1:1) 
Đất: Cát (3:7) 
Cát: Xơ dừa (7:3) 
Cát: Xơ dừa (1:1) 
 67 
Bƣớc 1: Tạo vật liệu khởi đầu 
 Hạt Đan sâm sau khi rửa bằng nƣớc sạch đƣợc khử trùng bằng cồn 70% 
trong 30 giây, tráng lại bằng nƣớc cất vô trùng 3-4 lần. Tiếp theo, hạt Đan sâm đƣợc 
gieo trên môi trƣờng MS + 1,0 mg/l GA3 trong 2 tuần để kích thích hạt nảy mầm. 
Bƣớc 2: Nhân nhanh chồi 
Đoạn thân có kích thƣớc từ 1-1,5 cm mang chồi nách cắt từ cây Đan sâm in 
vitro đƣợc chuyển sang môi trƣờng nhân nhanh là môi trƣờng MS + 0,5 mg/l BA 
trong 4 tuần. 
Bƣớc 3: Tạo cây hoàn chỉnh 
 Các chồi Đan sâm có chiều cao 2-3 cm, sinh trƣởng phát triển bình thƣờng 
đƣợc cấy chuyển sang môi trƣờng ½ MS 0,75 mg/l IAA trong 30 ngày để kích 
thích tạo rễ. 
Bƣớc 4: Thích nghi cây ngoài điều kiện tự nhiên 
 Cây Đan sâm in vitro sau khi đƣợc nuôi cấy trên môi trƣờng ra rễ 30 ngày 
đƣợc chuyển ra vƣờn ƣơm, sử dụng giá thể 50% cát 50% xơ dừa. 
4.2. TẠO DÒNG RỄ TƠ VÀ NHÂN NUÔI SINH KHỐI RỄ TƠ IN VITRO 
CÂY ĐAN SÂM 
 Tạo rễ tơ nhờ vi khuẩn Agrobacterium rhizogenes để thu nhận các hợp 
chất có hoạt tính sinh học là một giải pháp hiệu quả, có thể khắc phục đƣợc 
những hạn chế của phƣơng pháp nhân giống truyền thống, đồng thời có những ƣu 
điểm vƣợt trội nhƣ nâng cao hàm lƣợng hoạt chất mục tiêu, chủ động quá trình 
sản xuất, tối ƣu hóa quy trình chiết xuất hợp chất mục tiêu. 
 Nghiên cứu tạo rễ tơ và nhân nuôi sinh khối rễ tơ cây Đan sâm đã đƣợc 
tiến hành bởi một số nhà khoa học trên thế giới với kết quả khả quan. Gupta et al. 
(2011) tạo thành công các dòng rễ tơ cây Đan sâm nhờ vi khuẩn A. rhizogenes 
BCRC 15010 với tỷ lệ mô lá tạo rễ đạt 78%. Thông qua tối ƣu các thành phần 
môi trƣờng nuôi cấy, sinh khối rễ tơ Đan sâm và các hoạt chất tích lũy nhƣ 
tanshione, salvinolic acid tăng lên đáng kể (Yan et al., 2005). Tuy nhiên, tại Việt 
Nam, chƣa có bất kỳ nghiên cứu nào liên quan đến việc tạo các dòng rễ tơ Đan 
sâm nhờ vi khuẩn A.rhizogenes hay thiết lập quá trình nhân nuôi sinh khối rễ Đan 
sâm. Do vậy, việc tạo thành công rễ tơ Đan sâm và khảo sát một số yếu tố ảnh 
hƣởng đến sự tăng sinh khối rễ trong quá trình nuôi cấy góp phần tạo tiền đề cho 
quá trình xây dựng quy trình sản xuất các hợp chất thứ cấp từ rễ cây Đan sâm 
phục vụ phát triển ngành công nghiệp dƣợc liệu tại Việt Nam. 
