Luận án Phân lập và tuyển chọn vi khuẩn kết tụ sinh học, chuyển hóa N và tích lũy poly-p trong nước thải sản xuất hủ tiếu Mỹ Tho và ứng dụng xử lý nước thải

các đơn vị màng 
lọc để kéo dài tuổi thọ của màng, bởi vì vật liệu làm màng rất nhạy cảm với sự làm 
bẩn và hình thành của một lớp hấp phụ bởi chất béo, protein, và chất nhỏ khác (Hình 
2.19). 
54 
Hình 2.19 Phân loại màng lọc dựa trên kích thước. 
(Nguồn: WEF, 2011) 
55 
CHƯƠNG 3 
PHƯƠNG TIỆN VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 
Các mẫu vật thu tại 08 cơ sở sản xuất hủ tiếu tại xã Mỹ Phong, Thành phố Mỹ 
Tho, tỉnh Tiền Giang. Sử dụng các dụng cụ và trang thiết bị cũng như cơ sở vật chất 
có tại Phòng thí nghiệm Vi sinh vật đất, Vi sinh vật môi trường và Sinh học phân tử 
thuộc Viện Nghiên cứu và Phát triển Công nghệ Sinh học, trường Đại học Cần Thơ. 
Giai đoạn thử nghiệm hiệu quả các dòng vi khuẩn trên nước thải sản xuất hủ tiếu tại 
hộ ông Nguyễn Văn Thuận, ngụ ấp Hội Gia, xã Mỹ Phong, Thành phố Mỹ Tho, tỉnh 
Tiền Giang. Thời gian thực hiện các nội dung thí nghiệm bắt đầu từ tháng 02 năm 
2016 đến tháng 8 năm 2018, và việc phân tích dữ liệu đến tháng 10 năm 2018. 
3.1 Vật liệu thí nghiệm 
3.1.1 Môi trường nuôi cấy 
3.1.1.1 Môi trường phân lập vi khuẩn sản xuất chất kết tụ sinh học protein 
(Nguồn: Hazana et al., 2008) 
Bảng 3.1 Môi trường phân lập vi khuẩn sản xuất chất kết tụ sinh học protein. 
Hóa chất Hàm lượng 
Glucose 20 g 
L- Acid glutamic 50 g 
MgSO4.7H2O 0,5 g 
Yeast ex 0,5 g 
Agar 20 g (bổ sung khi đổ môi trường thạch) 
H2O 1 L 
pH 7 
56 
3.1.1.2 Môi trường phân lập vi khuẩn sản xuất chất kết tụ sinh học polysaccharide 
(Nguồn: Deng et al., 2002) 
Bảng 3.2 Môi trường phân lập vi khuẩn sản xuất chất kết tụ sinh học polysaccharide. 
Hóa chất Hàm lượng 
Glucose 10 g 
KH2PO4 5 g 
K2HPO4 0,2 g 
MgSO4.7H2O 0,1 g 
NaCl 0,1 g 
Carbamide 0,5 g 
Yeast ex 0,5 g 
Agar 20 g (bổ sung khi đổ môi trường thạch) 
H2O 1 L 
3.1.1.3 Môi trường phân lập vi khuẩn chuyển hóa nitơ (Zhao et al., 2010) 
Bảng 3.3 Môi trường phân lập vi khuẩn chuyển hóa nitơ. 
Hóa chất 
Đơn 
vị 
tính 
Môi trường 
bổ sung 
Nitrite 
Môi trường 
bổ sung 
Nitrate 
Môi trường 
bổ sung 
Ammonium 
Môi trường bổ 
sung T (Nitrite, 
Nitrate, 
Ammonium) 
NH4Cl g/L 0,12 0,12 
NaNO3 g/L 0,04 0,04 
NaNO2 g/L 0,04 0,04 
NaCl g/L 4 4 4 4 
Na2HPO4.12H2O g/L 21,5 21,5 21,5 21,5 
KH2PO4 g/L 0,9 0,9 0,9 0,9 
Vi lượng * mL/L 3 3 3 3 
Glucoze g/L 1 1 3 2 
Agar g/L 20 20 20 20 
57 
3.1.1.4 Môi trường phân lập vi khuẩn tích lũy poly-P (Wang et al., 2008) 
Bảng 3.4 Môi trường phân lập vi khuẩn tích luỹ poly-P. 
