Luận án Sàng lọc các thảo dược có khả năng ức chế Enzyme Xanthine Oxidase để giảm sự tạo thành Acid Uric

hấp thu ánh sáng ở bước sĩng 750 nm. 
Cường độ màu của dung dịch tỷ lệ thuận với nồng độ protein. 
 Phương pháp tiến hành: Xây dựng dung dịch protein chuẩn với dãy nồng 
độ dung dịch bovine serum albumin (BSA) (BSA 1 mg/mL trong NaCl 0,9%): 0; 
0,05; 0,1; 0,15; 0,2; 0,25; 0,3; 0,35 và 0,4 (mg/mL) (Bảng 3.1). Dùng thuốc thử 
20 phút Ly tâm 5.000 vịng/phút 
(Bảo quản ở -20°C) 
4°C 
3 L sữa bị tươi 
EDTA, salicylate, 
cysteine·HCl, PMSF, 
Na2CO3, pancreatin 
Để qua đêm 
(NH4)2SO4 
1-butanol 
Để qua đêm 
Lấy lớp dung dịch phía dưới 
(NH4)2SO4 
 1 giờ 
Lấy phần nổi phía trên 
Lấy phần rắn 
Thẩm tích 72 giờ 
Đơng khơ chân khơng 
Enzyme XO 
46 
Folin cho thấy sự thay đổi màu của các dung dịch, dung dịch chứa màu càng đậm 
thì chứa hàm lượng protein càng cao. Đo độ hấp thu của từng dung dịch trên máy 
quang phổ và vẽ đường chuẩn về sự phụ thuộc của độ hấp thu A vào nồng độ 
dung dịch protein chuẩn. 
Bảng 3.1: Bảng xây dựng đường chuẩn protein theo phương pháp Lowry 
Ống nghiệm 1 2 3 4 5 6 7 8 9 
Nồng độ protein 
(mg/mL) 
0 0,05 0,1 0,15 0,2 0,25 0,3 0,35 0,4 
Thể tích protein chuẩn 
(L) 
0 50 100 150 200 250 300 350 400 
Thể tích NaOH 0,01 N 
(L) 
1000 950 900 850 800 750 700 650 600 
 Thể tích kiềm (C) (mL) 5 5 5 5 5 5 5 5 5 
Thuốc thử Folin (mL) 0,5 0,5 0,5 0,5 0,5 0,5 0,5 0,5 0,5 
Xác định hàm lượng protein trong mẫu phân tích: Lấy 0,5 mL dung dịch 
cần xác định hàm lượng protein (1 mg/mL trong NaOH 0,01 N) cho vào ống 
nghiệm, cho thêm 5,5 mL dung dịch kiềm C (xem phụ lục). Lắc đều, để ở nhiệt 
độ phịng 10 phút. Tiếp tục cho thêm 0,5 mL thuốc thử Folin 0,5 N rồi lắc đều, 
dung dịch protein sẽ chuyển từ màu vàng sang màu xanh nước biển, để yên 30 
phút và đo độ hấp thu của dung dịch ở bước sĩng 750 nm. Dựa vào đường chuẩn 
suy ra được nồng độ protein trong mẫu tương ứng (Lowry et al., 1951). 
3.2.1.3 Xác định sự hiện diện của enzyme xanthine oxidase sau khi 
phân lập bằng phương pháp điện di SDS-PAGE 
Phân tích điện di SDS-PAGE được thực hiện theo phương pháp của Ưzer et 
al. (1999) với gel polyacrylamide 6%. 
Nguyên tắc: điện di SDS-PAGE là kỹ thuật điện di trên gel polyacrylamide 
cĩ sự hiện diện của chất gây biến tính SDS (Sodium Dodecyl Sulphate). Các 
phân tử SDS mang điện âm sẽ tương tác với protein và bám dọc chiều dài phân 
tử. Phân tử protein hồn tồn tích điện âm và dịch chuyển trong điện trường từ 
cực âm sang cực dương. Chất khử beta-mercaptoethanol khử cầu nối disulfite 
trong phân tử protein. 
47 
Các tiểu đơn vị trong hỗn hợp enzyme cĩ cùng mật độ điện tích và cùng di 
chuyển trong một điện trường như nhau. Khi đĩ tốc độ di chuyển trong điện 
trường của enzyme phụ thuộc chủ yếu vào kích thước phân tử và độ tinh sạch của 
sản phẩm. 
