Luận án Phân lập đoạn gen CP từ Soybean mosaic virus và phát triển vector chuyển gen mang cấu trúc RNAi phục vụ tạo cây đậu tương chuyển gen kháng bệnh

yme Hind III (10 U/µl) 1 
4 H2O 3 
5 Template (200 ng/µl) 3 
Tổng 10 
Bổ sung lần lượt các thành phần trên vào ống Eppendorf 1,5 ml, ủ 
ở 37oC trong 2 giờ. 
 53
 Vector chuyển gen mang cấu trúc RNAi chứa đoạn gen CPi của SMV 
và BYMV được ký hiệu theo nguyên tắc là: pK7GW-đoạn gen (tên loài 
virus), [pK7GW-CPi-SMV, pK7GW-CPi (SMV-BYMV)]. 
2.2.3. Phương pháp chuyển gen thông qua A. tumefaciens 
2.2.3.1. Biến nạp vector pK7GW-CPi-SMV và pK7GW/SMV-BYMV-CPi 
vào tế bào A. tumefaciens 
i) Phương pháp tạo tế bào khả biến A. tumefaciens 
(1) Làm mới giống trên môi trường LB đặc, sau đó nuôi lắc một khuẩn lạc 
trong 2ml môi trường LB lỏng ở 28oC trong 6 giờ. (2) Lấy 100l dung dịch vi 
khuẩn nuôi cấy tiếp ở 28oC qua đêm trong 100ml LB lỏng có bổ sung kháng 
sinh chọn lọc đến khi OD600nm = 1 - 1,5. (3) Làm lạnh mẫu trong đá 15 phút, ly 
tâm 5.000 vòng/phút trong 20 phút để thu cặn tế bào. Rửa cặn hai lần trong 10ml 
1mM HEPES (N-2-hydroxyethylpiperazine-N’-2-ethanesulfonic acid) pH 7,0. 
(4) Cặn tế bào hoà tan trong 500-700l 10% glycerol. Chia 45l dịch tế bào vào 
mỗi ống Eppendorf, làm lạnh trong nitơ lỏng và giữ chủng ở -85oC. 
 Khi đã có được tế bào khả biến A. tumefaciens, tiến hành biến nạp 
vector tái tổ hợp vào tế bào bằng phương pháp xung điện. 
ii) Quy trình biến nạp bằng xung điện 
 Tế bào khả biến được đặt trong đá 5 phút, sau đó bổ sung 1 µl pK7GW-
CPi vào tế bào khả biến và trộn nhẹ. Chuyển tất cả hỗn hợp dịch A. tumefaciens 
+ pK7GW-CPi vào cuvet (đã được rửa bằng cồn tuyệt đối và tráng lại bằng nước 
khử ion, rồi thấm khô), rồi xung điện ở 2,5 kv, 25 µF và điện trở 400 Ω sau đó 
đặt ngay vào đá, sau 5 phút bổ sung 1 ml YEB (hoặc LB lỏng). Chuyển sang 
ống eppendorft 2 ml nuôi ở 28oC trong 1 giờ trên máy lắc. Chuyển 300 µl vào 
các đĩa chọn lọc chứa kháng sinh streptomycin 40 mg/l, spectinomycin 100 
mg/l và rifamycin 50 mg/l, ủ ở 28oC từ 24 - 48 giờ. 
 54
2.2.3.2. Chuyển cấu trúc CPi (SMV-BYMV) vào cây thuốc lá C9-1 
Môi trường tái sinh cây in vitro phục vụ chuyển gen được trình bày ở bảng 2.7. 