Hóa chất Hàm lượng 
Glucose 0,5 g/L 
Acetate 5 g/L 
Succinate 0,5 g/L 
NH4Cl 0,02 g/L 
KH2PO4 0.088 g/L 
Pepton 0,02 g/L 
MgSO4.7H2O 0,01 g/L 
CaCl2 0,005 g/L 
Dung dịch khoáng vi lượng 0,5 mL/L 
Agar 20 g/L 
3.1.2 Nguyên liệu và vật liệu thí nghiệm 
Nước thải hủ tiếu ở xã Mỹ Phong, thành phố Mỹ Tho, tỉnh Tiền Giang và các 
thiết bị phòng thí nghiệm như máy li tâm, nồi hấp tuyệt trùng, tủ lạnh, tủ ấm, tủ sấy, 
máy cất nước, loại hóa chất, các dụng cụ thí nghiệm khác, các môi trường nuôi cấy vi 
sinh vật.. 
3.2 Phương pháp nghiên cứu 
3.2.1 Thu mẫu 
Nước thải được thu ở cuối nguồn thải của 08 cơ sở sản xuất hủ tiếu Mỹ Tho; 
mỗi cơ sở thu 03 điểm (mỗi điểm 10 lít nước thải) và chuyển về phòng thí nghiệm. 
Sau đó trộn lại với nhau và khảo sát thành phần của nước thải ô nhiễm. Những mẫu 
nước thải sau khi đem đo các chỉ tiêu TSS được trữ lạnh ở nhiệt độ 4°C trong tủ lạnh. 
58 
Bảng 3.5 Địa điểm 08 cơ sở sản xuất hủ tiếu ở thành phố Mỹ Tho, Tiền Giang được 
 lấy mẫu. 
Mẫu Chủ cơ sở Địa điểm 
1 Đỗ Thị Năm ấp Mỹ Hòa, xã Mỹ Phong 
2 Phan Thị Ngọc Thu ấp Mỹ Hòa, xã Mỹ Phong 
3 Phạm Hữu Tấn ấp Mỹ Hòa, xã Mỹ Phong 
4 Nguyễn Bá Khánh ấp Mỹ Hòa, xã Mỹ Phong 
5 Nguyễn Thị Kim Liên ấp Mỹ Hòa, xã Mỹ Phong 
6 Nguyễn Văn Thuận ấp Hội Gia, xã Mỹ Phong 
7 Nguyễn Văn Tân ấp Hội Gia, xã Mỹ Phong 
8 Lê Hữu Khương ấp Hội Gia, xã Mỹ Phong 
3.2.2 Đếm mật số vi khuẩn 
Mật số vi khuẩn được đếm theo phương pháp đếm sống của Hoben and 
Somasegaran (1982) dựa vào sự hình thành khuẩn lạc trên môi trường agar như sau 
(Hình 3.1): 
Tiến hành pha loãng thành nhiều nồng độ khác nhau theo bậc 10 liên tiếp trong 
ống nghiệm bằng cách trộn đều mẫu nước thải cho vi khuẩn phân bổ đều trong dung 
dịch và hút 1 mL mẫu vào ống nghiệm thứ nhất có 9 mL nước cất vô trùng. Lúc này 
mẫu được pha loãng 10 lần, độ pha loãng là 1/101. Tiếp tục hút 1mL mẫu ở ống 
nghiệm thứ nhất này sang ống nghiệm thứ hai chứa 9 mL nước cất vô trùng (trộn 
đều trước khi hút), mẫu gốc được pha loãng được pha loãng 100 lần, độ pha loãng 
1/102. Tiếp tục pha loãng để đạt được nồng độ pha loãng 1/103, 1/104, ... 
