Luận án Nghiên cứu ứng dụng vi khuẩn bacillus sp. đối kháng với vibrio parahaemolyticus trong nuôi tôm công nghiệp

.2v - Không màu 
 58 
18 BĐB8.2v + Tím 
19 BĐB11.1v - Trắng 
20 BĐB11.2v - Không màu 
21 BRB1.1v - Không màu 
22 BRB1.2v - Trắng 
23 BĐB1.3v + Tím 
24 BĐB6.4v - Trắng 
25 BĐK7.2v + Tím 
26 CĐK1.1v - Không màu 
27 CRK1.2v - Trắng 
28 CRB1.2v - Không màu 
29 CNK3.1v - Trắng 
30 CNK4v + Tím 
31 BĐB1.4v + Tím 
4.2.2 Phát hiện gen độc lực tdh 
 Để xác định trong tập hợp 31 chủng Vibrio đã lựa chọn, có chủng nào có 
khả năng sinh độc tố TDH, phương pháp PCR với cặp mồi đặc hiệu L-tdh và R-
tdh đã được sử dụng. Kết quả ở Hình 4.3 cho thấy cả 31 chủng Vibrio thử nghiệm 
đều âm tính với gen tdh. Chứng dương PCR vẫn cho băng sản phẩm có kích 
thước phù hợp với tính toán lý thuyết (269 bp). Do vậy, có thể kết luận toàn bộ 
các chủng Vibrio được thử nghiệm đều không mang gen độc lực tdh. Kết quả này 
cũng khá phù hợp với các công bố trước đây khi tỷ lệ chủng V. parahaemolyticus 
phân lập từ các mẫu môi trường dương tính với tdh thường rất thấp (khoảng 1-
2%) (Asgarpoor et al., 2018). Kết quả này cũng phù hợp nghiên cứu của Nguyễn 
Văn Duy và Nguyễn Thị Cẩm Ly (2012), không phát hiện các gen tdh và trh từ 
các chủng Vibrio phân lập từ mẫu hải sản từ Việt Nam. 
 59 
Hình 4.3 Kết quả PCR khuếch đại gen tdh từ 31 chủng Vibrio phân lập được. 
Đường chạy 1-31: sản phẩm PCR lần lượt của các chủng BNB1.1v; BNB3.1v; BNB3.2v; 
BNB3.3v; BNK7v; BNK10v; CNB5v; CNB6v; BRB5.2v; CRB1.1v; CRB3.1v; CRB3.2v; 
BĐB1.1v; BĐB1.2v; BĐB5.1v; BĐB6.1v; BĐB6.2v; BĐB8.2v; BĐB11.1v; BĐB11.2v; BRB1.1v; 
BRB1.2v; BĐB1.3v; BĐB6.4v; BĐK7.2v; CĐK1.1v; CRK1.2v; CRB1.2v; CNK3.1v; CNK4v; 
BĐB1.4v; 32: DNA dương tính chủng V. parahaemolyticus gây AHPND; (-): chứng âm PCR; 
(+): chứng dương PCR; M: HighRanger 1 kb DNA Ladder (Norgen) 
4.2.3 Phát hiện gen độc lực trh 
 Tương tự như gen tdh, cả 31 chủng Vibrio thử nghiệm đều âm tính với gen 
trh (Hình 4.4). Chứng dương PCR vẫn cho băng sản phẩm có kích thước phù hợp 
với tính toán lý thuyết là khoảng 500 bp. Do vậy, có thể kết luận toàn bộ các 
chủng Vibrio được thử nghiệm đều không mang gen độc lực trh. Kết quả này 
cũng phù hợp với các công bố trước đây khi tỷ lệ chủng V. parahaemolyticus 
phân lập từ các mẫu môi trường dương tính với trh thường rất thấp (Asgarpoor et 
al., 2018). 
Hình 4.4 Kết quả PCR khuếch đại gen trh từ 31 chủng Vibrio phân lập được. 