Bảng 2.7. Thành phần các loại môi trường tái sinh in vitro 
Loại môi trường Kí hiệu Thành phần 
Nảy mầm hạt 
(Germination 
medium) 
GM Muối B5 (3,052 g/l )+ sucrose (20 g/l) + agar (6 g/l), 
pH = 5,8. Bổ sung: vitamin B5(1 mg/l) 
Đồng nuôi cấy 
(Co-cultivation 
medium) 
CCM Muối B5 (0,316 g/l)+ MES (3,9 g/l) + sucrose (30g/l)+ 
agar (5 g/l), pH = 5,4. Bổ sung: vitamin B5 (1 mg/l )+ 
AS (0,2 mM) + L-cysteine (400 mg/l) + Sodium 
thiosulfate(158 mg/l) + DTT (154 mg/l )+ GA3(0,25 
mg/l) + BAP 
Cảm ứng tạo đa 
chồi (Shoot 
induction medium) 
SIM Muối B5 (3,052 g/l) + MES (0,59 g/l) + sucrose (30 
g/l), pH = 5,6. Bổ sung: vitamin B5 (1 mg/l )+ BAP 
Kéo dài chồi 
(Shoot elongation 
medium) 
SEM MS (4,3 g/l) + MES( 0,59 g/l )+ sucrose (30 g/l) + 
agar (6 g/l), pH = 5,6. Bổ sung: vitamin B5 1 mg/l + 
L-asparagine (50 mg/l) + L-pyroglutamic acid (100 
mg/l )+ IAA+GA3 
Ra rễ 
(Rooting medium) 
RM MS (1,58 g/l) + MES (0,59 g/l )+ sucrose (20 g/l) + 
agar (6 g/l), pH = 5,6. Bổ sung: IBA + vitamin B5 (1 
mg/l ) 
Quy trình chuyển gen vào giống thuốc lá C9-1 thông qua vi khuẩn A. 
tumefaciens CV58C1 được tiến hành theo phương pháp của Topping (1998) 
[155], bao gồm các bước: 
(1) Chuẩn bị chủng A. tumefaciens CV58C1 mang cấu trúc pGW-CPi (SMV-
BYMV) một ngày trước khi biến nạp, nuôi một khuẩn lạc vào 20 ml LB lỏng 
có bổ sung kháng sinh Streptomycin 40 mg/l, Spectinomycin100 mg/l và 
Chloramphenicol 50 mg/l, nuôi lắc 200 v/p ở 28oC trong 16 giờ. 
 55
(2) Bổ sung thêm 30ml LB lỏng có bổ sung kháng sinh như trên nuôi lắc 200 
v/p ở 28oC trong 3 – 4 giờ. 
(3) Chuẩn bị mảnh lá thuốc lá có kích thước 1cm2 được làm tổn thương bằng 
lưỡi dao cắt bốn cạnh xung quanh, đặt trên môi trường MS trong 2 ngày. 
(4) Lấy khoảng 1,5 – 2,0ml dịch khuẩn và môi trường LB lỏng dùng để nuôi 
khuẩn như trên đo OD nếu OD600 = 0,5 - 1 (tốt nhất khoảng 0,7) là có thể 
được sử dụng cho biến nạp. 
(5) Ly tâm toàn bộ dịch khuẩn 4500 v/p trong 1 phút ở 40C. Sau đó thu cặn 
hòa tan dưới đáy ống nghiệm và hòa tan với thể tích tương đương bằng dung 
dịch ½ MS dùng để biến nạp. 
(6) Các mảnh lá sau 2 ngày nuôi cảm ứng trên môi trường MS được dùng 
biến nạp. Sau 30 phút lây nhiễm trong dịch khuẩn, chuyển các mảnh lá lên 
giấy thấm đã khử trùng, thấm khô và cấy lên môi trường MS. Sau 2 ngày 
chuyển sang môi trường MS có bổ sung kháng sinh cefotaxim 500 mg/l và 
kanamycin 50 mg/l. 
(7) Sau 2 - 3 tuần từ các mảnh cấy xuất hiện các chồi nhỏ. Tách các chồi và 
chuyển sang môi trường MS có bổ sung kháng sinh cefotaxim 500mg/l và 
kanamycin 50mg/l. 