Trộn đều mẫu trên máy vortex sau đó sử dụng micropipet hút lần lượt 03 lần 20 
μL mẫu cùng nồng độ nhỏ giọt lên đĩa. Đĩa petri chứa môi trường được chia làm 3 ô, 
mỗi ô trên đĩa nhỏ 03 giọt (20 μL/giọt) tương ứng một nồng độ pha loãng. Nhỏ sao 
cho từng giọt đều nằm trong ô và không dính nhau. 
59 
Đĩa môi trường đã nhỏ giọt mẫu được ủ ở 30oC trong tủ ủ vi sinh vật từ 12 - 24 
giờ (Vi khuẩn kết tụ sinh học), 24 - 48 giờ (vi khuẩn chuyển hóa nitơ) và 48 - 72 giờ 
(vi khuẩn tích lũy poly-P) để vi khuẩn phát triển và đếm mật số vi khuẩn. 
3.2.3 Phân lập vi khuẩn 
3.2.3.1 Phân lập vi khuẩn 
Dùng micropipet hút 50 µL mẫu nước (ở độ pha loãng thích hợp) rồi trải lên 
đĩa môi trường phân lập. Dùng que trải mẫu phân phối dịch mẫu trải đều khắp mặt 
thạch, ủ trong tủ ủ vi sinh ở nhiệt độ 30oC trong thời gian 24 giờ (Vi khuẩn kết tụ 
sinh học), 48 giờ (vi khuẩn chuyển hóa nitơ) và 72 giờ (vi khuẩn tích lũy poly-P). 
(A) 
(B) 
Hình 3.1 (A) Pha loãng mẫu và đếm sống nhỏ giọt 
 (B) xác định mật số vi khuẩn. 
Đếm: Chọn đếm ô ở độ pha loãng có các khuẩn lạc rời và số lượng đủ lớn trong 
mỗi giọt, tiến hành đếm và tính số vi khuẩn trung bình theo công thức (Nguyễn Đức 
Lượng và ctv., 2003): 
Mật số vi khuẩn/mL mẫu (CFU/mL) = * D *1000. 
Trong đó: 
n 
v 
10-4 
10-2 
10-3 
60 
n - Số khuẩn lạc trung bình trong đĩa petri ở một độ pha loãng nhất định. 
v - Thể tích dịch mẫu nuôi cấy (L). 
D - Hệ số pha loãng. 
1000 - Hệ số quy đổi từ mL sang L. 
Khi vi khuẩn phát triển thành khuẩn lạc, chọn các khuẩn lạc rời rạc và có hình 
thái khác nhau trên môi trường phân lập (về hình dạng, màu sắc, kích thước, bìa, độ 
nổi), mỗi dạng khuẩn lạc cấy chuyển nhiều lần sang môi trường cùng loại đến khi các 
khuẩn lạc ròng. 
Trong phân lập và tách ròng vi khuẩn, vi khuẩn cần được tách rời từng tế bào ra 
và phát triển thành một khuẩn lạc độc lập. Chúng được phân lập bằng cách cấy ria. 
Chọn khuẩn lạc rời cấy chuyển vào ống chứa môi trường cùng loại. Ống đã cấy 
chuyển được ủ ở 30oC trong tủ ủ vi sinh vật để vi khuẩn phát triển. Sau đó đem trữ 
lạnh để chờ kiểm tra độ ròng dưới kính hiển vi. Kiểm tra độ ròng của vi khuẩn phân 
lập dưới kính hiển vi. 
3.2.3.2 Trữ mẫu và mô tả đặc điểm khuẩn lạc của vi khuẩn 
Những dòng vi khuẩn đã ròng được cấy trữ sang 02 ống môi trường cùng loại, 
được ủ ở 30oC trong tủ ủ vi sinh vật từ 24 - 48 giờ để vi khuẩn phát triển sau đó mang 
trữ lạnh (Hình 3.2). 
