Luận án Tạo dòng bông (Gossypium hirsutum L.) chống chịu thuốc trừ cỏ Glufosinate và Glyphosate bằng kỹ thuật chuyển gen qua trung gian Agrobacterium tumefaciens

 xuất hiện băng lai: dòng không có gen 
gắn kết với genome. 
Xác định hoạt động phiên mã của gen chuyển trong cây bông chuyển gen bằng 
kỹ thuật Northern blot 
- RNA tổng số của cây chuyển gen tách chiết từ lá non theo quy trình trong phụ 
lục 10, sử dụng Trizol regent (catologue số 10296010) của Hãng Invitrogen. Mẫu lá 
non (100 mg) được nghiền nhanh trong nitơ lỏng, bổ sung ngay 750 µl trizol, sau đó 
li tâm 13.000 vòng/phút để thu dịch nổi, bổ sung 500 µl chloroform vào dung dịch. 
Hỗn hợp sau được ly tâm tốc độ 13.000 vòng/phút. Thu dịch nổi và tủa với 
 56 
isopropanol và ly tâm để thu RNA tổng số. Kiểm tra chất lượng RNA tổng số trên gel 
agarose 1% biến tính bằng formaldehyde và xác định nồng độ trên máy quang phổ. 
- 10 μg RNA được phân tách trên gel agarose 1.2% bổ sung formaldehyde 37% 
để phân tách thành các băng rRNA. Thấm truyền RNA đã biến tính lên màng nylon 
theo quy trình (phụ lục 10). Sau đó, màng nilon được bảo quản và thực hiện phép lai. 
- Tạo mẫu dò để lai DNA/RNA theo kít “DIG Northern starter” (catologue 12 
039 672 910) của hãng Roche (phụ lục 10). Sản phẩm PCR nhân gen EPSPS (1.400 
bp) và bar (440 bp) được đánh dấu làm probe xác định sự biểu hiện của gen chuyển. 
- Tiến hành phép lai với mẫu dò đã được đánh dấu để xác định hoạt động phiên 
mã ban đầu của gen chuyển trong genome cây bông (các bước thực hiện trong phụ 
lục 10). Kết quả xác định trên film X-Ray có xuất hiện băng lai: kết luận dòng có gen 
hoạt động phiên mã; không xuất hiện băng lai: kết luận dòng không có gen hoạt động 
phiên mã. 
 Đánh giá tính chống chịu thuốc trừ cỏ của cây bông chuyển gen 
Các dòng bông chuyển gen được gieo trồng trong nhà lưới, không sử dụng các 
biện pháp phòng trừ cỏ khác. 
Đánh giá tính chống chịu thuốc gốc Glufosinate: giai đoạn cây 3-4 lá hoặc 10-
12 lá (20-30 ngày sau gieo, khi cỏ mọc rất tốt), tiến hành phun thuốc trừ cỏ 
Glufosinate ở nồng độ 0,6 kg ai./ha, (4 lít Basta/ha, pha 10 ml/lít nước, phun 4 lít 
dung dịch đã pha cho 100 m2). Sau 4- 5 ngày theo dõi khả năng chống chịu thuốc 
của cây. 
Đánh giá tính chống chịu thuốc gốc Glyphosate: giai đoạn cây 3-4 lá hoặc 10-
12 lá (20-30 ngày sau gieo, khi cỏ mọc rất tốt), tiến hành phun thuốc trừ cỏ Glyphosate 
ở nồng độ 2,88 kg ai./ha, (4 lít/ha, pha 15 ml/lít nước, phun 4 lít dịch đã pha cho 100 
m2). Sau 7 - 10 ngày theo dõi khả năng chống chịu thuốc của cây. 
Đánh giá mức độ tổn thương của cây bông chuyển gen và cây không chuyển 
gen ở giai đoạn 7 ngày sau phun, điểm đánh giá 0 - 100, trong đó 0 (không tổn thương) 
 57 
và 100 (tổn thương hoàn toàn) (Frans và ctv, 1986). Tổn thương nhìn mắt thường 
được tính toán dựa trên quan sát triệu chứng ố vàng và hoại tử của cây bông bị xử lý 
thuốc với quy ước dưới đây. 
Chỉ tiêu theo dõi 
- Tỷ lệ cây chống chịu thuốc (%) = số cây sống/tổng số cây 
- Mức độ chống chịu: 
+++++: < 1% diện tích lá bị hoại tử/cong mép hoặc úa vàng (chống chịu rất cao). 
++++: 1 đến 5% diện tích lá bị hoại tử/cong mép hoặc úa vàng (chống chịu cao). 
+++: > 5 đến 25% diện tích lá bị hoại tử/cong mép hoặc úa vàng (chống chịu trung 
bình). 
++: > 25 đến 50% diện tích lá bị hoại tử/cong mép hoặc úa vàng (chống chịu kém). 
+: > 50% diện tích lá bị hoại tử/cong mép hoặc úa vàng (chống chịu rất kém). 
2.2.3 Phân tích di truyền tính chống chịu thuốc trừ cỏ Basta, đặc điểm thực 
vật học và khả năng mẫm cảm với một số bệnh hại chính của cây bông chuyển 
gen thế hệ T2 
Quy luật di truyền gen chuyển 
Dòng bông chuyển gen bar B9 và BF17 được lai tạo F1, F2 và BC1F1 qua 2 
bước: Bước 1, hai dòng được lai với MCU9 (giống thuần thường dùng làm mẹ cho 
các giống lai đang thương mại) để tạo F1, sau đó tự thụ để tạo F2 và lai trở lại với 
MCU9 để tạo BC1F1. Bước 2, B9 và BF17 được lai với giống nền không chuyển gen 
Coker310, sau đó tự thụ tạo F1, F2 và lai tạo BC1 được tạo tương tự như trên. 