Đường chạy 1-31: sản phẩm PCR lần lượt của các chủng BNB1.1v; BNB3.1v; BNB3.2v; 
BNB3.3v; BNK7v; BNK10v; CNB5v; CNB6v; BRB5.2v; CRB1.1v; CRB3.1v; CRB3.2v; 
BĐB1.1v; BĐB1.2v; BĐB5.1v; BĐB6.1v; BĐB6.2v; BĐB8.2v; BĐB11.1v; BĐB11.2v; BRB1.1v; 
BRB1.2v; BĐB1.3v; BĐB6.4v; BĐK7.2v; CĐK1.1v; CRK1.2v; CRB1.2v; CNK3.1v; CNK4v; 
BĐB1.4v; 32: DNA dương tính chủng V. parahaemolyticus gây AHPND; (-): chứng âm PCR; 
(+): chứng dương PCR; M: HighRanger 1 kb DNA Ladder (Norgen) 
 60 
4.2.4 Phát hiện gen độc lực pirA 
 Để xác định khả năng sinh độc tố PirA của tập hợp 31 chủng Vibrio đã lựa 
chọn, phương pháp PCR với cặp mồi đặc hiệu VpPirA-284F và VpPirA-284R đã 
được áp dụng. Kết quả (Hình 4.5) cho thấy chỉ có chủng V. parahaemolyticus 
BĐB1.4v (giếng 31) là dương tính với gen pirA (băng sản phẩm có kích thước 
gần với tính toán lý thuyết là 284 bp tương tự như các mẫu dương tính). Đây là 
chủng V. parahaemolyticus được phân lập từ mẫu bùn của một ao bệnh từ Bạc 
Liêu. Do vậy, đây rất có thể là chủng đã gây AHPND cho ao tôm này. Tuy nhiên, 
như đã trình bày ở phần Tổng quan, để có thể gây ra triệu chứng điển hình của 
AHPND, cần sự có mặt của cả hai gen pirA và pirB mã hóa cho độc tố nhị thể 
PirA/PirB. Do vậy, trong nội dung tiếp theo, sự có mặt của gen pirB tiếp tục được 
phát hiện bằng kỹ thuật PCR. 
Hình 4.5 Kết quả PCR khuếch đại gen pirA từ 31 chủng Vibrio phân lập được. 
Đường chạy 1-31: sản phẩm PCR lần lượt của các chủng BNB1.1v; BNB3.1v; BNB3.2v; 
BNB3.3v; BNK7v; BNK10v; CNB5v; CNB6v; BRB5.2v; CRB1.1v; CRB3.1v; CRB3.2v; 
BĐB1.1v; BĐB1.2v; BĐB5.1v; BĐB6.1v; BĐB6.2v; BĐB8.2v; BĐB11.1v; BĐB11.2v; BRB1.1v; 
BRB1.2v; BĐB1.3v; BĐB6.4v; BĐK7.2v; CĐK1.1v; CRK1.2v; CRB1.2v; CNK3.1v; CNK4v; 
BĐB1.4v; 32: DNA dương tính chủng V. parahaemolyticus gây AHPND; (-): chứng âm PCR; 
(+): chứng dương PCR; Đường chạy M: 50bp DNA markers (Bioland Scientific LLC) 
4.2.5 Phát hiện gen độc lực pirB 
 Kết quả phát hiện gen pirB bằng PCR (Hình 4.6) cho thấy chủng BĐB1.4v 
là cho băng sản phẩm có kích thước phù hợp với tính toán lý thuyết (392 bp). Bên 
cạnh đó, hai mẫu BĐB11.1v (giếng 19) và CRK1.2v (giếng 27) cũng cho băng 
sản phẩm gần với tính toán lý thuyết. Do vậy, các sản phẩm PCR này đã được 
điện di lại một lần nữa cùng với các mẫu dương tính. Kết quả điện di (Hình 4.7) 
cho thấy chỉ có duy nhất mẫu BĐB1.4v là cho sản phẩm PCR có kích thước phù 
hợp. Các kết quả tách dòng và giải trình tự gen các sản phẩm PCR của các hai 
 61 
mẫu BDB11.1v và CRK1.2v cho thấy đây là các trình tự gen thuộc thể gen của V. 
parahaemolyticus, hoàn toàn không có liên quan đến gen pirB. 