Đồng thời, các mẫu ròng được cấy trở lại đĩa môi trường phân lập, sau đó ủ từ 
24 - 48 giờ ở 30ºC để mô tả đặc điểm khuẩn lạc (Cao Ngọc Điệp và Nguyễn Hữu 
Hiệp, 2002). 
Hình 3.2 Mẫu đã kiểm ròng được trữ trong ống nghiệm. 
61 
 3.2.4 Tuyển chọn và nhận diện các dòng vi khuẩn kết tụ sinh học, vi khuẩn 
chuyển hóa Nitơ N và vi khuẩn poly-P 
Sau khi phân lập được các dòng vi khuẩn từ nước thải của các cơ sở sản xuất hủ 
tiếu Mỹ Tho, tiến hành tuyển chọn các dòng có độ hữu hiệu cao và tiếp đến nhận diện 
(xác định) các dòng vi khuẩn này để làm cơ sở cho việc xử lý nước thải sau này. 
3.2.4.1 Tuyển chọn 
* Tuyển chọn các dòng Vi khuẩn kết tụ sinh học trên môi trường protein và 
polysaccharide 
Kiểm tra khả năng kết tụ của chất kết tụ sinh học với dung dịch Kaolin nhằm 
tuyển chọn ra dòng vi khuẩn sản xuất kết tụ sinh học hiệu quả cao. Mỗi dòng vi 
khuẩn phân lập được nuôi trong 10 mL môi trường lỏng (môi trường vi khuẩn sản 
xuất kết tụ sinh học) trong ống falcon 50 mL, lắc 200 vòng/phút, ở nhiệt độ phòng, 
nuôi trong 01 ngày cho vi khuẩn phát triển tạo chất kết tụ sinh học. 
Kiểm tra khả năng kết tụ của vi khuẩn: lấy 90 mL dung dich Kaolin (5g/L) thêm 
vào 10 mL dung dịch CaCl2 (1%) trong bình tam giác 250 mL, sau đó thêm 0,1 mL 
dung dịch vi khuẩn sản xuất chất kết tụ sinh học, mẫu đối chứng thực hiện tương tự 
nhưng không chủng vi khuẩn sản xuất chất kết tụ sinh học. Khuấy hỗn hợp trên trong 
30 giây ở 60 vòng/phút bằng máy lắc, giữ yên hỗn hợp trong 1 giờ, lấy phần trong đo 
OD ở độ bước sóng 550 nm. 
Tỷ lệ kết tụ % = (OD đối chứng – OD mẫu)/OD đối chứng x 100 
Kết quả chọn dòng Vi khuẩn kết tụ sinh học tốt nhất được chọn để tiến hành thí 
nghiệm tiếp theo. 
Trữ lạnh ở -20oC để bảo quản DNA. 
Xác định tỷ lệ kết tụ sinh học 
Dòng vi khuẩn kết tụ sinh học protein tốt nhất và dòng vi khuẩn kết tụ sinh học 
polysaccharide tốt nhất được nuôi cấy trong 50 mL môi trường tổng hợp chất kết tụ 
sinh học protein (Hazana et al., 2008), với thành phần 1 L môi trường gồm: glucose 
20 g, L- acid glutamic 50 g, MgSO4.7H2O 0,5 g, Yeast ex 0,5 g và điều chỉnh giá trị 
62 
pH = 7 trong bình tam giác 100 mL. Lắc trên máy lắc xoay vòng ở tốc độ 150 
vòng/phút ở nhiệt độ 30oC. 
Dung dịch vi khuẩn sau thời gian một ngày nuôi cấy được sử dụng để kiểm tra 
khả năng kết tụ bằng hỗn hợp gồm 90 mL dung dịch kaolin (5 g/L), 10 mL dung dịch 
CaCl2 1% và bổ sung 100 µL dung dịch vi khuẩn với mật số >109 tế bào/mL (tỷ lệ 
0,1%). Hỗn hợp được khuấy đều 60 vòng/phút trong 30 giây bằng máy lắc sau đó để 
yên 5 phút, phần trong ở trên cách mặt nước 2 cm được lấy để xác định độ đục quang 
phổ ở bước sóng 550 nm (Deng et al., 2003). Mẫu đối chứng thực hiện tương tự 
nhưng không bổ sung dịch vi khuẩn, tỷ lệ kết tụ được tính theo công thức: 
 ODđối chứng – ODmẫu 
 Tỷ lệ kết tụ = X 100% 
 OD đối chứng 
Phương pháp này được sử dụng để xác định tỷ lệ kết tụ sinh học của dòng vi 
khuẩn kết tụ sinh học protein và polysaccharide tốt nhất trong tất cả các thí nghiệm. 