Gel điện di gồm 2 lớp: 
- Lớp gel tập trung: Nằm ở trên, giúp tập trung protein tạo thành một băng. 
Lớp gel tập trung này cĩ kích thước lỗ rất lớn (acrylamide 4%) cho phép 
protein di chuyển nhanh và tập trung lại dưới tác dụng của điện trường. 
- Lớp gel phân tích: Nằm ở dưới, giúp các protein từ một hỗn hợp protein 
xuất phát ban đầu phân tách nhau theo trọng lượng phân tử. 
3.2.1.4 Xác định hoạt tính của enzyme xanthine oxidase sau khi phân lập 
Hoạt tính của enzyme XO được xác định bằng phương pháp quang phổ của 
Bergmeyer (1974). 
 Nguyên tắc: Hoạt tính của enzyme XO phân lập từ sữa bị được xác định 
thơng qua lượng acid uric tạo thành theo phản ứng: 
Xanthine + O2 + H2O Acid uric + H2O2 
Lượng acid uric tạo thành được định lượng bằng phương pháp đo quang 
phổ ở bước sĩng 290 nm. 
Phương pháp: 
Hỗn hợp phản ứng gồm 1,9 mL dung dịch đệm phosphate (pH 7,5), 1 mL 
xanthine nồng độ 0,15 mM và 0,1 mL enzyme XO nồng độ 1 mg/mL. Mẫu trắng 
được thực hiện trong điều kiện khơng cĩ enzyme, dung dịch enzyme được thay 
thế bằng dung dịch đệm với cùng thể tích. Phản ứng được thực hiện trong cuvette 
thạch anh cĩ độ dày 1 cm. Hỗn hợp phản ứng được ủ ở 25°C. Thời gian phản ứng 
(T) được tính từ lúc cho enzyme vào hỗn hợp mẫu thử đến khi giá trị hấp thu tia 
UV bắt đầu khơng tăng thêm nữa. Độ hấp thu tia UV được đo trên máy Jasco V-
730 ở bước sĩng 290 nm. 
XO 
48 
Hoạt tính của enzyme được tính bằng cơng thức: 
Hoạt tính riêng của enzyme được tính theo cơng thức: 
Hoạt tính của enzyme cĩ trong 1 mg enzyme thơ ở thể rắn được tính theo 
cơng thức: 
Trong đĩ: 
A: độ hấp thu quang phổ lớn nhất của mẫu trong thời gian phản ứng. 
12,2: hệ số hấp thụ milimol phân tử của acid uric tại bước sĩng 290 nm (mM-1.cm-1) 
3: thể tích hỗn hợp phản ứng (mL) 
0,1: thể tích enzyme cho vào (mL) 
T: thời gian phản ứng 
C: hoạt tính của enzyme (U/mL enzyme) 
S: hoạt tính riêng của enzyme (U/mg protein) 
P: khối lượng protein cĩ trong 1 mL dung dịch enzyme (mg protein/mL enzyme) 
R: Số đơn vị hoạt tính cĩ trong 1 mg enzyme thơ ở thể rắn (U/mg enzyme thơ) 
D: Khối lượng enzyme thơ ở thể rắn đã hịa tan trong 1 mL dung dịch enzyme (mg 
enzyme thơ/mL enzyme) 
3.2.1.5 Khảo sát ảnh hưởng của pH và nhiệt độ lên enzyme xanthine oxidase 
trích được 
Khảo sát ảnh hưởng của pH và nhiệt độ lên hoạt động của enzyme XO 
được thực hiện tương tự như thí nghiệm xác định hoạt tính enzyme XO theo 
phương pháp của Bergmeyer (1974). Thí nghiệm gồm 2 nhân tố là pH với các 
mức độ pH 6,5; 7; 7,5 và 8,0; và nhiệt độ ở các mức độ 20, 25, 30 và 35°C. 