 68 
4.2.1. Ảnh hƣởng của vật liệu lây nhiễm đến khả năng tạo rễ tơ cây Đan sâm 
 Nhiều nghiên cứu đã chỉ ra rằng nguồn vật liệu dùng cho lây nhiễm với vi 
khuẩn có khả năng cảm ứng chuyển gen khác nhau (Lièvre et al., 2005; Diof et 
al., 2006). Sau 4 tuần lây nhiễm với vi khuẩn A.rhizogenes tại nồng độ dịch 
khuẩn tƣơng ứng với giá trị mật độ quang OD600 = 0,2, đoạn thân và cuống lá 
Đan sâm hoàn toàn không tạo rễ, trong khi đó, mô lá cho tỷ lệ tái sinh tạo rễ tơ 
với tỷ lệ 53,85%, số rễ trung bình đạt 8,54 rễ/mẫu (Bảng 4.11). Quan sát hình 
thái cho thấy, mẫu mô lá cảm ứng tạo rễ tại vị trí gây vết thƣơng, mẫu cuống lá 
và đoạn thân có hiện tƣợng hóa nâu và tạo callus tại vị trí cắt (Hình 4.9). Quan 
sát hình dạng rễ tơ tạo ra từ mô lá Đan sâm nhận thấy các dòng rễ đƣợc tạo ra từ 
mô lá có sức sinh trƣởng nhanh, khả năng phân nhánh tốt khi đƣợc cắt và chuyển 
sang môi trƣờng tái sinh không bổ sung chất điều hòa sinh trƣởng thực vật. 
Bảng 4.11. Ảnh hƣởng của vật liệu 
lây nhiễm đến khả năng tạo rễ tơ 
Đan sâm sau 4 tuần 
Vật liệ
 
Tỷ mẫu tạo rễ 
(%) 
Số rễ/mẫu 
(rễ) 
Mô lá 53,85 8,54 
Cuống lá 0 0 
Đoạn thân 0 0 
Hình 4.9. Ảnh hƣởng của vật liệu lây nhiễm 
đến khả năng tạo rễ tơ cây Đan sâm: A: mô lá; 
B: cuống lá; C: đoạn thân. 
 Sự hình thành rễ tơ từ mẫu lá cao hơn so với từ cuống lá và đoạn thân có 
thể do quá trình chuyển gen của vi khuẩn vào tế bào Đan sâm ở mô lá dễ xảy ra 
hơn so với ở cuống lá và đoạn thân. Kim et al. (2008) đã chứng minh rằng chủng 
A. rhizogenes 15834 cho tỷ lệ phần trăm số mẫu tạo rễ tơ trên lá đậu phộng là 
36,8% và số rễ tơ tạo ra từ vị trí bị thƣơng là 2,3 rễ. Còn trên mẫu từ trụ hạ diệp 
thì tỷ lệ tạo rễ tơ là 75,9% và 6,7 rễ. Shi and Kintzios (2003) cũng ghi nhận đối 
với cây Pueraria phaseoloides có kết quả tạo rễ tơ từ mẫu cuống lá cao hơn từ 
mẫu lá và lá mầm. Còn đối với cây Valeriana sisymbriifolium, Rahimi et al. (2008) 
đã chỉ ra mẫu lá và cuống lá sau khi lây nhiễm với vi khuẩn A. rhizogenes cho tỷ lệ 
mẫu tạo rễ tơ cao hơn so với mẫu trụ hạ diệp. Hoàng Thị Thanh Minh và cs. 
(2011) cũng nhận thấy sự tỷ lệ mẫu cấy tạo rễ tơ từ mô lá của cây đậu phộng cao 
hơn so với trụ hạ diệp, trụ thƣợng diệp, cuống lá và lá mầm. 
