Luận án Nghiên cứu ứng dụng vi sinh vật nội sinh để tăng cường tính kích kháng đối với bệnh khô cành ngọn keo tai tượng tại một số vùng sinh thái chính ở miền Bắc Việt Nam

gây bệnh khô cành ngọn Keo tai tượng bằng phương pháp sinh học phân tử.
	Tách chiết ADN: VK nội sinh được nuôi cấy 2 ngày trên môi trường thích hợp. Lấy 1 vòng que cấy tế bào vào ống eppendorf vô trùng, thêm 500 µl 2×SSC vào mỗi ống. Lắc đều và giữ ở 990C trong 10 phút. Ly tâm 13000 vòng/phút trong 2 phút. Hút bỏ phần dịch và tiến hành rửa tế bào 1 lần bằng nuớc cất vô trùng. Thêm khoảng 100 µl hạt thủy tinh có đường kính 0,2 - 0,5 mm (Roth, Đức), 100 µl dung dịch phenol/chloroform (tỉ lệ 1:1) và 100 µl nước cất vô trùng. Lắc ở 1400 vòng/phút trong 10 phút trên máy Thermocomfort (Eppendorf, Đức) sau đó ly tâm 13000 vòng/phút trong 10 phút. Lấy phần dịch trong phía trên có chứa ADN làm khuôn cho phản ứng PCR. ADN sau khi tách chiết được giữ ở -200C.
	Định tên vi khuẩn nội sinh bằng giải trình tự nucleotide: Phân đoạn 16S rADN của vi khuẩn nội sinh được phản ứng trên thiết bị GeneAmp® PCRSystem 9700 (PE Applied Biosystem, Mỹ) sử dụng cặp mồi 16S-8F (5’AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3’) và 16S1510R (5’-GGCTACCTTGTTACGA-3’). Chương trình nhiệt được thiết lập với pha biến tính ở 940C trong 2 phút kế tiếp là 35 chu kỳ nhiệt (940C trong 30 giây, 520C trong 30 giây và 720C trong 1 phút). Quá trình phản ứng được hoàn tất ở 720C trong 7 phút và sau đó sản phẩm PCR được bảo quản ở 100C. Sản phẩm PCR sau khi phản ứng được tinh chế bằng QIAEX II (Qiagen, Đức) theo khuyến cáo của hãng. 
Trình tự ADN được đọc bằng phương pháp “dideoxy chain termination” với việc sử dụng kit AmpliTaq (Amersham) theo hướng dẫn của hãng. Máy đọc trình tự, model 377 của hãng Applied Biosystem được sử dụng. Các chuỗi ADN được so sánh với GeneBank thông qua giao diện tìm kiếm BLAST nucleotide-nucleotide đặt tại National Center for Biotechnology Information, Bethesda, Mỹ ( Các chuỗi liên quan được chuyển tải về sau đó xử lý bằng phần mềm BioEdit và so sánh bằng ClustalX (Thompson et al., 1994)[105]. Cây tiến hóa được hiển thị bằng phần mềm TreeExplorer.
2.3.2.3. Vi khuẩn nội sinh kích kháng bệnh đốm lá khô cành ngọn Keo tai tượng
- Phương pháp xác định thành phần và mật độ vi khuẩn nội sinh ở cây chủ với các cấp bị bệnh khác nhau: 
+ Xác định thành phần các chủng VK nội sinh dựa vào hình dạng, màu sắc, kích thước, khả năng sinh trưởng của chúng.
+ Xác định mật độ VK nội sinh ở cây chủ với các cấp bị bệnh khác nhau: Lấy 1ml dung dịch VK nội sinh của mỗi chủng pha loãng với 9 ml nước cất đã hấp khử trùng theo phương pháp pha loãng tới hạn. Lấy 1 ml dịch khuẩn đã pha loãng trang trên 3 hộp lồng chứa môi trường PDA. Đặt các hộp lồng đã cấy trong tủ định ôn ở 280C trong 48 giờ. Đếm số lượng khuẩn lạc thu được trên các hộp lồng tính theo CFU/ml.
- Thí nghiệm invitro
	Năm (5) chủng VK nội sinh có hoạt tính cao, nhân sinh khối riêng rẽ trên môi trường PDA không agar. Pha loãng dịch nuôi cấy đạt mật độ 109 cfu/ml và ba (3) loại thuốc là: ridomil 72WP, carbenzim 50WP, và anvil 5SC. Nồng độ pha lần lượt như sau ridomil nồng độ 0,5%, carbenzim 50WP nồng độ 0,3%, và anvil 5SC với nồng độ 0,25%. 