(8) Sau 1 - 2 tuần tiếp theo, những chồi sống sót và phát triển được thành cây 
hoàn chỉnh được cấy lên môi trường MS có bổ sung kháng sinh cefotaxim 
500mg/l và kanamycin 50mg/l. 
(9) Ra cây ở phòng thí nghiệm trên giá thể đất sau 4 – 5 tuần. 
(10) Sau 2 - 3 tuần, chuyển cây ra môi trường nhà lưới. 
2.2.3.3. Chuyển cấu trúc CPi (SMV-BYMV) vào giống đậu tương ĐT12 và DT2008 
Kỹ thuật tái sinh đa chồi ở cây đậu tương qua nách lá mầm hạt chín 
được tiến hành dựa trên phương pháp của Olhoft và cộng sự (2006) có cải tiến 
[122]. Thành phần các loại môi trường sử dụng cho tái sinh cây qua đa chồi từ 
nách lá mầm hạt chín được chỉ ra trong bảng 2.7. 
 56
Thí nghiệm được bố trí hoàn toàn ngẫu nhiên với 3 lần lặp lại. Các thí 
nghiệm của phần nuôi cấy mô tế bào thực vật được thực hiện trong phòng 
nuôi cây với điều kiện chiếu sáng theo quang chu kì 16 giờ sáng và 8 giờ tối, 
nhiệt độ phòng 250C ± 2, cường độ chiếu sáng 2000 lux. 
i) Tạo nguyên liệu và cảm ứng tạo đa chồi 
Hạt chín được loại bỏ các hạt kém chất lượng và tiến hành khử trùng 
bằng khí clo trong bình kín có tủ hốt. Sau khi khử trùng, cho hạt nảy mầm 
trên môi trường GM, sau 4-5 ngày cắt lấy phần lá mầm, tách đôi hai lá mầm, 
loại đỉnh sinh trưởng. Phần lá mầm còn lại được đặt lên môi trường cảm ứng 
tạo đa chồi (SIM). Theo dõi tỷ lệ mẫu tạo cụm chồi, số chồi trung bình /cụm 
sau thời gian cảm ứng là 4 tuần để đánh giá khả năng tạo đa chồi của giống 
đậu tương cũng như mức độ phù hợp của môi trường. 
ii) Kéo dài chồi và tạo cây hoàn chỉnh 
 Các cụm chồi được tạo ra từ quá trình nuôi cấy trên môi trường SIM 
được chuyển sang môi trường kéo dài chồi SEM. Đánh giá khả năng kéo dài 
của chồi sau 2 tuần dựa trên việc theo dõi và thống kê số chồi kéo dài/cụm 
nuôi cấy cũng như chất lượng chồi. 
Khi các chồi đạt chiều cao từ 4-5 cm, chọn những chồi khỏe chuyển 
sang môi trường ra rễ RM. Khi cây in vitro có 3 lá, có bộ rễ đảm bảo (thường 
sau 2 tuần nuôi cấy) sẽ thực hiện việc ra cây. Cây được lấy ra khỏi bình nuôi 
cấy một cách nhẹ nhàng, rửa sạch phần agar bám quanh gốc và rễ, sau đó cây 
được trồng trên giá thể . Cây sống sót trên giá thể được đưa ra trồng trên chậu 
đất có bổ sung phân bón và trồng trong điều kiện nhà lưới. 
iii) Chuyển gen nhờ vi khuẩn A. tumefaciens qua nách lá mầm hạt chín 
Phương pháp chuyển gen qua nách lá mầm tiến hành theo Olhoft và 
cộng sự (2006) có cải tiến [122] và theo Nguyễn Thu Hiền (2011) [6], [7]) 
(Hình 2.4). 