 Nhƣ vậy, vật liệu thích hợp để thực hiện chuyển gen tạo rễ tơ cây Đan sâm 
A B C 
 69 
là mô lá của cây in vitro. Kết luận này cũng trùng với kết quả của một số nghiên 
cứu trƣớc đây. Hao et al. (2012) ghi nhận tỷ lệ mẫu lá Đan sâm Salvia miltiorrhiza 
Bunge tạo rễ tơ (73%) cao hơn so với đoạn thân khi lây nhiễm 2 loại vật liệu này 
với chủng vi khuẩn A.rhizogenes ACCC 10066. Gupta et al. (2011) sử dụng mô lá 
làm vật liệu lây nhiễm với chủng vi khuẩn A.rhizogenes để tạo dòng rễ tơ Đan sâm 
với hiệu quả chuyển gen đạt 75 - 80%. Theo Pavar and Maheshvari (2004), có sự 
khác nhau về kết quả tạo rễ tơ trên các loại vật liệu khác nhau là do phản ứng của 
các mô thực vật khác nhau với sự xâm nhiễm của vi khuẩn A.rhizogenes là khác 
nhau và phụ thuộc rất lớn vào trạng thái sinh lý của mô. 
4.2.2. Ảnh hƣởng của mật độ vi khuẩn A.rhizogenes đến khả năng tạo rễ tơ 
từ mô lá Đan sâm 
 Mật độ vi khuẩn A.rhizogenes là một trong những yếu tố có ảnh hƣởng rõ 
đến hiệu quả chuyển gen nhằm thu đƣợc các dòng rễ tơ của thực vật. Kiana et al. 
(2012) khảo sát khả năng thu đƣợc các dòng rễ tơ từ mô lá cây Portulaca oleracea 
tại bốn mật độ vi khuẩn A. rhizogenes ATCC15834 tƣơng ứng với giá trị OD600 = 
0,2; 0,4; 0,6 và 0,8 và nhận thấy mật độ vi khuẩn tƣơng ứng với giá trị OD600 = 0,6 
cho tỷ lệ mẫu tạo rễ tơ đạt cao nhất (70%), trong khi mật độ vi khuẩn ở giá trị 
OD600 cao hoặc thấp hơn 0,6 cho tỷ lệ mẫu tạo rễ tơ chỉ đạt 30-50%. 
 Có sự khác nhau về tỷ lệ mẫu tạo rễ và số rễ/mẫu khi lây nhiễm mô lá Đan 
sâm với vi khuẩn ở các mật độ khác nhau tƣơng ứng với các giá trị OD600 = 0,05; 
0,1; 0,2 và 0,3. Tỷ lệ mô lá tạo rễ (53,85%) và số rễ/mẫu (8,54 rễ) đạt cao nhất 
khi mật độ vi khuẩn ở giá trị OD600 = 0,2. Ở mật độ vi khuẩn thấp hơn (OD600 = 
0,05; 0,1) hay cao hơn (OD600 = 0,3) cho tỷ lệ mẫu tạo rễ và số rễ/mẫu thấp hơn 
(Bảng 4.12). Do vậy, mật độ vi khuẩn tƣơng ứng với giá trị OD600 = 0,2 là thích 
hợp cho chuyển gen tạo rễ tơ Đan sâm. 
Bảng 4.12. Ảnh hƣởng của mật độ vi 
khuẩn A. rhizogenes đến khả năng tạo rễ 
tơ từ mô lá Đan sâm 
OD600 Tỷ lệ mẫu tạo rễ (%) Số rễ/mẫu (rễ) 
0,05 18,18 0,52 
0,1 23,53 0,94 
0,2 53,85 8,54 
0,3 25,00 2,33 
Hình 4.10. Ảnh hƣởng của mật độ vi 
khuẩn A. rhizogenes đến khả năng tạo rễ 
tơ từ mô lá Đan sâm 
OD600 = 0,2 OD600 = 0,3 
 70 
4.2.3. Xác định dòng rễ tơ chuyển gen bằng phƣơng pháp PCR 
4 ách chiết DNA genome 
Các mẫu rễ tơ thu đƣợc sau khi lây nhiễm với vi khuẩn Agrobacterium 
rhizogenes với mô lá Đan sâm, sau khi đƣợc cấy chuyển nhiều lần trên môi 
trƣờng nuôi dƣỡng có bổ sung kháng sinh diệt khuẩn cefotaxime đƣợc tách chiết 
DNA tổng số theo Kit tách chiết DNA của Qiagen để kiểm tra sự hiện diện của 
gen chuyển (rolA, rolB, rolC) thông qua kỹ thuật PCR. Sự hiện diện của đoạn 
gen chuyển trong bộ gen của rễ tơ sẽ chứng tỏ vi khuẩn A. rhizogenes đã chuyển 
gen thành công vào rễ tơ. 