Hình 4.6 Kết quả PCR khuếch đại gen pirB từ 31 chủng Vibrio phân lập được 
Đường chạy 1-31: sản phẩm PCR lần lượt của các chủng BNB1.1v; BNB3.1v; BNB3.2v; 
BNB3.3v; BNK7v; BNK10v; CNB5v; CNB6v; BRB5.2v; CRB1.1v; CRB3.1v; CRB3.2v; 
BĐB1.1v; BĐB1.2v; BĐB5.1v; BĐB6.1v; BĐB6.2v; BĐB8.2v; BĐB11.1v; BĐB11.2v; BRB1.1v; 
BRB1.2v; BĐB1.3v; BĐB6.4v; BĐK7.2v; CĐK1.1v; CRK1.2v; CRB1.2v; CNK3.1v; CNK4v; 
BĐB1.4v; 32: DNA dương tính chủng V. parahaemolyticus gây AHPND; (-): chứng âm PCR; 
M1: HighRanger 1 kb DNA Ladder (Norgen); M2: 50bp DNA markers (Bioland Scientific LLC) 
Hình 4.7 Kết quả điện di lại sản phẩm PCR khuếch đại gen pirB từ các mẫu 
BDB11.1v (19); CRK1.2v (27); BĐB1.4v (31) 
32: DNA dương tính chủng V. parahaemolyticus gây AHPND; (-): chứng âm PCR; (+): chứng 
dương PCR; M: HighRanger 1 kb DNA Ladder (Norgen). 
 Tóm lại trong tập hợp 31 chủng vi khuẩn Vibrio được lựa chọn, có 12 chủng 
là V. parahaemolyticus trong đó 2 chủng có nguồn gốc từ ao khỏe và 10 chủng có 
nguồn gốc từ ao bệnh. Trong các chủng V. parahaemolyticus phân lập từ ao bệnh, 
chỉ có duy nhất chủng BĐB1.4v, phân lập từ Bạc Liêu, là dương tính với cả hai 
gen pirA/pirB. Đây rất có thể là chủng gây AHPND tại ao nuôi tôm này trong 
thời gian trước. Toàn bộ các chủng thử nghiệm đều âm tính với các gen độc lực 
tdh và trh. 
 62 
4.3 Nghiên cứu ảnh hưởng của nhiệt độ, độ mặn, pH đến sự phát triển của 
V. parahaemolyticus 
4.3.1 Ảnh hưởng của nhiệt độ đến sự phát triển của chủng vi khuẩn V. 
parahaemolyticus BĐB1.4v 
Kết quả khảo sát ảnh hưởng của nhiệt độ nuôi cấy đến mật độ của chủng vi 
khuẩn V. parahaemolyticus BĐB1.4v đạt được sau 24 và 48 giờ nuôi cấy (Bảng 
4.3) cho thấy mật độ vi khuẩn đạt giá trị cao nhất ở nhiệt độ 37oC (8,59 log 
cfu/ml) sau 48 giờ. Dựa vào các số liệu ở thời điểm 24 giờ, khoảng nhiệt độ sinh 
trưởng tối ưu của chủng vi khuẩn này là từ 30-37ºC. Kết quả này khá phù hợp với 
các nghiên cứu của Beuchat (1975). Tuy nhiên, sau 48 giờ, mật độ của chủng vi 
khuẩn V. parahaemolyticus BĐB1.4v là tương đương nhau trong khoảng nhiệt độ 
từ 26 đến 37ºC (P > 0,05). Điều này có thể được giải thích là sau 48 giờ nuôi cấy, 
mật độ của chủng vi khuẩn V. parahaemolyticus BĐB1.4v đã đạt đến giai đoạn 
bão hòa. 
Bảng 4.3 Mật độ (Log cfu/ml) của V. parahaemolyticus BĐB1.4v ở các mức 
nhiệt độ khác nhau sau 24 và 48 giờ nuôi cấy 
Nhiệt độ 
 Thời gian 
26oC 30oC 37oC 
24h 8,21±0,12a 8,55±0,13b 8,39±0,19ab 
48h 8,43±0,06a 8,46±0,18a 8,59±0,26a 
Giá trị thể hiện là các giá trị trung bình±độ lệch chuẩn. Các giá trị trong cùng một hàng có mang chữ cái 
khác nhau thì khác biệt có ý nghĩa thống kê (p < 0,05). 