Tối ưu hóa các yếu tố ảnh hưởng đến hiệu quả kết tụ sinh học. 
Tiến hành khảo sát ảnh hưởng của pH môi trường, thành phần môi trường nuôi 
cấy, liều lượng dung dịch vi khuẩn đến hiệu quả kết tụ sinh học. Từ đó xác định được 
các điều kiện thích hợp cho hiệu quả kết tụ cao nhất. 
Khảo sát ảnh hưởng của pH môi trường nuôi ủ. 
Ảnh hưởng của pH môi trường nuôi ủ đến khả năng tổng hợp chất kết tụ sinh 
học của chủng vi khuẩn được khảo sát trong khoảng pH từ 2 đến 11. 
Thí nghiệm được thực hiện gồm 10 nghiệm thức tương ứng với mỗi nghiệm 
thức là một giá trị pH khác nhau: 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11. Mỗi nghiệm thức được 
thực hiện với 3 lần lặp lại. Chủng vi khuẩn được nuôi trong môi trường tổng hợp chất 
kết tụ sinh học protein (Deng et al., 2003) với giá trị pH được điều chỉnh phù hợp ở 
từng nghiệm thức bằng dung dịch HCl 1M hay NaOH 3M (Merck). Lắc trên máy lắc 
xoay vòng ở tốc độ 150 vòng/phút ở nhiệt độ 30oC. Sau thời gian một ngày, dung 
dịch vi khuẩn sẽ được đánh giá khả năng kết tụ theo phương pháp đã được mô tả. Từ 
63 
đó chọn được giá trị pH môi trường nuôi sinh khối thích hợp cho sự tổng hợp chất 
kết tụ sinh học đạt hiệu quả kết tụ cao nhất. 
Khảo sát ảnh hưởng của nguồn carbon, nitrogen và khoáng vô cơ 
Các nguồn carbon, nitrogen và khoáng vô cơ khảo sát được trình bày trong 
Bảng. Các nguồn dinh dưỡng này được lựa chọn vì nguồn N hữu cơ phổ biến là 
Yeast ex (Merck) và các hóa chất còn lại của Trung Quốc. 
Phương pháp tiến hành bằng cách nhân sinh khối chủng vi khuẩn trong 20 mL 
môi trường với sự phối hợp của ba nguồn carbon, nitrogen và khoáng vô cơ ở trên, 
với giá trị pH đã chọn, nhiệt độ 30oC, lắc 150 vòng/phút, sau thời gian một ngày tiến 
hành xác định hiệu quả kết tụ với dung dịch kaolin theo như mô tả. Phối hợp ba 
nguồn dinh dưỡng (03 nguồn carbon + 04 nguồn nitrogen + 04 nguồn khoáng vô cơ) 
có 48 nghiệm thức khác nhau và mỗi nghiệm thức được thực hiện 03 lần lặp lại 
(Bảng 3.6) (phân tích theo lô phụ bậc 2). 
Bảng 3.6 Các nguồn carbon, nitrogen và khoáng vô cơ được bổ sung trong môi 
 trường nuôi sinh khối chủng vi khuẩn kết tụ sinh học tốt nhất. 