Hình 4.11. Ảnh điện di kết quả tách chiết DNA tổng số từ rễ Đan sâm 
Ghi chú: Giếng 1: Ladder 1kb; giếng 2: DNA tổng số từ rễ cây bất định; giếng 3 - 14: DNA 
tổng số từ rễ tơ Đan sâm 
DNA tổng số từ rễ tái sinh sau khi đồng nuôi cấy với vi khuẩn A. 
rhizogenes và rễ bất định (không đồng nuôi cấy) in vitro đƣợc tách chiết và kiểm 
tra tính chất lƣợng bằng quan sát kết quả điện di trên gel agarose. Kết quả điện di ở 
hình 4.11 cho thấy, trong 13 mẫu rễ đem tách chiết, có 1 mẫu rễ bất định và 9 mẫu 
rễ tơ cho chất lƣợng DNA tổng số đạt yêu cầu với tiêu chuẩn dùng cho phản ứng 
PCR. Các mẫu rễ tơ tƣơng ứng với DNA ở các giếng 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 10, 11, 12. 
4 Xác định các d ng rễ tơ chuyển gen 
Nhƣ đã biết, tác nhân gây bệnh lông rễ là do sự có mặt của plasmid Ri 
(root-inducing). T-DNA ở Ri-plasmid của nhóm agropine A. rhizogenes bao gồm 
hai vùng chính là vùng bờ trái TL-DNA và bờ phải TR-DNA. Vùng TR-DNA 
mang các gen mã hóa tổng hợp auxin, vùng TL-DNA gồm 18 khung đọc mở 
trong đó có bốn locus mã hóa cho 4 gen rolA, rolB, rolC và rolD. Các gen rolA, 
rolB và rolC đóng vai trò quan trọng trong quá trình cảm ứng tạo rễ tơ ở mô tế 
bào thực vật. Khi lây nhiễm vi khuẩn A. rhizogenes với mô tế bào thực vật, vùng 
TL-DNA và TR-DNA của Ri-plasmid đƣợc chuyển vào hệ gen của tế bào thực 
 71 
vật. Do vậy, để xác định các dòng rễ tơ chuyển gen, gen rolA đƣợc khuếch đại 
bằng phƣơng pháp PCR. Kết quả điện di sản phẩm PCR ở hình 4.12A cho thấy, 
trong 10 dòng rễ tơ có 6 dòng (giếng 1, 3, 4, 6, 9, 10 - Hình 4.12A) có sự xuất 
hiện vạch băng DNA kích thƣớc 307 bp trùng vị trí với đối chứng dƣơng trong 
khi đó vạch băng này không xuất hiện ở đối chứng âm là mẫu rễ bất định. Nhƣ 
vậy, 6 dòng rễ tơ này có thể là rễ tơ chuyển gen chứa gen rolA trong genome. 
Để loại trừ khả năng gen rolA có mặt trong sáu dòng rễ tơ là do vi khuẩn 
A. rhizogenes còn tồn tại trong rễ, phản ứng PCR với cặp mồi virDF và virDR 
đƣợc thực hiện để khuếch đại gen virD - một gen gây độc có mặt ở vùng gen vir 
của Ri-plasmid và không đƣợc chuyển vào hệ genome thực vật trong quá trình 
lây nhiễm. Kết quả cho thấy, 2 dòng rễ tơ chứa gen rolA (giếng 9, 10 - Hình 
4.12B) xuất hiện vạch băng DNA có kích thƣớc 560 bp giống đối chứng dƣơng 
và 4 dòng rễ (giếng 1, 3, 4, 6 - Hình 4.12B) không xuất hiện vạch băng tƣơng 
ứng với kích thƣớc của gen virD. Điều này chứng tỏ DNA của vi khuẩn A. 
rhizogenes có mặt trong 2 dòng rễ tơ (giếng 9, 10 – Hình 4.12). 