Một số nghiên cứu cho thấy chủng V. parahaemolyticus không thể phát 
triển ở nhiệt độ thấp. Cook (1994) nhận định rằng V. parahaemolyticus không có 
khả năng phát triển trong nước ngọt hoặc nước biển ở nhiệt độ dưới 10°C, Kim et 
al. (2012) ghi nhận chủng V. parahaemolyticus 33844 có nhiệt độ tăng trưởng tối 
thiểu là 13°C. Ngoài ra, tác giả cũng nhận thấy một số chủng Vibrio khác như V. 
vulnificus phân lập từ hàu và sashimi và V. vulnificus ATCC 27562 cũng có nhiệt 
độ tăng trưởng tối thiểu là 11°C. Những kết quả này cho thấy khi được bảo quản 
ở nhiệt độ thấp <10°C sẽ kiểm soát sự phát triển của Vibrio sp. ngay cả trên các 
loại thực phẩm tươi sống (hàu hay sashimi). Trong nghiên cứu này, ở nhiệt độ từ 
26oC đến 37oC, chủng V. parahaemolyticus BĐB1.4v đã phát triển mạnh và đạt 
mật độ cao sau 24 giờ nuôi cấy. 
 63 
Theo Van and Scarpa (1999) nhiệt độ tốt nhất cho sự phát triển của tôm thẻ 
chân trắng là khoảng 24-32oC. Khi nuôi tôm ở nhiệt độ thấp sẽ làm giảm khả 
năng tăng trưởng của tôm. Tuy nhiên, khoảng nhiệt độ này trùng với khoảng 
nhiệt độ mà vi khuẩn V. parahaemolyticus có thể sinh trưởng mạnh. Do đó, việc 
kiểm soát yếu tố nhiệt độ để ức chế vi khuẩn V. parahaemolyticus trong môi 
trường nuôi tôm là khó có thể thực hiện được. 
4.3.2. Ảnh hưởng của pH đến sự phát triển của chủng vi khuẩn V. 
parahaemolyticus BĐB1.4v 
Kết quả khảo sát ảnh hưởng của pH nuôi cấy đến mật độ của chủng vi 
khuẩn V. parahaemolyticus BĐB1.4v đạt được sau 24 và 48 giờ nuôi cấy (Bảng 
4.4) cho thấy mật độ vi khuẩn đạt giá trị cao nhất ở pH 8,0 (8,42 log cfu/mL) sau 
48 giờ nuôi cấy, khác biệt có ý nghĩa (P < 0,05) so với các giá trị mật độ đạt được 
tại pH 5,0 và 6,0. Beuchat (1975) cũng nhận định pH tối ưu cho sự phát triển của 
vi khuẩn V. parahaemolyticus là 7,6 – 8,6. Ở giá trị pH axít 5,0, sau 24 giờ nuôi 
cấy, không ghi nhận sự có mặt của V. parahaemolyticus, chứng tỏ chủng vi 
khuẩn BĐB1.4v đã bị tiêu diệt ở pH này. Nghiên cứu tương tự của Vanderzant 
and Nickelson (1972) cho thấy khi nuôi cấy V. parahaemolyticus trong môi 
trường lỏng với pH = 5,0 thì vi khuẩn này cũng không sống sót. 
Theo Boyd et al. (2002), khoảng pH tối ưu cho sự phát triển của tôm thẻ 
chân trắng là 7,7 – 8,5 và đây cũng là vùng pH mà chủng V. parahaemolyticus 
BĐB1.4v trong nghiên cứu này phát triển tốt nhất. Do đó, tương tự như nhiệt độ, 
việc khống chế sự phát triển của vi khuẩn V. parahaemolyticus bằng cách kiểm 
soát pH cũng rất khó để thực hiện. 