	Thí nghiệm được tiến hành với 9 công thức: 5 công thức với VK nội sinh, 4 công thức đối chứng trong đó 3 công thức với thuốc hóa học và 1 công thức đối chứng là nước cất. Mỗi công thức thí nghiệm được tiến hành với 10 đĩa Petri và thí nghiệm được lặp lại 3 lần. Đục một lỗ có đường kính 1 cm ở giữa đĩa Petri, cấy nấm ở 3 điểm góc đĩa tạo thành một hình tam giác. Dùng pipét hút 1ml dịch VK nội sinh và thuốc hóa học đã pha theo đúng nồng độ cho vào lỗ đục, băng kín và để ở tủ định ôn ở nhiệt độ 280C. Sau 24 và 48 giờ kiểm tra và đo vòng kháng nấm của thuốc so với đối chứng. Xử lý số liệu bằng phần mềm excel 9.0 (Nguyễn Hải Tuất, 2003)[36].
- Phương pháp thí nghiệm cành và lá non Keo tai tượng
	Thí nghiệm được tiến hành với 9 công thức, năm (5) công thức với 5 chủng VK nội sinh có hoạt tính cao, nhân sinh khối riêng rẽ trên môi trường PDA không agar. Pha loãng dịch nuôi cấy đạt mật độ 109 cfu/ml và 4 công thức đối chứng (1 nước cất và 3 thuốc hóa học). Lấy cành, lá non Keo tai tượng không bị bệnh nhúng vào 1 trong 9 cốc đựng dung dịch (5 cốc VK nội sinh có hiệu lực cao, 3 cốc đựng thuốc hóa học ridomil nồng độ 0,5%, carbenzim 50WP nồng độ 0,3%, và anvil 5SC với nồng độ 0,25%, 1 cốc nước cất) trong vòng 3 phút, mỗi công thức có 10 hộp lồng, thí nghiệm được lặp lại 3 lần.
Lấy bào tử từ cơ quan sinh sản của nấm đã nuôi cấy trên môi trường PDA bằng que cấy được khử trùng trên ngọn đèn cồn, cho bào tử nấm vào cốc nước vô trùng tới khi mật độ đạt 1.105 tế bào/ml. Sau đó để lá vào trong hộp lồng petri giữ ẩm, mỗi hộp để 3 lá. Tiến hành phun bào tử nấm lần lượt vào các đĩa petri, băng keo lại xung quanh hộp, để ở nhiệt độ 280C. Theo dõi trong vòng 6 ngày và đánh giá mức độ bị bệnh ở mỗi công thức.
2.3.2.4. Một số đặc điểm sinh học khác của vi khuẩn nội sinh
- Phương pháp nghiên cứu khả năng tạo hoóc môn thực vật
	Năm chủng VK nội sinh có hiệu lực kháng bệnh cao được nhân sinh khối trên môi trường King’ B không agar, tốc độ lắc 150 vòng/phút ở nhiệt độ 300C trong 48h (môi trường King’ B không agar có bổ sung trytophan 0,1%). Lấy 2ml dịch VK nội sinh đã ly tâm 3000 vòng/phút và bổ sung thêm 8ml thuốc thử Salkowski cải tiến sẽ cho màu hồng nhạt đến đỏ phụ thuộc vào hàm lượng IAA thô được sinh ra.
	Hàm lượng IAA thô sinh ra được xác định theo phương pháp so màu với bước sóng 530 nm với đồ thị chuẩn IAA. 
	Dựng đồ thị chuẩn IAA: Cân 0,025g IAA cho vào cốc đong có chứa sẵn 50ml nước cất và đun cho tan IAA. Chuẩn bị các ống nghiệm có chứa sẵn 10ml nước cất trong mỗi ống. Hút ở mỗi ống nghiệm lần lượt 0, 50, 100, 200, 400, 600,..., 1400, 1600 µl nước cất đồng thời bổ sung lượng IAA tương ứng với lượng nước cất hút ra ở mỗi ống nghiệm. Đối chứng là 2ml nước cất bổ sung 8ml thuốc thử. Dựa vào chỉ số OD (mật độ quang) và nồng độ IAA trong dung dịch để dựng đồ thị chuẩn IAA tinh khiết. Thêm 2ml dung dịch vi sinh vật đã ly tâm vào ống nghiệm đã có sẵn 8ml thuốc thử. Đối chứng là 2ml môi trường và 8ml thuốc thử. So màu trên máy so màu bước sóng 530 nm và tính kết quả theo đồ thị chuẩn IAA tinh khiết.