 57
Hình 2.4. Sơ đồ thí nghiệm tái sinh và chuyển gen vào giống đậu tương 
ĐT12 và DT2008 
Khử trùng bề mặt 
Nảy mầm 
A. tumefaciens/CPi 
(SMV-BYMV) 
Nuôi lỏng khuẩn 
Tạo huyền phù khuẩn 
Kéo dài chồi 
Ra rễ 
Ra cây 
Thu lá mầm, gây tổn thương nách 
lá mầm và lây nhiễm A. 
tumefaciens/CPi (SMV-BYMV); 
Đồng nuôi cấy 
Cảm ứng tạo đa chồi 
Hạt đậu tương 
ĐT12 và DT2008 
 58
Hạt đậu tương chín sau khi được khử trùng, nảy mầm, tách và thu phần 
nách lá mầm (tương tự như tạo nguyên liệu nuôi cấy in vitro trong quy trình 
tái sinh cây) sẽ được gây tổn thương bằng mũi dao và kim nhọn từ 7-8 lần vào 
phần nách lá mầm. Lá mầm đã bị tổn thương được nhiễm khuẩn A. 
tumefaciens tái tổ hợp. 
Mẫu được ngâm trong dịch huyền phù vi khuẩn có OD600 đạt 0,6-1 
trong thời gian 30 phút. Sau thời gian nhiễm khuẩn, mẫu được chuyển sang 
môi trường đồng nuôi cấy CCM đặc. Quá trình đồng nuôi cấy diễn ra trong 
tối, ở 250C trong thời gian là 5 ngày. 
Sau thời gian đồng nuôi cấy, mẫu biến nạp được lắc trong môi trường 
cảm ứng tạo chồi (SIM) có bổ sung 500 mg/l cefotaxim với thời gian là 10 
phút, sau đó thấm khô bằng giấy thấm khử trùng. Cắt bỏ chồi chính trên các 
mảnh lá mầm và cấy mẫu lên môi trường tạo cụm chồi có bổ sung 500 mg/l 
cefotaxim. Sau thời gian 2 tuần, mẫu được chuyển sang môi trường SIM đặc 
có bổ sung 500 mg/l cefotaxim và kanamycin 50 mg/l. Các cụm chồi sống 
được trên môi trường chọn lọc sẽ được chuyển sang môi trường phát triển 
chồi (SEM) có bổ sung 500 mg/l cefotaxim và kanamycin 50 mg/l. Chồi phát 
đạt kích thước từ 3-5 cm được chuyển sang môi trường ra rễ (RM) có bổ sung 
250 mg/l cefotaxim để tạo cây hoàn chỉnh. 
iv) Phương pháp xác định hiệu suất chuyển gen 
 Mỗi mẫu biến nạp là mảnh lá mầm được tái sinh chồi và qua hai lần 
chọn lọc bằng kháng sinh. Các chồi sống sót sau chọn lọc được chuyển sang 
môi trường ra rễ và đưa ra trồng trên giá thể. Số cây sống trên giá thể của mỗi 
mẫu biến nạp dương tính với PCR lập thành một dòng cây chuyển gen. Hiệu 
suất chuyển gen được tính theo công thức: 
Hiệu suất chuyển gen = 
Số dòng cây chuyển gen dương tính với PCR 
Tổng số mẫu biến nạp 
(%) 
 59
2.3.4. Phương pháp phân tích cây chuyển gen 
2.3.4.1. Kiểm tra sự có mặt của gen chuyển bằng kỹ thuật PCR 
DNA tổng số từ các mẫu lá non được tách chiết theo phương pháp của 
Saghai và cộng sự (1984) [138] có cải tiến, với thành phần đệm chiết ở bảng 
2.8. 