Bảng 4.4 Mật độ (Log cfu/mL) của vi khuẩn V. parahaemolyticus BĐB1.4v trong 
các nghiệm thức pH khác nhau sau 24 và 48 giờ nuôi cấy 
pH 
 Thời gian 
5,0 6,0 7,0 8,0 
24h Âm tínha 7,32±0,11b 7,61±0,52b 7,32±0,19b 
48h Âm tínha 7,53±0,19b 8,12±0,25bc 8,42±0,09bc 
Giá trị thể hiện là các giá trị trung bình±độ lệch chuẩn. Các giá trị trong cùng một hàng có mang chữ cái 
khác nhau thì khác biệt có ý nghĩa thống kê (p<0,05). 
 64 
4.3.3 Ảnh hưởng của độ mặn đến sự phát triển của chủng vi khuẩn V. 
parahaemolyticus BĐB1.4v 
Kết quả khảo sát ảnh hưởng của độ mặn lên mật độ của chủng vi khuẩn V. 
parahaemolyticus BĐB1.4v sau 24 và 48 giờ nuôi cấy (Bảng 4.5) cho thấy mật 
độ vi khuẩn đạt giá trị cao nhất trong khoảng độ mặn từ 20 - 40‰ sau 48 giờ nuôi 
cấy, khác biệt có ý nghĩa (P < 0,05) so với các độ mặn thấp hơn từ 0‰ đến 10‰. 
Chủng V. parahaemolyticus BĐB1.4v không phát triển được trong khoảng độ 
mặn từ 0‰ đến 5‰. 
Nhiều nghiên cứu đã chỉ ra rằng độ mặn có ảnh hưởng mạnh đến sự phát 
triển của Vibrio. Phần lớn các loài Vibrio chuyển động được nhờ roi, tốc độ 
chuyển động của vi khuẩn phụ thuộc vào nồng độ Na+ trong môi trường (Atsumi 
et al., 1990). Vi khuẩn V. parahaemolyticus là loài ưa muối, độ mặn cho sự phát 
triển tốt nhất của V. parahaemolyticus là 30‰ (Miles et al., 1997; Liu et al., 
2008; Yang et al., 2009; Baker-Austin et al., 2010; Fernandez-Piquer et al., 
2011). Vibrio parahaemolyticus cần có độ mặn, hàm lượng ion Na+ cho sự phát 
triển. Giới hạn độ mặn cho sự phát triển của V. parahaemolyticus là 20 -70‰, 
khoảng tối ưu là 20 - 40‰ (Beuchat, 1973). Trong môi trường nước ngọt (độ 
mặn 0‰), V. parahaemolyticus bị bất hoạt hoàn toàn. 
Tôm thẻ chân trắng có khả năng điều hòa áp suất thẩm thấu tốt giúp chúng 
có thể sống được trong môi trường nước có độ mặn khác nhau dao động từ 0,5 – 
40‰ (Bray et al., 1994; Saoud et al., 2003). Ngoài ra, một số nghiên cứu cũng đã 
cho thấy tôm thẻ chân trắng tăng trưởng tốt ở độ mặn khá thấp từ 10 – 15‰ (Đào 
Văn Trí, 2002; Trần Văn Quỳnh, 2004). 
Kết quả trong nghiên cứu này cho thấy sự phát triển của chủng V. 
parahaemolyticus BĐB1.4v bị ức chế ở độ mặn 0 - 10‰ nhưng tôm thẻ chân 
trắng có thể phát triển tốt ở độ mặn 10-15‰, do đó nuôi tôm thẻ ở độ mặn thấp 
khoảng 10‰ có thể hạn chế sự phát triển của vi khuẩn V. parahaemolyticus. 
 65 
Bảng 4.5 Mật độ (Log cfu/ml) của V. parahaemolyticus BĐB1.4v ở các độ mặn 
khác nhau sau 24 và 48 giờ nuôi cấy 
Độ mặn 
 Thời gian 
0‰ 5‰ 10‰ 20‰ 30‰ 40‰ 
24 giờ Âm tínha Âm tínha 0,30±0,30b 7,46±0,18c 8,11±0,19d 8,11±0,08d 
48 giờ Âm tínha Âm tínha 0,57±0,51b 8,39±0,09c 8,45±0,07c 8,25±0,12c 
Giá trị thể hiện là các giá trị trung bình±độ lệch chuẩn. Các giá trị trong cùng một hàng có mang chữ cái 
khác nhau thì khác biệt có ý nghĩa thống kê (p<0,05). 