Nguồn khoáng vô cơ Nguồn nitrogen Nguồn carbon 
KCl (0,5%) 
FeCl3 (0,5%) 
CaCl2 (0,5%) 
K2HPO4(0,2%) + KH2PO4(0,5%) 
Acid glutamic (5%) 
Yeast ex (0,05%) 
Urea (0,05%) 
(NH4)2SO4 (0,05%) 
Glucose (1%) 
Sucrose (1%) 
Tinh bột (1%) 
Kết quả cuối cùng chọn ra được môi trường tối ưu có nguồn carbon, nitrogen và 
khoáng vô cơ thích hợp cho vi khuẩn tổng hợp chất kết tụ sinh học cho tỷ lệ kết tụ 
cao nhất. Ở dòng vi khuẩn kết tụ sinh học thì nguồn khoáng là nguồn lô phụ bậc 2, 
còn nguồn carbon là lô chính hay ngược lại để tìm ra kết quả tối ưu. 
Khảo sát ảnh hưởng của tỷ lệ nguồn carbon, nitrogen và khoáng vô cơ đến hiệu 
quả tổng hợp chất kết tụ sinh học 
Nhân sinh khối chủng vi khuẩn trong môi trường gồm 03 nguồn carbon, 
nitrogen và khoáng đã được chọn ở thí nghiệm trên. Mỗi nguồn dinh dưỡng sẽ được 
64 
chia thành 03 mức độ khác nhau và phối hợp tạo ra 27 nghiệm thức với tỷ lệ carbon, 
nitrogen và khoáng vô cơ bổ sung khác nhau (Bảng 3.7). 
Chủng vi khuẩn được nhân sinh khối trong ống fancol 50 mL chứa 20 mL môi 
trường tổ hợp từ 03 nguồn dinh dưỡng với tỷ lệ khác nhau, điều chỉnh về giá trị pH 
cho tỷ lệ kết tụ cao nhất đã chọn, ủ lắc 150 vòng/phút ở nhiệt độ 30oC. Đánh giá khả 
năng kết tụ với dung dịch kaolin, phân tích hồi quy tuyến tính 03 nhân tố từ đó chọn 
ra nghiệm thức có tỷ lệ bổ sung thích hợp cho vi khuẩn tổng hợp chất kết tụ sinh học 
cho tỷ lệ kết tụ cao nhất. 
Bảng 3.7 Nghiệm thức bố trí theo kiểu hoàn toàn ngẫu nhiên khảo sát ảnh hưởng của 
các tỷ lệ carbon, nitrogen và khoáng vô cơ đến hiệu quả kết tụ sinh học ở dòng kết tụ 
sinh học polysaccharide hat protein tốt nhất. 
Nguồn 
khoáng vô cơ 
Nguồn nitrogen Nguồn carbon 
N (b1%) N (b2%) N (b3%) N (b4%) 
K (a1%) 
1 4 7 10 C (c1%) 
2 5 8 11 C (c2%) 
3 6 9 12 C (c3%) 
K (a2%) 
13 16 19 22 C (c1%) 
14 17 20 23 C (c2%) 
15 18 21 24 C (c3%) 
K (a3%) 
25 28 31 34 C (c1%) 
26 29 32 35 C (c2%) 
27 30 33 36 C (c3%) 
K (a4%) 
37 40 43 46 C (c1%) 
38 41 44 47 C (c2%) 
39 42 45 48 C (c3%) 
Ghi chú: K: nguồn khoáng vô cơ; a: mức độ (%); N: nguồn nitrogen; b: mức độ (%); C: 
nguồn Carbon, c: mức độ (%). 
Ở dòng vi khuẩn thì nguồn carbon là lô chính, và nguồn khoáng sẽ là lô phụ bậc 2. 
65 
Khảo sát ảnh hưởng của nồng độ dịch vi khuẩn bổ sung 
Tiến hành kiểm tra khả năng kết tụ sinh học của chủng vi khuẩn với kaolin ở 
những nồng độ khác nhau: 0,01; 0,05; 0,10; 0,15; 0,20; 0,25; 0,30%. Đánh giá khả 
năng kết tụ bằng cách bổ sung 10 mL dung dịch 1% muối kim loại đã xác định ở thí 
nghiệm trên vào 90 mL dung dịch kaolin (5 g/L) vào cốc 250 mL. Sau đó thêm dung 
dịch vi khuẩn tổng hợp chất kết tụ sinh học ở những nồng độ khác nhau. Mẫu đối 
chứng thực hiện tương tự nhưng không chủng vi khuẩn tổng hợp chất kết tụ sinh học. 