Hình 4.12. Kết quả khuếch đại gen rolA (A) và gen virD (B) bằng phƣơng 
pháp PCR: L: GeneRuler 1kb DNA Ladder; +): Đối chứng dƣơng, sản 
phẩm PCR của Ri plasmid 15834; (-): Đối chứng âm, sản phẩm PCR của 
DNA genome rễ bất định Đan sâm; H2O: Đối chứng âm, nƣớc; Giếng 1-1 
 A): Sản phẩm PCR của DNA genome 1 d ng rễ tơ Đan sâm; Giếng 1, 3, 4, 
6, , 1 B): sản phẩm PCR với cặp mồi virD và virDR của 6 d ng rễ tơ c 
mang gen rolA. 
L + H
2
O - 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 
250 bp 
307 bp 
A 
L 1 + - H
2
O 3 4 6 9 10 
500 bp 
560bp 
B 
 72 
Từ kết quả trên có thể kết luận gen rolA từ pRi plasmid của A. rhizogenes 
15834 đã đƣợc chuyển vào rễ tơ cây Đan sâm. Sự vắng mặt của gen virD trong 4 
dòng rễ tơ cũng khẳng định rằng vi khuẩn sau khi đem lây nhiễm với nguồn vật 
liệu ban đầu đã đƣợc khử sạch hoàn toàn và không còn sót lại trên bề mặt tế bào 
4 dòng rễ tơ chuyển gen này. 
Nhƣ vậy, có thể kết luận nghiên cứu đã thu đƣợc 4 dòng rễ tơ chuyển gen. 
Qua khảo sát nhận thấy, các dòng rễ tơ này tăng sinh khối nhanh, ổn định trong 
môi trƣờng nuôi cấy không chứa chất điều tiết sinh trƣởng. 
4.2.4. Ảnh hƣởng của thành môi phần môi trƣờng đến sinh khối rễ tơ Đan 
sâm dòng A5.14 
Trong nuôi cấy rễ tơ, việc chọn lựa các dòng rễ tơ có khả năng phát mạnh 
cũng nhƣ điều kiện nuôi cấy tối ƣu sẽ giúp tăng khả năng tích lũy hoạt chất mục 
tiêu ở mức cao hơn. Dòng rễ tơ nuôi cấy tích lũy một lƣợng lớn hoạt chất sinh 
học chỉ khi ở những điều kiện đặc biệt nhƣ: thành phần môi trƣờng và điều kiện 
nuôi cấy thích hợp, các dòng rễ tơ năng suất cao, bổ sung tiền chất nuôi cấy và 
các chất kích kháng bảo vệ thực vật thích hợp. 
Trong số các dòng rễ tơ Đan sâm thu đƣợc, dòng rễ tơ A5.14 có sự tăng 
sinh khối nhanh, ổn định trong môi trƣờng nuôi cấy không bổ sung chất điều tiết 
sinh trƣởng nên đƣợc sử dụng làm vật liệu nuôi cấy để khảo sát các yếu tố ảnh 
hƣởng đến sự tăng sinh khối cũng nhƣ hàm lƣợng hoạt chất mục tiêu của rễ tơ 
Đan sâm. 
Dòng rễ tơ A5.14 đƣợc sử dụng làm vật liệu trong thí nghiệm đánh giá 
ảnh hƣởng của thành phần môi trƣờng đến sự tăng sinh khối của rễ tơ chuyển 
gen. Nghiên cứu sử dụng 2 nền môi trƣờng là MS và B5. 