4.4 Phân lập các chủng thuộc chi Bacillus trong ao nuôi tôm công nghiệp 
Để sàng lọc các chủng Bacillus có tính đối kháng cao với V. 
parahaemolyticus, 149 chủng có khả năng tạo bào tử đã được phân lập từ 29 ao 
nuôi tôm công nghiệp (Bảng 4.6). Số lượng chủng này tương đương với các 
nghiên cứu đã công bố về việc phân lập các chủng vi khuẩn đối kháng sử dụng 
làm probiotic hoặc tác nhân kiểm soát sinh học. Từ 109 chủng phân lập từ mẫu 
nước, bùn, và ruột cá vược, Ravi et al. (2007) đã phân lập được 3 chủng 
Paenibacillus sp., B. cereus, và P. polymyxa từ mẫu bùn có hoạt tính đối kháng 
cao đối với V. harveyi và V. vulnificus. Từ 198 chủng phân lập từ mẫu nước, bùn, 
và tuyến gan tụy tôm thẻ chân trắng, Mirbakhsh et al. (2013) đã phân lập được 2 
chủng B. subtilis và B. vallismortis từ tuyến gan tụy tôm có hoạt tính đối kháng 
V. harveyi. Từ 42 chủng phân lập từ nước biển, Galaviz-Silva et al., 2018 phân 
lập được 15 chủng Bacillus và Virgibacillus có hoạt tính đối kháng 
Staphylococcus aureus và V. parahaemolyticus. 
Bảng 4.6 Kết quả phân lập chủng vi khuẩn nghi ngờ là Bacillus 
Tỉnh 
Số chủng vi khuẩn Bacillus phân lập được 
Mẫu nước Mẫu bùn Mẫu tôm 
Bạc Liêu 17 28 21 
Cà Mau 14 20 12 
Sóc Trăng 10 15 12 
Tổng 41 63 45 
 66 
Hình thái đại diện các khuẩn lạc nghi ngờ là Bacillus sp. được trình bày ở 
các Hình 4.8 và Phụ lục C. Có thể nhận thấy hình thái các khuẩn lạc đã phân lập 
được khá đa dạng với màu sắc biến đổi từ trắng trong, trắng đục đến vàng hoặc 
xanh; hình dạng từ tròn nguyên đến tròn răng cưa hoặc chia thùy, kích thước 
khuẩn lạc sau 24 giờ ủ tại 37ºC biến đổi từ 1 đến 8 mm. 
Quy trình phân lập Bacillus trong nghiên cứu này sử dụng bước xử lý 
nhiệt ở 80ºC như là tác nhân chọn lọc để loại bỏ các vi khuẩn không chịu nhiệt và 
kích hoạt sự nảy chồi của nội bào tử Bacillus. Do vậy, về mặt bản chất, quy trình 
phân tích được sử dụng cho phép phân lập chủ yếu các bào tử có trong môi 
trường ao nuôi tôm. Để xác định chính xác liệu các chủng vi khuẩn đã phân lập 
có thuộc chi Bacillus hay không cần tiến hành các phép thử kiểu hình với bộ tiêu 
chí phức tạp (33 chỉ tiêu) hoặc đơn giản hơn là thực hiện việc giải trình tự 16S 
rDNA. Tuy nhiên, từ tính đa dạng hình thái khuẩn lạc như trên, có thể kết luận sơ 
bộ là tập hợp các chủng vi khuẩn tạo bào tử đã phân lập được là khá đa dạng, tạo 
tiền đề để phân lập được các chủng vi khuẩn Bacillus có tính đối kháng cao với 
V. parahaemolyticus. 
Hình 4.8: Hình khuẩn lạc của vi khuẩn Bacillus phân lập tại Bạc Liêu, Sóc Trăng 
và Cà Mau 
 67 
4.5 Tuyển chọn chủng vi khuẩn Bacillus sp. có hoạt tính sinh học ứng dụng 
trong nuôi tôm công nghiệp 
4.5.1 Tuyển chọn chủng vi khuẩn Bacillus sp. có hoạt tính đối kháng V. 
parahaemolyticus 
Để tuyển chọn được các chủng Bacillus sp. có khả năng ức chế được V. 