3.2.1.6 Khảo sát nồng độ xanthine và xanthine oxidase phù hợp cho 
phản ứng 
Thí nghiệm được thực hiện trên đĩa 96 giếng Costar 3635 dựa theo phương 
pháp của Nguyen et al. (2004). Nồng độ xanthine và enzyme XO phù hợp được 
chọn dựa vào hiệu suất phản ứng tạo thành acid uric từ xanthine, với sự xúc tác 
của enzyme XO ở nhiệt độ 25°C và pH 7,5 (xác định từ thí nghiệm trên). Hỗn 
hợp trong mỗi giếng thử bao gồm: 85 µL dung dịch đệm phosphate (0,05 M; pH 
7,5), 60 µL xanthine, 30 µL enzyme XO, sau 30 phút cho thêm 25 µL HCl 1 N. 
Dung dịch xanthine được sử dụng trong thí nghiệm với các nồng độ 0; 0,075; 
0,15; 0,3 và 0,6 mM. Dung dịch enzyme XO được sử dụng với các nồng độ 0; 
 C = 
(Amẫu thử - Amẫu trắng) 3 
12,2 0,1 T 
S = 
C 
P 
R = 
C 
D 
49 
0,005; 0,01; 0,02 và 0,04 U/mL. Song song với mỗi mẫu thử cĩ một mẫu trắng. 
Mẫu trắng là mẫu được thực hiện tương tự như mẫu thử, nhưng HCl được cho 
vào trước enzyme. Độ hấp thu của lượng acid uric mới tạo thành trong phản ứng 
bằng độ hấp thu của mẫu thử trừ đi độ hấp thu của mẫu trắng tương ứng. Từ độ 
hấp thu của lượng acid uric mới tạo thành trong phản ứng, dựa vào đường chuẩn 
acid uric sẽ xác định lượng acid uric tạo thành. Mỗi phản ứng được thực hiện lặp 
lại 3 lần. Các nghiệm thức của thí nghiệm được bố trí theo kiểu thừa số 2 nhân 
tố: nồng độ xanthine và nồng độ enzyme XO. 
Hiệu suất phản ứng tạo thành acid uric từ xanthine dưới sự xúc tác của 
enzyme XO được tính theo cơng thức sau: 
So sánh hiệu suất phản ứng giữa các nghiệm thức để chọn nồng độ xanthine 
và nồng độ enzyme XO phù hợp để thực hiện các thí nghiệm tiếp theo. 
Đường chuẩn acid uric được xác định như sau: acid uric được pha trong 
dung dịch đệm phosphate (0,05 M; pH 7,5) thành các nồng độ 0,025; 0,05, 0,1; 
0,2; 0,4 và 0,6 mM. Thí nghiệm được khảo sát trong đĩa 96 giếng với thể tích 
dung dịch cho vào giếng là 200 µL. Mẫu trắng là mẫu chứa 200 µL dung dịch 
đệm phosphate. Dung dịch acid uric được đo ở bước sĩng 290 nm. Độ hấp thu tia 
UV của acid uric trong hỗn hợp là độ hấp thu tia UV chênh lệch giữa các mẫu so 
với mẫu trắng. Sử dụng độ hấp thu tia UV của acid uric ở các nồng độ khác nhau 
để xây dựng đường chuẩn acid uric. 
3.2.1.7 So sánh hoạt tính của enzyme xanthine oxidase phân lập từ sữa 
bị và enzyme xanthine oxidase thương mại 
Khả năng ức chế enzyme XO (được phân lập từ sữa bị) của AP được thực 
hiện trên đĩa 96 giếng dựa vào lượng acid uric tạo thành (Nguyen et al., 2004; 
Anam et al., 2017). Hỗn hợp trong mỗi giếng thử bao gồm: 50 µL dung dịch AP, 
35 µL dung dịch đệm phosphate, 30 µL dung dịch enzyme XO 0,02 U/mL, ủ ở 
điều kiện 25°C trong 15 phút, tiếp theo cho thêm 60 µL dung dịch xanthine 0,15 
mM ủ ở 25°C trong 30 phút. Sau đĩ, 25 µL HCl 1 N được thêm vào để cố định 
mẫu. Cuối cùng mẫu được đo ở bước sĩng 290 nm để xác định lượng acid uric 
tạo thành. Các giếng thử là các giếng cĩ nồng độ AP với các nồng độ lần lượt là: 
2,5; 5; 7,5; 10; 12,5; 15; 17,5 và 20 µg/mL. Giếng sử dụng AP với nồng độ 0 
µg/mL được xem là giếng đối chứng. Tương ứng với mỗi giếng thử cĩ một giếng 
trắng thử, tương ứng với giếng đối chứng cĩ một giếng trắng đối chứng được 
thực hiện. Giếng trắng là giếng được thực hiện tương tự như giếng thử. Tuy 
Hiệu suất phản ứng (%) = 
Lượng acid uric tạo thành trên lý thuyết (mM) 
Lượng acid uric tạo thành trên thực tế (mM) 
 100% 
50 
nhiên, HCl được cho vào giếng trước khi cho enzyme XO vào. Mỗi giếng được 
thực hiện lặp lại 3 lần. Từ kết quả của thí nghiệm này, đường chuẩn theo phần 
trăm enzyme XO bị ức chế bởi AP được xây dựng. 