Khuấy đều hỗn hợp trên trong 30 giây bằng máy khuấy từ, giữ yên hỗn hợp trong 5 
phút, lấy phần trong cách mặt nước 2 đến 3 cm xác định chỉ số OD ở bước sóng 550 
nm. Tính khả năng kết tụ và chọn nồng độ vi khuẩn tổng hợp chất kết tụ sinh học có 
khả năng kết tụ cao nhất. Thí nghiệm gồm 07 nghiệm thức và mỗi nghiệm thức được 
thực hiện với 3 lần lặp lại. 
* Tuyển chọn các dòng vi khuẩn chuyển hóa Nitơ 
Các dòng vi khuẩn phân lập được cấy trên 4 loại môi trường có bổ sung NH4+, 
NO3-, NO2- và T (NH4+, NO3-, NO2-) trong đó NH4+ và NO3- ở nồng độ 100 mM, NO2- 
ở nồng độ 10 mM để so sánh khả năng phát triển của chúng (Bảng 3.8). 
Chọn những dòng vi khuẩn phát triển được trên môi trường có bổ sung NH4+, 
NO3-, NO2- và T (NH4+, NO3-, NO2-) trong đó NH4+ và NO3- ở nồng độ 100mM, NO2- 
ở nồng độ 10 mM để tiếp tục kiểm tra khả năng phát triển của chúng trên môi trường 
có bổ sung NH4+, NO3-, NO2- và T (NH4+, NO3-, NO2-) ở nồng độ cao hơn trong đó 
NH4+ và NO3- ở nồng độ tăng dần 200 mM, 300 mM, 400 mM, 500 mM và NO2- ở 
nồng độ tăng dần 20 mM, 30 mM, 40 mM, 50 mM, 60 mM. 
Sau 48 giờ nuôi cấy, đánh giá các vi khuẩn phát triển trên môi trường từng loại 
theo cảm quan bên ngoài với vi khuẩn phát triển trên dĩa của các nồng độ khác nhau 
như sau: 
+ Chủng vi khuẩn nào không phát triển, không có vi khuẩn nào trên dĩa (ký 
hiệu: -): được xem là không có khả năng oxy hóa hoặc khử môi trường đó (không có 
khả năng chuyển hóa). 
66 
+ Chủng phát triển yếu, có vi khuẩn phát triển trên dĩa, với số lượng yếu (ký 
hiệu: +): là chủng được xem là có khả năng chuyển hóa thấp. 
+ Chủng phát triển trung bình, có vi khuẩn phát triển trên dĩa, với số lượng 
trung bình (ký hiệu: ++): là chủng được xem là có khả năng chuyển hóa trung bình. 
+ Chủng nào phát triển mạnh, có vi khuẩn phát triển trên dĩa, với số lượng lớn 
(ký hiệu: +++): là chủng được xem là có khả năng chuyển hóa mạnh. 
Bảng 3.8 Thành phần môi trường cơ bản bổ sung nitrate, nitrite và ammonium. 
Hóa chất 
Đơn 
vị 
tính 
Môi trường 
bổ sung 
Nitrite 
Môi trường 
bổ sung 
Nitrate 
Môi trường bổ 
sung 
Ammonium 
Môi trường 
bổ sung T 
(Nitrite, 
Nitrate, 
Ammonium) 
NH4Cl g/L 5,4 5,4 
NaNO3 g/L 8,5 8,5 
NaNO2 g/L 0,69 0,69 
NaCl g/L 4 4 4 4 
Na2HPO4.12H2O g/L 21,5 21,5 21,5 21,5 
KH2PO4 g/L 0,9 0,9 0,9 0,9 
Vi lượng * mL/L 3 3 3 3 
Glucose g/L 1 1 3 2 
Agar g/L 20 20 20 20 
* Tuyển chọn các dòng vi khuẩn tích lũy poly-P 
Các dòng vi khuẩn sau khi được kiểm tra ròng tiến hành nuôi trên môi trường 
lỏng trên máy lắc để kiểm tra khả năng tích lũy poly-P. Mỗi dòng vi khuẩn được 
chủng vào 05 mL môi trường sau thời gian 4 - 6 ngày. 