Bảng 2.8. Thành phần dung dịch đệm tách DNA tổng số 
STT Nồng độ gốc Nồng độ sử dụng 
1 Tris-HCl 1M, pH 8 100 mM 
2 NaCl 5M 1,4M 
3 EDTA 0,5M, PH 8 50 mM 
4 CTAB 2% (w/v) 
5 Nước khử ion vô trùng 
Các bước tiến hành: 
(1) Nghiền mẫu lá trong nitơ lỏng bằng cối chày sứ. Bột đã nghiền cho vào 
ống Eppendorf 1,5 ml. Thêm 700µl dung dịch đệm tách, đảo đều và ủ ở 65oC 
trong 90 phút. 
(2) Bổ sung 700µl hỗn hợp Chloroform : Isoamyl alcohol (tỷ lệ 24:1) vào mỗi 
ống, đảo đều sau đó ly tâm ở 13000 vòng/phút trong 15 phút. 
(3) Hút 500 µl dịch nổi pha trên sang ống eppendorf khác, bổ sung 500 µl 
isopropanol lạnh. Để mẫu trong tủ -20oC trong 30 phút. 
(4) Ly tâm thu 13000 vòng/phút ở 4oC trong 15 phút để thu tủa DNA, sau đó 
rửa tủa bằng cồn 70oC. 
(5) Loại bỏ cồn, làm khô tủa ở điều kiện nhiệt độ phòng và hòa tan DNA 
trong nước khử ion vô trùng và bảo quản ở -20oC. 
 60
 Phản ứng PCR nhân đoạn CPi (SMV-BYMV) từ DNA tổng số của các 
dòng cây chuyển gen được tiến hành với các cặp mồi đặc hiệu, điện di kiểm tra 
sản phẩm PCR trên gel agarose 0,8% và chụp ảnh. 
2.3.4.2. Phân tích, đánh giá khả năng kháng SMV và BYMV bằng phương 
pháp lây nhiễm nhân tạo 
 Các cây chuyển gen trồng trong nhà lưới sau 2-3 tuần sinh trưởng có 
5 - 6 lá thật, kích thước lá khoảng 10 cm được thử nghiệm đánh giá khả 
năng kháng SMV và BYMV bằng lây nhiễm nhân tạo theo phương pháp 
của Herbers và đtg (1996) [82]. Các bước tiến hành như sau: 
(1) Mẫu lá bị bệnh nhiễm SMV và BYMV được nghiền trong đệm 
phosphat 100 mM, pH7 (~1 g mẫu lá trong 20 ml đệm). 
(2) Lây nhiễm lá theo cách gây tổn thương nhẹ bằng Carborundum. 
(3) Chuyển dịch chứa virus lên phần lá đã gây tổn thương, sau vài phút rửa 
lá bằng nước. 
(4) Sau lây nhiễm 10 - 11 ngày, quan sát và đánh giá triệu chứng nhiễm 
bệnh xuất hiện trên cây. 
Cây đối chứng không chuyển gen được lây nhiễm để làm đối chứng 
dương. 
Các thí nghiệm lây nhiễm được tiến hành 3 lần, mỗi lần cách nhau 15 
ngày. Các cây sau khi lây nhiễm có biểu hiện bệnh sẽ không được sử dụng 
để lây nhiễm lần sau. 
 61
Chương 3 
KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN 
3.1. TÁCH DÒNG VÀ PHÂN TÍCH TRÌNH TỰ ĐOẠN GEN CP CỦA SMV 
3.1.1. Tách dòng và xác định trình tự nucleotide đoạn gen CP từ SMV 
 Xuất phát từ chức năng của gen CP trong sự xâm nhập và hoạt động của 
SMV ở tế bào chủ, sự lan truyền của SMV giữa các tế bào trong cơ thể chủ và 
nguyên lý của kỹ thuật RNAi, vùng bảo thủ của gen CP đã được lựa chọn để 
thiết kế cấu trúc RNAi. So sánh các trình tự gen công bố trên Ngân hàng gen 
quốc tế, vùng tương đồng đã được xác định là cơ sở thiết kế cặp mồi PCR cho 
phân lập đoạn bảo thủ của gen CP từ các dòng SMV. Kết quả so sánh 96 trình 
tự gen CP của SMV bằng BLAST trong NCBI cho thấy các trình tự gen CP 
khác nhau có độ tương đồng từ 94% đến 100%, kích thước vùng tương đồng 
có số lượng hơn 700 nucleotide. Dựa trên trình tự gen CP mang mã số 
X63771 trên Ngân hàng gen quốc tế chúng tôi đã thiết kế cặp mồi PCR 
SMVcp-F/SMVcp-R (Bảng 3.1) để nhân đoạn tương đồng của gen CP dự tính 
có kích thước là 720 nucleotide. 