- Phương pháp nghiên cứu khả năng phân giải phốt phát khó tan
+ Thí nghiệm định tính 
Năm (5) chủng VK nội sinh có hiệu lực cao (LC, KPT, P01, X02, B03) mỗi chủng cấy vào 10 đĩa Petri có chứa môi trường Pikovskaya, thí nghiệm được lặp lại 3 lần.
Môi trường Pikovskaya:
Ca3(PO4)2
: 0,5 g
Sacarose 
: 10 g
(NH4)2SO4
: 0,5 g
NaCl
: 0,2 g
MgSO4.7H2O
: 0,1 g
KCl
: 0,2 g
Cao nấm men
: 0,5 g
MnSO4
: Vết
FeSO4
: Vết
Agar
: 20 g
Nước 	
: 1 lít
pH
: 7
Cấy VK nội sinh lên môi trường Pikovskaya, nuôi trong tủ định ôn ở nhiệt độ 280C thời gian nuôi cấy 8 ngày. Tiến hành đo đường kính vòng phân giải lân theo 2 chiều vuông góc. Hiệu lực của vòng phân giải được đánh giá thông qua đường kính vòng phân giải (DTB): Hiệu lực thấp: DTB ≤ 5mm, Hiệu lực trung bình: 5mm 10mm.
+ Phương pháp xác định hàm lượng lân dễ tiêu do VK nội sinh phân giải: 
	Lần lượt từng chủng VK nội sinh được nuôi cấy thuần khiết đưa vào nuôi trong môi trường Pikovskaya không agar đã khử trùng và tiến hành lắc ở 200 vòng/phút, ở nhiệt độ 280C, trong 120 giờ. Ly tâm dịch ở 5000vòng/ phút trong 20 phút để lọc bỏ vi khuẩn phân giải lân lấy dịch trong, so màu ở bước sóng 430nm. 	 	Dung địch đối chứng là môi trường Pikovskaya không có agar.
Dựng đường chuẩn P2O5: Từ dung dịch chuẩn hút vào mỗi bình định mức 100 ml với các thể tích khác nhau như sau: 2 ml, 4 ml, 6ml, 8 ml (tương ứng với 0,02 mg, 0,04 mg, 0,06 mg, 0,08 mg P2O5). Thêm nước cất 2 lần vào các bình đựng trên đến thể tích xấp xỉ 50ml và lắc đều. Một bình định mức làm đối chứng chỉ có nước cất. Thêm vào các bình định mức trên mỗi bình 2 ml dung dịch amoni molipdat và 3ml dung dịch axit ascobic 1% sau đó lắc đều. Đặt tất cả các bình lên bếp cách thủy đun trong 15 phút. Trong quá trình đun sẽ xuất hiện phức màu xanh molipden. Để nguội và dẫn nước cất đến vạch định mức. Đo giá trị OD (mật độ quang học) bằng máy so màu có bước sóng α = 650 nm. Xử lý kết quả sau khi đo ta sẽ nhận được đồ thị chuẩn P2O5. 
2.3.3. Phương pháp nghiên cứu sản xuất chế phẩm vi khuẩn nội sinh
2.3.3.1. Nghiên cứu điều kiện nhân sinh khối
- Phương pháp xác định môi trường nhân sinh khối tối ưu
Môi trường nhân sinh khối tối ưu: Được thử nghiệm trên 3 loại môi trường thông dụng không agar là môi trường PDA, môi trường NB và môi trường King’B. 
Môi trường PDA không agar thành phần gồm: 
Khoai tây
: 200 gam
D- Glucose
: 20 gam
Nước
: 1000 ml

Khoai tây rửa sạch để cả vỏ, cắt thành khối có kích thước 1x1x1cm, cho vào đun cùng 1000 ml nước, đun sôi trong 30 phút. Lọc lấy nước trong, cho thêm nước để đủ 1000 ml. Sau đó cho D-glucose vào khuấy cho tan đều, cho vào 10 bình tam loại 250 ml nút bông và quấn giấy ở miệng bình, hấp khử trùng ở 1210C trong thời gian 20 phút (thí nghiệm được lặp lại 3 lần). 