Bảng 4.13. Ảnh hƣởng của môi trƣờng nuôi cấy đến sinh khối rễ tơ Đan sâm 
dòng A5.14 sau 4 tuần nuôi cấy 
Môi trƣờng 
Khối lƣợng rễ 
ban đầu (g) 
Khối lƣợng rễ tƣơi 
sau 4 tuần (g) 
Khối lƣợng rễ 
tăng (lần) 
Khối lƣợng rễ 
khô (g) 
MS 0,55 3,25 5,90 0,297 
B5 0,57 4,34 7,61 0,373
CV% 2,2 4,6 
LSD0,05 0,19 0,034 
 Từ 0,55 gram rễ nuôi cấy trên môi trƣờng B5, sau 4 tuần, khối lƣợng rễ 
tƣơi tăng 7,61 lần, đạt 4,34 gram và thu đƣợc 0,373 gram khối lƣợng rễ khô sau 
 73 
khi sấy. Trong khi đó, khối lƣợng rễ tƣơi tăng trên môi trƣờng MS là 5,90 lần, 
đạt 3,25 gram từ 0,55 gram rễ ban đầu sau 4 tuần nuôi cấy và thu đƣợc 0,297 
gram khối lƣợng rễ khô. Khi đƣợc nuôi cấy trên môi trƣờng B5, sinh khối rễ Đan 
sâm tƣơi cao hơn 28,6%, sinh khối rễ khô tăng 25,5% so với khi nuôi cấy trên 
môi trƣờng MS (Bảng 4.13). 
 Quan sát về hình thái cho thấy, rễ tơ Đan sâm trên môi trƣờng nền MS to 
và ít phân nhánh hơn rễ tơ Đan sâm trên môi trƣờng nền B5 (Hình 4.13). 
Hình 4.13. Ảnh hƣởng của môi trƣờng nuôi cấy đến sinh khối rễ tơ Đan sâm 
dòng A5.14 
 Sự khác biệt về sự tăng sinh khối rễ tơ trên môi trƣờng MS và B5 có thể giải 
thích là do sự khác nhau về thành phần dinh dƣỡng của hai loại môi trƣờng. Theo 
kết quả nghiên cứu của Sivakumar và cs. (2005), dinh dƣỡng khoáng là một trong 
những yếu tố quan trọng ảnh hƣởng đến sự sinh trƣởng và tăng sinh khối rễ tơ cây 
nhân sâm. Bensaddek và cs. (2001) nhận thấy hàm lƣợng ammonium cao trong môi 
trƣờng nuôi cấy rễ tơ cây A. belladonna làm giảm tốc độ tăng trƣởng của rễ tơ, trong 
khi đó hàm lƣợng nitrate cao làm giảm sự sinh tổng hợp và tích lũy alkaloid. Trong 
trƣờng hợp rễ tơ cây Đan sâm chúng tôi ghi nhận xu hƣớng tƣơng tự. Hàm lƣợng 
ammomium trong môi trƣờng MS cao hơn 20,3 lần so với hàm lƣợng ammonium 
trong môi trƣờng B5, có thể vì lý do này mà sinh khối rễ thu đƣợc trên môi trƣờng 
MS thấp hơn so với môi trƣờng B5. Trong năm môi trƣờng nền khảo sát gồm WPM, 
B5, N6, MS, ½ MS, Hsia và cs. (2007) nhận thấy môi trƣờng cho sinh khối rễ Đan 
sâm đạt cao nhất là môi trƣờng WPM, theo sau lần lƣợt là B5, MS, ½ MS và N6. Ở 
nghiên cứu này, trong hai môi trƣờng khảo sát là MS và B5, môi trƣờng B5 là thích 
hợp để nhân nuôi rễ tơ cây Đan sâm. Do vậy B5 đƣợc lựa chọn làm môi trƣờng nên 
để nhân nuôi rễ tơ Đan sâm ở những thí nghiệm sau. 
MS B5 
 74 
4.2.5. Ảnh hƣởng của trạng thái môi trƣờng đến sinh khối rễ tơ Đan sâm 
dòng A5.14 
 Trong nuôi cấy rễ in vitro, trạng thái môi trƣờng cũng có ảnh hƣởng rõ 
đến tốc độ tăng trƣởng của rễ. Trong nghiên cứu này, bốn trạng thái môi trƣờng 
thử nghiệm gồm rắn; bán lỏng; lỏng và nuôi cấy phân lớp với 25 ml môi trƣờng 
đặc ở dƣới, 25 ml môi trƣờng lỏng ở trên. Tốc độ tăng trƣởng rễ tơ trên môi 
trƣờng rắn cao nhất, theo sau là môi trƣờng bán lỏng; lỏng, tĩnh và kém nhất là 
trạng thái môi trƣờng phân lớp với khối lƣợng rễ tăng lần lƣợt là 7,67; 3,67; 3,08 
và 2,83 lần so với khối lƣợng rễ ban đầu sau 4 tuần nuôi cấy (Bảng 4.14). 