Bảng 3.1. Trình tự nucleotide của cặp mồi PCR được thiết kế sử dụng nhân 
bản đoạn gen CP 
Ký hiệu mồi Trình tự nucleotide 
SMVcp-F 5’-TTACCATCAGGCAAGGAGCAGGAAG -3’ 
SMVcp-R 5’-TGGACTTGATGGGAACATCTCAACT -3’ 
 62
RNA tổng số được tách chiết từ các mẫu lá đậu tương nhiễm virus 
SMV thu được tại Sơn La và một số địa phương khác được kiểm tra bằng 
điện di trên gel argarose. Kết quả cho thấy sản phẩm RNA tổng số tách chiết 
được đảm bảo chất lượng cho phản ứng phiên mã ngược để tạo cDNA và tiến 
hành phản ứng PCR. 
Sản phẩm phản ứng PCR khuếch đại đoạn gen CP với cặp mồi 
SMVcp-F/SMVcp-R được kiểm tra bằng phương pháp điện di trên gel 
argarose, kết quả cho thấy chỉ có hai mẫu thu tại Sơn La (SL1, SL2) cho sản 
phẩm PCR như tính toán khi thiết kế cặp mồi (Hình 3.1), còn ở các mẫu khác 
phản ứng PCR không thu được kết quả. 
Hình 3.1. Kết quả điện di kiểm tra sản phẩm PCR khuếch đại đoạn gen CP từ 
SMV (M: Thang DNA chuẩn 1 kb; 1 : SL1; 2 : SL2.) 
 Hình 3.1 cho thấy một băng DNA đặc hiệu xuất hiện với kích thước 
khoảng 0,7kb, đúng với kích thước dự đoán khi thiết kế cặp mồi PCR. 
Sản phẩm PCR được tách khỏi bản gel, tinh sạch và gắn trực tiếp vào 
vector tách dòng pBT sau đó được nhân dòng trong tế bào E. coli DH5 . Tiến 
hành chọn dòng bằng phản ứng colony-PCR trực tiếp từ khuẩn lạc. Kết quả 
điện di cho thấy sản phẩm colony-PCR xuất hiện một băng DNA có kích 
thước khoảng 0,7kb đúng như dự tính (Hình 3.2). 
 1kb
 0,7kb
1 2 M
 63
Hình 3.2. Kết quả điện di sản phẩm colony- PCR từ khuẩn lạc 
(M: thang DNA chuẩn 1 kb; 1, 2, 3- Gen CP khuếch đại từ khuẩn lạc SL1; 
4, 5, 6: Gen CP khuếch đại từ khuẩn lạc SL2) 
 Những dòng khuẩn lạc dương tính với PCR đã được chọn để tách 
plasmid. Xác định trình tự nucleotide của đoạn gen CP được thực hiện trên 
máy xác định trình tự. Kết quả giải trình tự nucleotide cho thấy đoạn gen CP 
phân lập từ SMV dòng SL1 và SL2 gây bệnh khảm lá trên cây đậu tương thu 
tại Sơn La có 720 nucleotide (Hình 3.3). 