Khả năng ức chế enzyme XO thương mại của AP cũng được thực hiện 
tương tự như trên. Dựa trên cơ sở đĩ, hiệu quả ức chế của AP đối với enzyme 
XO được phân lập từ sữa bị và enzyme thương mại được so sánh với nhau. 
Phần trăm ức chế được tính theo cơng thức 
I (%) = [(Ađối chứng - Athử)/ Ađối chứng] 100 
Trong đĩ: 
Ađối chứng : Là độ hấp thu quang phổ của mẫu đối chứng 
Athử: Là độ hấp thu quang phổ của mẫu thử 
Ađối chứng= Ađối chứng – A mẫu trắng của mẫu đối chứng 
Athử= Athử - Amẫu trắng của mẫu thử 
3.2.2 Khảo sát khả năng ức chế enzyme xanthine oxidase của 8 loại 
thảo dược 
3.2.2.1 Phương pháp trích cao bằng dung mơi ethanol 70% 
Tồn thân các thảo dược sau khi thu về được định danh bởi tiến sĩ Đặng 
Minh Quân (Giảng viên trường Đại học Cần Thơ, giảng dạy mơn Phân loại Thực 
vật). Mẫu được loại bỏ các phần bị sâu, bị úng, rửa sạch và để ráo. Lấy mỗi loại 
thảo dược 5 g để xác định độ ẩm. Cân tiếp mỗi loại thảo dược lấy 3 kg, sấy khơ 
bằng tủ sấy ở 60°C trong thời gian 96 giờ, rồi đem xay thành bột. Bột cây được 
cho vào các túi vải và ngâm với ethanol 70% với tỉ lệ 1:10 (w/v) trong thời gian 
72 giờ, dịch chiết được lọc qua giấy lọc với đường kính lỗ 13 µm. Phần bã sau 
chiết được bỏ đi. Phần dịch chiết được cơ quay ở nhiệt độ 50°C, áp suất 100 
mbar để loại bỏ dung mơi. Tiến hành đơng khơ chân khơng để loại bỏ nước. Cân 
khối lượng cao chiết thu được và tính tốn hiệu suất trích cao. Mẫu cao chiết 
được trữ ở 4°C để sử dụng cho các thí nghiệm tiếp theo. 
Hiệu suất trích cao được tính theo cơng thức: 
Độ ẩm nguyên liệu được xác định theo phương pháp của Willits (1951). 
Nguyên tắc của phương pháp là dùng nhiệt độ làm bay hơi hết nước trong mẫu, 
Hiệu suất trích (%) = 
Khối lượng bột cây trước khi ngâm (g) 
Khối lượng cao chiết sau khi cơ quay (g) 
× 100% 
51 
cân khối lượng mẫu trước và sau sấy khơ, từ đĩ tính phần trăm lượng nước cĩ 
trong mẫu. 
Phương pháp tiến hành xác định độ ẩm nguyên liệu: Cốc được sấy ở nhiệt 
độ 105°C, khoảng 4 giờ. Lấy ra cho vào bình hút ẩm, để nguội, cân và ghi nhận 
khối lượng cốc (lặp lại cho đến khi khối lượng cốc khơng đổi). Cân 5 g các 
nguyên liệu thảo dược mẫu cho vào cốc (ghi nhận lại khối lượng mẫu và cốc 
trước khi sấy). Cốc cĩ chứa mẫu được tiếp tục sấy ở 105°C khoảng 4 giờ, sau đĩ 
cho vào bình hút ẩm, để nguội, cân để ghi nhận lại khối lượng mẫu và cốc sau 
khi sấy (lặp lại đến khi khối lượng cốc và mẫu khơng đổi). Mỗi nguyên liệu được 
lặp lại 3 lần. 