Môi trường King’B không agar
K2HPO4
: 0,15 gam
MgSO4.7H2O
: 0,15 gam
Peptone
: 20 gam
Glycerol
: 10 ml
H2O
: 1000 ml

Sau khi hấp khử trùng ở 1210C trong thời gian 20 phút sau đó để các bình môi trường vào trong tủ cấy, khử trùng các dụng cụ cần thiết và tiến hành trước ngọn lửa đèn cồn.
Môi trường NB không agar
Môi trường - thịt - pepton có thành phần: Nước thịt 1000ml, pepton 10g, pH=7; khử trùng 1 atm/30 phút.
Lấy từng loại chủng có hiệu lực cao, dùng que cấy khử trùng lấy từng loại VK nội sinh cho vào mỗi bình môi trường. Với mỗi loại lấy 1 vòng que cấy để đảm bảo lượng VK nội sinh đưa vào môi trường không quá ít. Nút bông và ghi rõ ký hiệu của từng loại. Cho các bình vào máy lắc, lắc với tốc độ 150 vòng/phút ở 280C với thời gian lắc 72 giờ. Lấy các bình đã lắc mỗi loại ra một ít làm mẫu, đếm số bào tử hữu hiệu bằng phương pháp pha loãng tới hạn (Nguyễn Lân Dũng, 1982)[15].
- Phương pháp xác định tốc độ lắc tối ưu: Được thực hiện với 5 công thức ở các tốc độ lắc khác nhau (0, 100, 150, 200, 250 vòng/phút) mỗi tốc độ lắc 10 bình tam giác 250 ml thí nghiệm được lặp lại 3 lần. Cho một lượng VK nội sinh như nhau (1 vòng que cấy) vào các bình lắc ở các tốc độ khác nhau, nhiệt độ ở 280C, thời gian lắc 72 giờ.
- Phương pháp xác định thời gian nhân sinh khối tối ưu: Được thực hiện với 5 công thức ở các thời gian nuôi cấy khác nhau (24 giờ, 48 giờ, 72 giờ, 96 giờ và 120 giờ) mỗi công thức 10 bình tam giác 250 ml, thí nghiệm được lặp lại 3 lần. Cho một lượng VK nội sinh như nhau (1 vòng que cấy/bình 250 ml) sau lắc với tốc độ 150 vòng/phút ở nhiệt độ 280C.
Đếm số lượng khuẩn lạc ở các công thức khác nhau bằng phương pháp pha loãng tới hạn (Nguyễn Lân Dũng và Phạm Văn Ty, 1998)[6].
- Phương pháp xác định nhiệt độ nhân sinh khối tối ưu: Được tiến hành với 6 công thức ở các thang nhiệt độ khác nhau (150C, 200C, 250C, 300C, 350C, 400C) mỗi thí nghiệm 10 bình tam giác 250 ml, thí nghiệm được lặp lại 3 lần. Cho một lượng VK nội sinh như nhau (1 vòng que cấy/bình 250 ml) vào các bình lắc với tốc độ 150 vòng/phút với thời gian lắc 72 giờ. Lấy các bình đã lắc mỗi loại ra một ít làm mẫu, đếm số khuẩn lạc bằng phương pháp pha loãng tới hạn.
2.3.3.2. Tạo chế phẩm và đánh giá chất lượng chế phẩm theo thời gian bảo quản
Phương pháp tạo chế phẩm 
Các bước tạo chế phẩm VK nội sinh bao gồm:
- Chuẩn bị nguyên liệu
- Chọn các chủng VK nội sinh có hoạt tính cao (không sinh độc tố, khả năng sinh tổng hợp sản phẩm chính cao, khả năng thích nghi nhanh, tốc độ sinh trưởng mạnh, điều kiện nuôi cấy đơn giản).
- Chọn môi trường nhân sinh khối phù hợp nhất (vi khuẩn nội sinh, sinh trưởng và phát triển tốt, rẻ tiền, dễ tìm).
- Chọn các điều kiện nhân sinh khối tốt nhất như (nhiệt độ, tốc độ lắc, thời gian nhân sinh khối).