 Kết quả so sánh với trình tự của đoạn gen CP trên Ngân hàng gen quốc 
tế có mã số X63771 cho thấy đoạn gen CP mà chúng tôi phân lập được từ 
SMV dòng SL1 có độ tương đồng là 100%, còn trình tự đoạn gen CP phân 
lập từ dòng SL2 có độ tương đồng là 99,3%, và hai trình tự đoạn gen CP của 
dòng SL1 và SL2 có độ tương đồng là 99,3%. Như vậy có thể kết luận rằng 
trình tự cDNA mà chúng tôi phân lập được là đoạn gen CP mã hóa protein CP 
của SMV dòng SL1 và SL2. 
 Hai trình tự nucleotide của đoạn gen CP phân lập từ SMV dòng SL1 và 
dòng SL2 đã được đăng ký trên Ngân hàng gen quốc tế với mã số HG965102 
và HG965103. 
1kb 
 0,7kb
M 1 2 3 4 5 6M 1 2 3 4 5 6
 64
 65
Hình 3.3. So sánh trình tự đoạn gen CP của SMV dòng SL1, SL2 và X63771 
 Kết quả so sánh bằng phần mềm BioEdit ở hình 3.3 cho thấy trình tự 
đoạn gen CP của dòng virus SL2 có sự sai khác so với trình tự đoạn gen CP 
có mã số X63771 và với dòng SL1 ở 5 vị trí nucleotide: 31, 38, 686, 690, 694 
(Bảng 3.2). 
 66
Bảng 3.2. Các vị trí sai khác giữa trình tự đoạn gen CP của SMV dòng SL2 so 
với dòng SL1 và trình tự mang mã số X63771 
Vị trí nucleotide X63771 SL1 SL2 
31 A A T 
38 C C G 
686 A A G 
690 G G T 
694 T T A 
 Protein CP mang mã số CAA45307 trên Ngân hàng gen quốc tế được 
suy diễn từ trình tự gen đoạn CP mang mã số là X63771 ở virus SMV có 267 
amino acid; còn protein suy diễn từ trình tự đoạn gen CP của SMV dòng SL1 
và SL2 mà chúng tôi phân lập có 240 amino acid, kết quả so sánh vùng tương 
đồng của ba trình tự amino acid được trình bày ở hình 3.4. 
 Kết quả ở hình 3.4 cho thấy protein (mã số CAA45307) do đoạn gen 
CP mã hóa có hệ số tương đồng so với protein suy diễn của dòng SL1 là 
100% và so với ở dòng SL2 là 97,9%. Năm vị trí sai khác về trình tự amino 
acid của protein suy diễn ở dòng SL2 so với protein CAA45307 và dòng SL1 
được thể hiện ở bảng 3.3, đó là các vị trí amino acid: 11, 13, 220, 230, 232. 
 67
Hình 3.4. So sánh trình tự amino acid suy diễn của protein CP của SMV dòng 
SL1, SL2 và CAA45307 
Bảng 3.3. Các vị trí sai khác giữa trình tự amino acid suy diễn của protein 
dòng SL2 so với dòng SL1 và trình tự có mã số CAA45307 
Vị trí amino acid CAA45350 SL1 SL2 
11 M M L 
13 T T R 
220 N N S 
230 K K N 
232 F F I 
 68
Poty-coat (Potyvirus coat protein) là trình tự amino acid của coat 
protein (CP) tương đồng giữa các loài virus thuộc nhóm Potyvirus. Vùng 
Poty-coat của CP ở SMV mã số CAA45307 có 232 amino acid, vùng Poty-
coat của CP dòng SL1 và dòng SL2 có 208 amino acid. Kết quả so sánh vùng 
tương đồng về trình tự amino acid của vùng Poty-coat của CP dòng SL1 và 
dòng SL2 so với vùng Poty-coat của CP ở SMV có mã số CAA45307 cho 
thấy dòng SL2 có sự sai khác ở 3 vị trí amino acid (vị trí 198, 199, 200) so 
với CAA45307 và với dòng SL1 (Hình 3.5). 