Bảng 4.14. Ảnh hƣởng của trạng thái môi trƣờng đến sinh khối rễ tơ 
Đan sâm dòng A5.14 sau 4 tuần nuôi cấy 
Trạng thái môi 
trƣờng 
Khối lƣợng 
rễ ban đầu (g) 
Khối lƣợng rễ tƣơi 
sau 4 tuần (g) 
Khối lƣợng rễ 
tăng (lần) 
Khối lƣợng 
rễ khô (g) 
Rắn 0,57 4,34 7,67 0,37
Bán lỏng 0,69 2,53 3,67 0,14 
Lỏng, tĩnh 0,73 2,25 3,08 0,11 
Phân lớp 0,77 2,18 2,83 0,11 
CV% 4,2 3,7 
LSD0,05 0,33 0,02 
Về mặt hình thái, rễ tơ Đan sâm có màu vàng, trắng, phân nhánh nhiều 
trên môi trƣờng nuôi cấy rắn nhƣng lại có xu hƣớng hóa đen và ít phân nhánh 
trên môi trƣờng bán lỏng, lỏng và phân lớp (Hình 4.14). 
Hình 4.14. Ảnh hƣởng của trạng thái môi trƣờng đến sinh khối rễ tơ Đan sâm 
 Hsia và cs. (2007) khảo sát ảnh hƣởng của môi trƣờng nuôi cấy rắn và lỏng, 
lắc 100 vòng/phút đến sự tăng sinh khối rễ tơ Đan sâm và nhận thấy rễ tơ nuôi cấy 
trên môi trƣờng lỏng, lắc cho khối lƣợng tƣơi cao gấp 3 lần và khối lƣợng khô cao 
gấp 6 lần so với rễ tơ nuôi cấy trên môi trƣờng đặc. Tuy nhiên trong nghiên cứu 
B5 rắn B5 bán lỏng B5 lỏng B5 phân lớp 
 75 
này, môi trƣờng đặc cho hiệu quả nuôi cấy rễ tơ Đan sâm cao hơn so với ba 
phƣơng thức nuôi cấy còn lại có thể do nuôi cấy trong môi trƣờng bán lỏng; lỏng, 
tĩnh hay phân lớp; rễ tơ Đan sâm ngập chìm trong môi trƣờng do vậy rễ không 
đƣợc thoáng khí, giảm sự trao đổi khí. Có thể vì lý do này mà một số mẫu rễ xuất 
hiện hiện tƣợng trƣơng nƣớc, một số rễ bị chết. Nhƣ vậy, trong điều kiện không có 
máy lắc, cần sử dụng môi trƣờng đặc cho nhân nuôi thu sinh khối rễ tơ. 
4.2.6. Ảnh hƣởng của loại bình nuôi cấy đến sinh khối rễ tơ Đan sâm dòng 
A5.14 
 Với mục đích xác định đƣợc chủng loại bình nuôi cấy có giá thành hạ 
nhƣng vẫn cho tốc độ tăng trƣởng rễ tơ cao, đề tài thử nghiệm 4 loại bình nuôi 
cấy gồm bình trụ, bình tam giác, bình chữ nhật và túi nilon. Các loại bình nuôi 
cấy khác nhau có ảnh hƣởng khác nhau đến sự tăng sinh khối rễ tơ sau 10 tuần 
nuôi cấy. Trong các loại bình nuôi cấy, khối lƣợng rễ tơ tăng đạt cao nhất (15,90 
lần) khi nuôi cấy trong bình tam giác 500 ml, theo sau là túi nilon với khối lƣợng 
rễ tăng 14,70 lần sau 10 tuần nuôi cấy, khối lƣợng rễ tơ tăng đạt thấp nhất (9,70 
lần) khi nuôi cấy rễ trong bình chữ nhật 750 ml (Bảng 4.15). 