- Nhân sinh khối và thu hồi sinh khối
- Bảo quản chế phẩm: Chế phẩm VK nội sinh sau khi sản xuất được bảo quản trong can 20 lít, 50 lít... để ở nhiệt độ 250C trong vòng 40 ngày.
Phương pháp đánh giá chất lượng chế phẩm theo thời gian bảo quản:
Đánh giá sự thay đổi mật độ tế bào của chế phẩm VK nội sinh sau thời gian bảo quản 10 ngày, 20 ngày, 30 ngày, 40 ngày: 
Đếm số lượng khuẩn lạc ở các thời gian bảo quản khác nhau bằng phương pháp pha loãng tới hạn (Nguyễn Lân Dũng và Phạm Văn Ty, 1998)[6].
2.3.4. Phương pháp nghiên cứu ứng dụng chế phẩm vi khuẩn nội sinh để kích kháng bệnh khô cành ngọn Keo tai tượng
2.3.4.1. Phương pháp đánh giá ảnh hưởng của chế phẩm vi khuẩn nội sinh đến nảy mầm hạt giống
	Thí nghiệm đối với sự nẩy mầm của hạt được tiến hành với 16 công thức 3 lần lặp tại phòng thí nghiệm của Viện Khoa học Lâm nghiệp Việt Nam. Chọn các hạt Keo tai tượng tốt, chắc, loại bỏ hạt lép và tạp chất, cân đều vào 9 cốc, mỗi cốc 1,5g ghi tên. Ngâm tất cả các hạt trong nước sôi trong vòng 1 phút sau đó rửa sạch. Lấy dịch khuẩn nội sinh trong bình lắc ra, cho vào 15 cốc với các mẫu tương ứng với các mật độ vi khuẩn nội sinh (6.109, 6.107, 6.105) ngâm trong 2 giờ, sau đó rửa lại bằng nước cất và để ráo nước. Công thức đối chứng làm tương tự nhưng đối với nước cất. Cho 15 cốc hạt và 1 cốc đối chứng vào mỗi hộp lồng tương ứng đã được khử trùng và lót giấy ẩm, để ở tủ nuôi cấy trong điều kiện nhiệt độ 280C độ ẩm 85%, giờ chiếu sáng là 12 giờ/ngày. Theo dõi sự nảy mầm của hạt sau 8 ngày với công thức:
PNM%=
Trong đó PNM%: Tỷ lệ nảy mầm của công thức, n: Số hạt nảy mầm N: Số hạt có trong công thức.
Các hạt đã được nhiễm các chủng VK nội sinh ở các nồng độ khác nhau sau khi nảy mầm được tra vào bầu, 60 ngày sau tiến hành phun nấm gây bệnh (C. gloeosporioides) tiếp tục theo dõi các công thức trong vòng 30 ngày để đánh giá về sinh trưởng thông qua chiều cao vút ngọn (Hvn) và đường kính gốc (Do), tỷ lệ bị bệnh và cấp bị bệnh theo phương pháp của (Old et al., 2000)[86].
Để đánh giá ảnh hưởng của VK nội sinh đến khả năng sinh trưởng và kháng nấm bệnh của cây con trong giai đoạn vườn ươm.
2.3.4.2. Phương pháp đánh giá ảnh hưởng của chế phẩm vi khuẩn nội sinh đến kích kháng bệnh khô cành ngọn Keo tai tượng trong giai đoạn vườn ươm
Thí nghiệm thử các phương thức, liều lượng nhiễm VK nội sinh đối với cây Keo tai tượng trong giai đoạn vườn ươm được tiến hành với 5 chủng có hiệu lực kháng nấm C. gloeosporioides cao, mật độ vi khuẩn nội sinh 6.109 cfu/ml bằng 3 phương thức nhiễm, mỗi công thức thí nghiệm 40 cây, 3 lần lặp các công thức được xử lý bằng phần mềm GENTAT 5 và Dataplus 3.0.
Tiêm dịch trực tiếp vào cây: Được tiến hành với 16 công thức (CT1- CT16) bằng cách tiêm theo phương pháp thẩm thấu lần lượt dịch từng chủng VK nội sinh ở 3 mức 1, 2 và 3 ml/cây, công thức đối chứng (ĐC) tiêm 2 ml nước cất. 