Độ ẩm của nguyên liệu là sự chênh lệch giữa khối lượng tươi và khối lượng 
khơ được tính theo cơng thức: 
Chỉ tiêu theo dõi: độ ẩm của nguyên liệu và hiệu suất trích 
3.2.2.2 Khảo sát khả năng ức chế enzyme xanthine oxidase của cao tổng 
ethanol được chiết từ 8 loại thảo dược 
- Nguyên tắc: Enzyme XO xúc tác phản ứng tạo thành acid uric theo phản 
ứng 
Xanthine + O2 + H2O Acid uric + H2O2 
Độ hấp thụ tia UV của hỗn hợp ở bước sĩng 290 nm khi cĩ và khơng cĩ 
mẫu thử được sử dụng để xác định hoạt tính ức chế enzyme XO. Chất cĩ khả 
năng ức chế enzyme XO càng cao sẽ càng hạn chế khả năng hình thành acid uric, 
do đĩ giá trị mật độ quang sẽ càng giảm. 
- Chuẩn bị cao chiết: Cao ethanol 10 mg/mL được pha trong dung mơi 
dimethyl sulfoside 0,1 M. Sau đĩ, cao ethanol của mỗi loại thảo dược được pha 
lỗng thành các nồng độ 0; 6,25; 12,5; 25; 50; 100; 200; 400 và 800 μg/mL. 
Tiến hành thí nghiệm: Thí nghiệm được tiến hành trên đĩa 96 giếng Costar 
3635 theo phương pháp của Nguyen et al. (2004). Hỗn hợp phản ứng 200 µL 
trong mỗi giếng thử bao gồm 50 µL dung dịch cao chiết, 35 µL dung dịch đệm 
phosphate (0,05 M; pH 7,5), 30 µL dung dịch enzyme XO, ủ ở điều kiện 25°C 
trong 15 phút, tiếp theo cho thêm 60 µL dung dịch xanthine ủ ở 25°C trong 30 
phút. Sau đĩ, 5 µL HCl 1 N được thêm vào để ngừng hoạt động của enzyme XO. 
Cuối cùng mẫu được đo ở bước sĩng 290 nm để xác định lượng acid uric tạo 
thành. Cao ethanol của từng thảo dược được sử dụng với các nồng độ 0; 6,25; 
XO 
Độ ẩm (%) = 
Khối lượng tươi (g) 
Khối lượng tươi (g) – Khối lượng khơ (g) 
× 100% 
52 
12,5; 25; 50; 100; 200; 400 và 800 µg/mL. Trong đĩ, nghiệm thức sử dụng nồng 
độ 0 µg/mL là nghiệm thức đối chứng. Mỗi nồng độ được tiến hành lặp lại 3 lần. 
Song song với mỗi mẫu thử cĩ 1 mẫu trắng. Mẫu trắng là mẫu được thực hiện 
tương tự như mẫu thử, nhưng HCl được cho vào hỗn hợp trước khi cho enzyme 
XO vào hỗn hợp nhằm tạo mơi trường để enzyme khơng hoạt động được. Hỗn 
hợp các dung dịch trong từng giếng được bố trí như Bảng 3.2. 
Bảng 3.2: Bố trí hỗn hợp phản ứng trong từng giếng 
 Giếng đối 
chứng (µL) 
Giếng đối chứng 
thuốc (µL) 
Các giếng thử 
(µL) 
Dung dịch cao chiết 0 0 50 
AP 0 50 0 
Đệm phosphate 85 35 35 
Xanthine 60 60 60 
XO 30 30 30 
HCl 25 25 25 
Tổng thể tích 200 200 200 
Phần trăm ức chế được tính theo cơng thức 
% ức chế = [(∆Ađối chứng - ∆Athử)/∆Ađối chứng] ×100 
Trong đĩ: A là độ hấp thu quang phổ của mẫu ở bước sĩng 290 nm 
 ∆Ađối chứng = Ađối chứng - Amẫu trắng của mẫu đối chứng 
 ∆Athử = Athử - Amẫu trắng của mẫu thử 
Hiệu quả ức chế của cao ethanol được xác định dựa vào hiệu suất ức chế 
và giá trị IC50. Giá trị IC50 được tính dựa vào phương trình tuyến tính của từng 
cao chiết. 