Bảng 4.15. Ảnh hƣởng của các loại b nh nuôi đến sự tăng sinh khối rễ tơ 
dòng A5.14 sau 10 tuần nuôi cấy 
Loại bình 
Khối lƣợng 
rễ ban đầu 
(g) 
Khối lƣợng rễ 
tƣơi sau 10 tuần 
(g) 
Khối lƣợng 
rễ tăng 
(lần) 
Khối lƣợng 
rễ khô 
(g) 
Bình trụ 250 ml 0,84 11,97 14,25 0,703 
Bình tam giác 500 ml 0,83 13,12 15,90 0,837 
Bình chữ nhật 750 ml 0,85 8,25 9,70 0,547 
Túi nilon 13 x 25 cm 0,85 12,95 14,70 0,757 
CV% 1,5 4,3 
LSD0,05 0,38 0,06 
Hình 4.15. Ảnh hƣởng của loại bình nuôi cấy đến sinh khối rễ tơ Đan sâm 
Bình trụ Bình tam 
giác 
Túi nilon Bình chữ nhật 
 76 
Tốc độ rễ tăng cao nhất khi nuôi cấy trong bình tam giác có thể giải thích 
là do diện tích bề mặt rễ tiếp xúc với môi trƣờng và khả năng thu nhận ánh sáng 
của rễ là lớn nhất. Tuy nhiên, sử dụng túi nilon để nuôi cấy rễ tơ cho hiệu quả 
kinh tế cao hơn do giá thành thấp cũng nhƣ tiết kiệm điện năng trong quá trình 
chuẩn bị môi trƣờng. Do sự khác biệt không đáng kể về khối lƣợng rễ khi nuôi 
cấy trong túi nilon, bình tam giác cũng nhƣ bình trụ, có thể sử dụng túi nilon để 
nuôi cấy rễ tơ Đan sâm để nâng cao hiệu quả kinh tế khi sản xuất ở quy mô lớn. 
4.2.7. Ảnh hƣởng của điều kiện chiếu sáng đến sự tăng trƣởng và sự tích lũy 
hoạt chất mục tiêu của dòng rễ tơ Đan sâm A5.14 
 Theo nghiên cứu của Fett-Neto và cs. (1993), ngoài tác động lên sự hình 
thành và tăng sinh của tế bào thực vật trong quá trình nuôi cấy, ánh sáng còn ảnh 
hƣởng đến sự sinh tổng hợp các hợp chất thứ cấp do liên quan đến hoạt động của 
các enzyme nội bào. Theo nghiên cứu của Lê Thị Thủy Tiên và cs. (2010), sự tăng 
trƣởng của mô sẹo và huyền phù tế bào từ thân non cây thông đỏ Lâm Đồng nuôi 
cấy trong điều kiện chiếu sáng tăng trƣởng chậm hơn so với khi nuôi cấy trong điều 
kiện tối. Tuy nhiên sự tích lũy hoạt chất mục tiêu taxol thì ngƣợc lại, điều kiện chiếu 
sáng kích thích sự sinh tổng hợp taxol của tế bào hơn điều kiện tối. Để tìm hiểu ảnh 
hƣởng của điều kiện chiếu sáng đến sự tăng trƣởng và sự tích lũy hoạt chất mục tiêu 
của rễ tơ Đan sâm, 5 điều kiện chiếu sáng khác nhau đã đƣợc áp dụng trong 8 tuần 
nuôi cấy rễ tơ cây Đan sâm. Kết quả về sự tăng trƣởng và tích lũy hoạt chất mục tiêu 
đƣợc trình bày ở bảng 4.16 và 4.17. 
Bảng 4.16. Ảnh hƣởng của điều kiện chiếu sáng đến sinh khối rễ tơ 
dòng A5.14 sau 8 tuần nuôi cấy 
Điều kiện chiếu sáng 
Khối lƣợng 
rễ ban đầu (g) 
Khối lƣợng 
rễ tƣơi (g) 
Khối lƣợng 
rễ tăng (lần) 
Khối lƣợng 
rễ khô (g) 
8 tuần tối