Phun dịch trực tiếp vào cây: Được tiến hành với 16 công thức (CT1- CT16) bằng cách phun lần lượt dịch 5 chủng VK nội sinh ở 3 mức 3, 6 và 9 ml/cây, công thức ĐC1 phun 6ml nước cất. 
Tưới dịch trực tiếp vào cây: Được tiến hành với 16 công thức (CT1- CT16) bằng cách tưới lần lượt dịch 5 chủng VK nội sinh ở 3 mức 3, 6 và 9 ml/cây công thức đối chứng tưới 6 ml nước cất. 
	Sau 2 tuần tiến hành phun ướt toàn bộ cây ở các công thức thí nghiệm bằng dung dịch nấm C. gloeosporioides có mật độ 1.105 cfu/ml và tạo môi trường thuận lợi cho cây và nấm bệnh phát triển (10 ngày).
	Theo dõi trong vòng 1 tháng để đánh giá tỷ lệ bị bệnh, mức độ bị bệnh và
sinh trưởng của cây bằng cách đo chiều cao vút ngọn (Hvn), đường kính gốc (Do) ở các công thức khác nhau. 
2.2.4.3. Phương pháp đánh giá ảnh hưởng của chế phẩm vi khuẩn nội sinh đến kích kháng bệnh khô cành ngọn Keo tai tượng ở giai đoạn cây 1 năm tuổi 
Từ các thí nghiệm ở giai đoạn vườn ươm ta chọn lấy 2 chủng VK nội sinh có tác dụng tốt nhất để nghiên cứu liều lượng nhiễm cho cây Keo tai tượng ở giai đoạn một tuổi. Thí nghiệm ứng dụng VK nội sinh đối với Keo tai tượng 1 năm tuổi được tiến hành tại vườn ươm của Viện Khoa học Lâm nghiệp Việt Nam (phường Đức Thắng, quận Bắc Từ Liêm, Hà Nội) với 12 công thức (CT1-CT12) bằng cách tưới lần lượt dịch VK nội sinh với mật độ 6.109 cfu/ml (2 chủng) ở 5 mức độ khác nhau (20ml/cây, 40ml/cây, 60ml/cây, 80ml/cây, 100ml/cây,) công thức ĐC1 tưới 80 ml nước cất. Công thức ĐC2 phun thuốc hóa học có hiệu lực tốt nhất trong phòng thí nghiệm, mỗi công thức 30 cây, 3 lần lặp thời gian theo dõi trong vòng 6 tháng số liệu được xử lý bằng phần mềm GENTAT 5 và Dataplus 3.0.
Sau 30 ngày nhiễm VK nội sinh, phun ướt toàn bộ cây thí nghiệm ở các công thức bằng dung dịch nấm gây bệnh có mật độ 1.105 tế bào/1ml. Sau đánh giá tỷ lệ bị bệnh và mức độ bị bệnh ở các công thức thí nghiệm.
Ảnh hưởng của VK nội sinh đến sinh trưởng (chiều cao, khối lượng tươi, khối lượng khô) của Keo tai tượng ở các công thức thí nghiệm.
- Tiến hành đo Hvn bằng thước chuyên dùng, đường kính D1.3 các cây có trong công thức. 
	- Keo tai tượng ở các công thức khác nhau sau khi nhiễm chế phẩm 6 tháng tiến hành thu riêng rẽ từng công thức gồm (thân, cành, lá) tươi đem cân được sinh khối tươi.
- Sấy khô bằng tủ sấy ở nhiệt độ 750C trong khoảng thời gian từ 6 - 8 giờ. Trong quá trình sấy, kiểm tra trọng lượng của mẫu sau 2, 4, 6 và 8 giờ sấy. Nếu sau 3 lần kiểm tra thấy trọng lượng không đổi thì đó chính là trọng lượng khô của mẫu, số liệu được xử lý bằng phần mềm GENTAT 5 và Dataplus 3.0.
Chương 3
KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN
3.1. Bệnh khô cành ngọn Keo tai tượng
3.1.1. Xác định nguyên nhân gây bệnh
- Triệu chứng bệnh và đặc điểm bào tử 
+ Triệu chứng bệnh: Bệnh xuất hiện ở lá và cành của cây Keo tai tượng, đầu tiên bệnh có dạng các đốm nâu nhỏ hình bầu dục có kích cỡ khác nhau và ngoài viền có gờ nổi lên. Các đốm nhỏ kết hợp với nhau tạo ra các đốm lớn khiến lá bị khô và rụng sớm (Hình 3.1). Cành bị bệnh thường có màu nâu đen, trên mặt vỏ xuất hiện các đoạn đen nứt dọc (Hình 3. 2). Khi cây bị bệnh nặng, vỏ khô dần, co thắt, nhăn nheo làm lá và cả ngọn cây bị héo (Hình 3.3).