Phương pháp xác định hàm lượng poly-P: Xác định hàm lượng poly-P theo 
Wang (2008) và Eixler ( 2005). 
Ly trích poly-P (Eixler et al., 2005): Nuôi vi khuẩn trong môi trường có chứa 
04 mL ampicillin, tích lũy poly-P, lắc 160 vòng/phút, sau 06 ngày nuôi tiến hành ly 
67 
tâm 12.000 vòng/phút và trong thời gian 10 phút để thu sinh khối, loại bỏ phần nước 
dịch. Hòa tan sinh khối trong 4 mL NaOH 0,2 M, ủ trong 20 giờ để trích poly-P. 
Dịch tế bào được lọc qua giấy lọc Sartorius Stedium 17598 0,45 μm, CE để loại bỏ 
xác tế bào để thu dịch lọc chứa poly-P. Dịch lọc thu được chia làm 02 phần: 
Phần 1: đo để xác định lượng phosphate tự do (PP1) trong dịch bằng phương 
pháp Molypdate blue (so màu ở bước sóng 880 nm trên máy Beckman Coulter DU 
640B). 
Phần 2: thủy phân bằng HCl 1 M ở 100oC trong thời gian 10 phút. Dịch thủy 
phân sau đó để nguội và đem đo hàm lượng phosphate (PP2) với phương pháp giống 
như phần 1. Hàm lượng poly-P nội bào được tính bằng hiệu số giữa PP2-PP1. 
Phương pháp đo lân: 
Chuẩn bị hóa chất để đo: 
Pha dung dịch A: 
+ Dung dịch 1 (dd1): 140 mL H2SO4 đậm đặc + 1 L nước cất. 
+ Dung dịch 2 (dd2): 12g amonium molypdate (NH4)6Mo2O24.4H2O + 25 mL 
nước cất đun nóng cho tan. 
+ Dung dịch 3 (dd3): 0,2908g Potassium antimonynl tartrate KSbC4H2O6 + 100 
mL nước cất. 
Trộn dd1, dd2, dd3 và thêm nước cất sao cho đủ 2 L. 
Dung dịch B: 200 mL dung dịch A + 1,050 g acid ascorbic. 
Dựng đường chuẩn P2O5: gồm 06 ống nghiệm (20 mL) đánh số từ 0 đến 5, lần 
lượt thêm vào các ống nghiệm trên theo từng thành phần như Bảng 3.9. 
Bảng 3.9 Thành phần hóa chất xây dựng đường lân chuẩn. 
Hóa chất Ống 0 Ống 1 Ống 2 Ống 3 Ống 4 Ống 5 
Nước khử khoáng (mL) 5 5 5 5 5 5 
Dung dịch lân chuẩn (mL) 0 0,5 1 1,5 2 2,5 
Dung dịch B (mL) 4 4 4 4 4 4 
Nước khử khoáng (mL) 3,5 3 2,5 2 1,5 1 
68 
Tiến hành vortex các ống nghiệm và để ở nhiệt độ phòng khoảng 20 phút để 
phản ứng tạo màu xảy ra theo nguyên tắc hàm lượng P2O5 càng cao thì màu xanh 
càng đậm dần. 
Hình 3.3 Đường chuẩn đo lân. 
Sử dụng giá trị OD của ống số 0 (không có màu xanh) làm mẫu blank để điều 
chỉnh giá trị về 0, tiến hành đo OD của 05 ống còn lại. 05 ống theo thứ tự từ 1 - 5 có 
màu xanh đậm dần sẽ tương ứng với giá trị OD tăng dần (Hình 3.3). 
Đo hàm lượng lân hòa tan có trong mẫu: Mẫu đư