parahaemolyticus nói chung và đặc biệt là chủng V. parahaemolyticus gây 
AHPND, phương pháp khuếch tán trên đĩa thạch đã được áp dụng với các chủng 
vi khuẩn kiểm định là 5 chủng V. parahaemolyticus được phân lập từ ao bệnh 
BNB3.1v, BĐB1.4v, BĐB1.1v, CNB6v và BĐB1.3v. Năm chủng Vibrio được sử 
dụng đều là V. parahaemolyticus có nguồn gốc từ ao bệnh, trong đó có chủng 
BRB1.4v mang cả hai gen pirA/pirB mã hóa độc tố nhị thể gây AHPND. 
Trong luận án này, từ 149 chủng vi khuẩn nghi ngờ là Bacillus, 130 chủng 
được lựa chọn dựa trên hoạt tính catalase dương tính. Các kết quả sàng lọc bằng 
phương pháp khuếch tán trên đĩa thạch cho thấy chỉ có 6/130 (4,6%) chủng thử 
nghiệm là có hoạt tính đối kháng V. parahaemolyticus đáng kể (D-d≥ 2 mm) 
(Hình 4.9). Kết quả này khá phù hợp với các nghiên cứu được liệt kê ở trên 
(Galaviz-Silva et al., 2018; Mirbakhsh et al., 2013; Ravi et al., 2007). Trong số 6 
chủng này, hai chủng vi khuẩn BRB2.1 (phân lập từ tuyến tiêu hóa tôm của một 
ao bệnh từ Bạc Liêu) và BĐK2.3 (phân lập từ mẫu bùn của một ao khỏe từ Bạc 
Liêu) có hoạt tính kháng 5 chủng V. parahaemolyticus cao hơn 4 chủng còn lại 
(Hình 4.10, Phụ lục A2). Riêng đối với chủng V. parahaemolyticus BĐB1.4v 
mang cả hai gen pirA/pirB, chủng Bacillus BRB2.1 thể hiện hoạt tính đối kháng 
cao nhất (Hình 4.9 và Hình 4.10) với đường kính vòng kháng khuẩn đạt giá trị 
13,3 mm cao nhất và khác biệt ý nghĩa thống kê (P < 0,05) so với các chủng còn 
lại. Do vậy, hai chủng BRB2.1 và BĐK2.3 được lựa chọn cho các thử nghiệm 
kháng V. parahaemolyticus trong các quy mô 100 L và 1000 L sau này. 
 68 
Hình 4.9 Vòng kháng khuẩn của 6 chủng BRB2.1, BĐK2.3, BNK 6.1, BRK4.4, 
BNK7.1, BĐB11.1 trên đĩa thạch với vi khuẩn kiểm định là chủng V. 
parahaemolyticus BĐB1.4v 
Hình 4.10 Khả năng đối kháng V. parahaemolyticus của 6 chủng nghi là Bacillus. 
Thanh sai số thể hiện giá trị độ lệch chuẩn. 
4.5.2 Tuyển chọn chủng vi khuẩn Bacillus sp. có hoạt tính sinh protease cao 
Từ tập hợp 130 chủng vi khuẩn nghi là Bacillus sp. nói trên, tiến hành lựa 
chọn 30 chủng đại diện (nguồn gốc khác nhau) để cấy trên môi trường thạch SM 
(Himedia) để sàng lọc các chủng có khả năng sinh protease có hoạt tính cao. Kết 
quả phân tích (Hình 4.11, Hình 4.12, Phụ lục A3) cho thấy 29/30 chủng thử 
nghiệm có khả năng tiết protease trên môi trường thạch SM. Chủng BRK5.3 
không có hoạt tính protease (Hình 4.11) rất có thể là do không phát triển được 
 69 
trên môi trường SM. Ba chủng BNB1.1, BNB1.2 và BNK2.2 phân