- Chỉ tiêu theo dõi: Hiệu suất ức chế hoạt động của enzyme XO và giá trị 
IC50. 
Hiệu suất ức chế hoạt động của enzyme XO được tính theo cơng thức: 
3.2.2.3 IC50 và cách xác định 
Định nghĩa: IC50 là một giá trị dùng để đánh giá khả năng ức chế mạnh hoặc 
yếu của mẫu khảo sát. IC50 được định nghĩa là nồng độ của mẫu mà tại đĩ nĩ cĩ 
thể ức chế 50% enzyme. Mẫu cĩ hoạt tính càng cao thì giá trị IC50 sẽ càng thấp. 
H = 
Độ hấp thu của mẫu đối chứng 
Độ hấp thu của mẫu đối chứng – Độ hấp thu của mẫu thí nghiệm 
× 100% 
53 
Cách xác định IC50: 
Tiến hành khảo sát hoạt tính của mẫu ở nhiều nồng độ 0; 6,25; 12,5; 25; 50; 
100; 200; 400 và 800 µg/mL. Với mỗi loại thảo dược, chọn ít nhất 5 giá trị cĩ 
hoạt tính biến thiên tuyến tính với nồng độ, một đường thẳng y=ax+b qua tất cả 
các điểm được vẽ với y là % ức chế và x là nồng độ. Thay y=50% vào phương 
trình sẽ thu được giá trị x. Đĩ chính là nồng độ ức chế được 50% enzyme (IC50). 
 Cao chiết cĩ khả năng ức chế enzyme XO mạnh nhất được sử dụng cho các 
nghiên cứu tiếp theo. 
3.2.3 Phân lập hợp chất cĩ hoạt tính ức chế enzyme xanthine oxidase 
3.2.3.1 Thí nghiệm 1: Khảo sát khả năng ức chế enzyme xanthine 
oxidase của các cao phân đoạn được chiết từ thảo dược tiềm năng 
a. Điều chế các cao phân đoạn 
Nguyên tắc: Dung mơi khơng phân cực sẽ hịa tan tốt các hợp chất cĩ tính 
khơng phân cực, dung mơi phân cực trung bình hịa tan tốt các hợp chất cĩ tính 
phân cực trung bình và dung mơi phân cực mạnh hịa tan tốt các hợp chất cĩ tính 
phân cực mạnh. 
Tiến hành: Cao tổng của cây cỏ xước được hịa tan trở lại với nước (100 g 
cao trong 200 mL nước) trong bình chiết. Tiến hành chiết lỏng-lỏng với các dung 
mơi cĩ độ phân cực tăng dần là n-hexane, ethyl acetate và n-butanol (Hình 3.5), 
phần dịch cịn lại sau khi chiết với các dung mơi gọi là phân đoạn nước. Phần 
dịch chiết của từng phân đoạn được cơ cạn bằng máy cơ quay chân khơng cho ra 
các cao tương ứng, với phân đoạn nước được tiến hành đơng khơ chân khơng để 
thu được cao nước. Các cao phân đoạn này được trữ ở 4°C để tiến hành thí 
nghiệm tiếp theo. Tồn bộ quá trình chiết xuất được mơ tả ở Hình 3.6. 
Hình 3.6: Quá trình chiết lỏng-lỏng các cao phân đoạn 
54 
Hình 3.7: Sơ đồ tĩm tắt quá trình điều chế cao các phân đoạn cây cỏ xước. 
b. Khảo sát khả năng ức chế enzyme XO của các cao phân đoạn: được 
thực hiện tương tự cao tổng (đã trình bày ở mục 3.2.2.2). 
Chỉ tiêu theo dõi: hiệu suất ức chế enzyme XO của từng phân đoạn và chỉ 
số IC50 của từng phân đoạn (cách tính đã trình bày ở mục 3.2.2.2). 
Phân đoạn ethyl acetate cĩ khả năng ức chế enzyme XO mạnh nhất và được 
sử dụng cho nghiên cứu tiếp theo. 