Hình 3.1: Lá Keo tai tượng bị bệnh
khô cành ngọn

Hình 3.2: Cành Keo tai tượng bị bệnh
 khô cành ngọn
Hình 3.3: Rừng Keo tai tượng ở Phú Thọ
bị bệnh khô cành ngọn

+ Đặc điểm bào tử: Ở 4 khu vực thu mẫu (Công ty Lâm nghiệp Tam Thắng, huyện Thanh Sơn tỉnh Phú Thọ; Công ty Lâm nghiệp Hàm Yên, huyện Hàm Yên tỉnh Tuyên Quang; huyện Văn Bàn tỉnh Lào Cai, xã Gia Phú huyện Bảo Thắng tỉnh Lào Cai). Đặc điểm bào tử của 4 chủng nấm tương đối giống nhau về hình dạng và kích thước. Để ẩm cành, lá, thân bị bệnh từ 3 - 5 ngày và soi trên kính hiển vi quang học ta thấy thể quả nấm xuất hiện khối bào tử vô tính hình tròn màu da cam (hình 3.5).


Hình 3.4: Tổ chức bị bệnh
Hình 3.5: Khối bào tử vô tính
Giai đoạn vô tính (Anamorph): Bào tử phân sinh hình bầu dục hay hình hạt gạo thuôn dài đơn bào không mầu, sau khi thành thục có mầu nâu (hình 3.6). Bào tử có thể bám hình chùy (Hình 3.7). Bào tử không có vách ngăn nhưng đặc biệt là ở trước giai đoạn nẩy mầm bào tử thường có một vách ngăn ngang hình thành hai tế bào có mầu nâu, bào tử có chiều dài từ 11,87mm - 16,38mm, chiều rộng 3,26 - 4,78mm. Vỏ bào tử dạng đĩa có mầu nâu nhạt, nằm rải rác dưới vỏ cây, sau đó màng lộ ra ngoài mầu nâu đen khi chín nứt ra và bào tử bay ra ngoài gặp điều kiện thuận lợi nẩy mầm thực hiện quá trình xâm nhiễm mới trong mùa sinh trưởng đĩa bào tử có kích thước chiều dài 121,5 - 182,7mm, và chiều rộng 42 - 53,6mm. Bên trong của đĩa bào tử có cuống bào tử mọc ra trên đó, cuống bào tử không mầu đơn bào, có kích thước chiều dài 101,8mm và chiều rộng 4,1 - 6,3mm.
Hình 3.6: Bào tử nấm gây bệnh 

Hình 3.7: Bào tử nấm gây bệnh nảy mầm
- Phân lập, đặc điểm của hệ sợi nấm
Nấm gây bệnh được phân lập từ các bộ phận thân, cành, lá, Keo tai tượng tại 4 khu vực điều tra bằng phương pháp nuôi cấy đơn bào tử trên môi trường PDA ở nhiệt độ 280C và theo dõi sự phát triển của nấm bệnh.
 Kết quả thu được như sau: Công ty Lâm nghiệp Tam Thắng, huyện Thanh Sơn tỉnh Phú Thọ phân lập được 1 chủng ký hiệu PT; Công ty Lâm nghiệp Hàm Yên, huyện Hàm Yên tỉnh Tuyên Quang phân lập được 1 chủng ký hiệu TQ; huyện Văn Bàn tỉnh Lào Cai phân lập được 1 chủng ký hiệu LC1, xã Gia Phú huyện Bảo Thắng tỉnh Lào Cai phân lập được 1 chủng nấm ký hiệu LC2. Bốn chủng nấm phân lập được khá giống nhau về đặc điểm hệ sợi.
Hình 3.8: Hệ sợi chủng nấm PT
Hình 3.9: Hệ sợi chủng nấm TQ


Hình 3.10: Hệ sợi chủng nấm LC1
Hình 3.11: Hệ sợi chủng nấm LC2
Tốc độ sinh trưởng của hệ sợi nấm b