Hình 3.5. So sánh trình tự amino acid của vùng Poty-coat của dòng SL1, SL2 
và của protein có mã số CAA45307 
3.1.2. Phân tích sự đa dạng của trình tự gen CP của các dòng SMV 
 Tiến hành so sánh trình tự nucleotide của đoạn gen CP của SMV dòng 
SL1 và SL2, Việt Nam với 18 trình tự gen CP đã công bố trên Ngân hàng gen 
 69
quốc tế (Bảng 3.4) để xác định hệ số tương đồng và hệ số sai khác của các 
trình tự gen CP, đồng thời thiết lập sơ đồ hình cây để phân tích sự đa dạng 
của các dòng virus thông qua trình tự gen CP của SMV. 
Bảng 3.4. Các trình tự đoạn gen CP của hai dòng virus Việt Nam và các trình 
tự có mã số trên Ngân hàng gen quốc tế được sử dụng trong phân tích 
STT Dòng virus/ Mã 
số trên GenBank 
Vùng phân lập Năm công bố Tác giả 
1 HG965102 (SL1) Sơn La, Việt Nam 2014 Lo et al. 
2 HG965103 (SL2) Sơn La, Việt Nam 2014 Lo et al. 
3 X63771 Trung Quốc 1992 Chu 
4 U25673 Trung Quốc 1995 Chu et al. 
5 AB100445 Nhật Bản 2003 Kanematsu et al. 
6 AB100447 Nhật Bản 2003 Kanematsu et al. 
7 AB100448 Nhật Bản 2003 Kanematsu et al. 
8 AB206830 Nhật Bản 2008 Saruta et al. 
9 AB206831 Nhật Bản 2008 Saruta et al. 
10 AB206832 Nhật Bản 2008 Saruta et al. 
11 AB206833 Nhật Bản 2008 Saruta et al. 
12 AB206834 Nhật Bản 2008 Saruta et al. 
13 AF200578 Hoa Kỳ 1999 Latorre 
14 AJ609297 Hàn Quốc 2003 Choi 
15 AJ609298 Hàn Quốc 2003 Choi 
16 AY799852 Hoa Kỳ 2004 Fayad et al. 
17 DQ517427 Trung Quốc 2006 Wang 
18 DQ517430 Trung Quốc 2006 Wang 
19 EU931454 Canada 2009 Stromvik et al. 
20 JF431105 Ukraine 2012 Sherepitko et al. 
 70 
Bảng 3.5. Hệ số tương đồng và hệ số sai khác về trình tự nucleotide của đoạn gen CP của SMV 
 71
 Trong các trình tự của đoạn gen CP thuộc 20 dòng SMV được sử dụng 
so sánh có 2 dòng phân lập từ Việt Nam, 8 dòng từ Nhật Bản, 2 dòng từ Hàn 
Quốc, 2 dòng từ Hoa Kỳ, 4 dòng từ Trung Quốc, 1 dòng từ Canada, 1 dòng từ 
Ukraine, kết quả ở bảng 3.5 cho thấy hệ số tương đồng giữa các cặp so sánh 
dao động từ 89,6% đến 99,7%; còn hệ số sai khác từ 0,3% đến 12,3%. Mối 
quan hệ giữa các dòng SMV dựa trên cơ sở so sánh trình tự nucleotide của 
đoạn gen CP được thể hiện ở hình 3.6. 
Hình 3.6. Sơ đồ hình cây về mối quan hệ di truyền giữa các dòng SMV được 
thiết lập dựa trên trình tự đoạn gen CP 
(SL1- dòng SL1; SL2- dòng SL2; 18 dòng SMV có mã số trên GenBank) 
 Sơ đồ hình cây ở hình 3.6 dựa trên kết quả so sánh trình tự nucleotide 
của đoạn gen CP cho thấy 20 dòng virus phân bố ở 4 nhóm (I, II, II