3.2.3.2 Thí nghiệm 2: Phân lập các chất từ cao phân đoạn ethyl acetate 
Sau khi khảo sát khả năng ức chế enzyme XO của các cao phân đoạn được 
chiết từ cỏ xước, phân đoạn ethyl acetate cĩ hoạt tính ức chế enzyme XO mạnh 
nhất được chọn để phân lập chất tinh khiết bằng phương pháp sắc ký cột (silica 
gel) (Hình 3.7). Các phân đoạn nhỏ hơn thu được trong quá trình sắc ký cũng 
được khảo sát khả năng ức chế enzyme XO để tìm phân đoạn cĩ khả năng ức chế 
enzyme XO mạnh và tiếp tục tinh sạch chất. Sắc ký lớp mỏng và hiện vết bằng 
dung dịch vanillin/H2SO4 20% và dung dịch Fe3+ được sử dụng hỗ trợ trong quá 
trình phân lập chất. 
55 
Hình 3.8: Sắc ký cột phân đoạn ethyl acetate 
Các hợp chất tinh khiết sau khi được phân lập sẽ được khảo sát khả năng ức 
chế enzyme XO. Cách làm tương tự như khảo sát khả năng ức chế enzyme XO 
của cao tổng ethanol (đã trình bày ở mục 3.2.2.2). Tính được IC50 của mỗi chất. 
Chất cĩ hoạt tính ức chế mạnh enzyme XO được tiếp tục xác định kiểu ức chế. 
Chất tinh khiết đã phân lập được tiến hành xác định cấu trúc phân tử của 
hợp chất. Cấu trúc phân tử hợp chất được xác định bằng các phương pháp phổ 
nghiệm như: HMBC, DEPT, 1D- và 2D-NMR kết hợp với các tài liệu tham khảo 
đã cơng bố. 
Các thơng số kỹ thuật khi thực hiện kỹ thuật phân tích phổ NMR: 
- Tên máy: Bruker avance III 500 Mhz 
- Tần số máy ghi phổ 1H-NMR: 500 MHz. 
- Tần số máy ghi phổ 13C-NMR: 125 MHz. 
- Số lần quét (Number scan – NS): dao động từ 16 – 128 lần. 
Phương pháp phân tích phổ NMR bao gồm các bước như sau: 
- Bước 1: Xác định cơng thức phân tử của chất cần nghiên cứu dựa trên dữ 
liệu phổ khối. 
- Bước 2: Xác định số nối đơi của chất cần nghiên cứu dựa trên cơng thức 
phân tử. 
- Bước 3: Nhận biết một số nhĩm chức dựa trên dữ liệu FT-IR (Fourier 
Transform - infrared). 
- Bước 4: Gán các tín hiệu NMR trên phổ cho các nguyên tử hay nhĩm 
chức dựa trên các đặc trưng phổ. 
- Bước 5: Sàng lọc, sắp xếp các nguyên tử, các nhĩm chức một cách hợp lý 
thành cấu trúc khơng gian của phân tử. 
- Bước 6: Kiểm tra lại cơng thức cấu trúc. 
56 
3.2.3.3 Cách xác định kiểu ức chế 
Kiểu ức chế của hợp chất được xác định dựa theo phương pháp của 
Nguyen et al. (2006). Khoảng nồng độ xanthine thích hợp mà tại đĩ độ hấp thu 
tia UV (bước sĩng 290 nm) tăng dần được xác định trước khi xác định kiểu ức 
chế. Thí nghiệm xác định khoảng nồng độ xanthine thích hợp được thực hiện 
trên đĩa 96 giếng. Giếng thử ban đầu được cho vào 85 µL dung dịch đệm 
phosphate (0,05 M, pH 7,5) và 30 µL enzyme XO 0,02 U/mL. Sau khi ủ ở 25°C 
trong thời gian 15 phút, 60 µL xanthine (với các nồng độ 25, 50, 75, 100, 125, 
150, 175 và 200 µM) được cho vào giếng. Hỗn hợp tiếp tục được ủ ở 25°C 
trong 2 phút và sau đĩ dừng phản ứng bằng cách cho vào hỗn hợp 25 µL HCl 1 
N. Cuối cùng, hỗn hợp được đo ở bước sĩng 290 nm. Giếng trắng là giếng cĩ 
chứa 115 µL dung dịch đệm phosphate. Mỗi giếng thử được lặp lại 3 lần. 
Độ hấp thu tia UV (bước sĩng 290 nm) của lượng acid uric tạo thành trong 
mỗi nghiệm thức được xác định là ∆A=Agiếng thử-Agiếng trắng. So sánh ∆A của các 
nồng độ xant