Phun hoạt chất Glufosinate (0,6kg ai./ha) lên cây con ở giai đoạn 7 - 8 lá. Theo 
dõi cây con sống/chết ở giai đoạn 7 ngày sau phun, tỷ lệ sống sót được dùng để phân 
tích sự phân ly của gen chuyển. 
Đặc điểm nông sinh học và hình thái 
Các chỉ tiêu về hình thái thu thập theo phương pháp IPGRI và quy phạm khảo 
nghiệm DUS của ngành bông, so sánh với đặc điểm giống gốc (phụ lục 1). 
 58 
Chọn điểm theo dõi: cố định 20 cây liên tục để theo dõi hoặc toàn bộ số cây (số 
lượng cây ít hơn 20 ở các dòng). Chỉ tiêu thời gian phát dục qua các giai đoạn được 
theo dõi trên cả 20 cây. Các chỉ tiêu còn lại gồm chiều cao cây, số cành quả, số cành 
đực, tổng số quả/ cây, khối lượng quả được theo dõi trên 10 cây trong số 20 cây trên 
(đo, đếm cách cây, trừ cây đầu hàng và cây bị mất ngọn). Tỷ lệ mọc mầm, sức nảy 
mầm, các đặc điểm hình thái được theo dõi trên cả hàng. Phương pháp theo dõi cho 
từng chỉ tiêu: 
- Tỷ lệ nảy mầm (%): đếm số hạt trước khi gieo, sau tưới nước lần 1 tiến hành 
đếm số cây mọc (thời điểm 2 lá sò xòe hoàn toàn) vào buổi sáng: 
 Tỷ lệ nảy mầm = số cây mọc/số hạt gieo x 100% 
 Sức nảy mầm = % hạt mọc sau 6 ngày 
- Thời gian sinh trưởng từ gieo đến nở hoa (ngày): tính từ ngày gieo đến ngày 
50% số cây cố định có hoa đầu tiên nở. 
- Thời gian sinh trưởng từ gieo đến nở quả (ngày): tính từ ngày gieo đến ngày 
50% số cây cố định có quả đầu tiên nở. 
- Đặc điểm hình thái theo dõi vào giai đoạn nở hoa. 
- Số cành đực/cây, cành quả vị trí 1, số cành quả/cây, chiều cao cây (theo dõi 
tại giai đoạn nở quả). 
- Số quả/cây theo dõi ở giai đoạn trước khi thu hoạch. 
Đánh giá sự mẫn cảm với một số bệnh hại chính trên cây bông 
- Bệnh lở cổ rễ: điều tra vào thời điểm 21 ngày sau gieo, theo dõi cả hàng. 
- Bệnh đốm cháy lá: điều tra vào thời điểm 95 ngày sau gieo, theo dõi 5 
cây/hàng. 
- Bệnh mốc trắng: điều tra vào thời điểm 95 ngày sau gieo, theo dõi 5 cây/hàng. 
Chỉ tiêu theo dõi 
 59 
Tỷ lệ bệnh/tỷ lệ hại (%) = 
Tổng số cây hoặc bộ phận của cây (lá) 
bị bệnh 
x 100 
Tổng số cây hoặc bộ phận của cây (lá) 
điều tra 
Chỉ số bệnh/chỉ số hại (%) = 
x 100 
 Trong đó:N1 – N5: Số cây bị bệnh ở cấp tương ứng 
 Nxn: Tổng số cây điều tra 
Gieo trồng và chăm sóc cây bông 
- Gieo trồng cây bông chuyển gen ở trong nhà lưới. 
- Lượng phân bón: 120 kg N + 60 kg P2O5 + 60 kg K2O/ha. 
- Các biện pháp kỹ thuật canh tác khác được thực hiện theo tiêu chuẩn ngành 
10TCN 910:2006 và 10TCN 911: 2006 của bộ Nông nghiệp và Phát triển nông thôn 
áp dụng cho vùng. 
- Thu thập mẫu và đánh giá theo Quy chuẩn kỹ thuật quốc gia về phương pháp 
điều tra phát hiện dịch hại cây trồng. QCVN-01-38:2010/BNNPTNT. 
2.3 Hoá chất 
Trong nghiên cứu chuyển gen vào cây bông qua trung gian A. tumefaciens, hóa 
chất dùng để pha chế môi trường MS, đường glucose và sucrose có xuất xứ từ Trung 
Quốc; các vitamin, chất điều hòa sinh trưởng, kháng sinh chọn lọc và một số hóa chất 
khác có xuất xứ từ các Hãng Merck (Đức), Kanto (Nhật Bản) và Unitex Tenamyd 
(Canada). Hóa chất chính sử dụng trong sàng lọc, đánh giá cây bông chuyển gen có 
xuất xứ từ Mỹ, Đức và Ấn Độ. Trong đó, hầu hết của Hãng Merck (Đức); một số của 
Hãng Invitrogen, Promega, Sigma, Bio-Rad (Mỹ); Roche (Đức); và Delhi Pharm (Ấn 
Độ). Chi tiết tên, hãng, nước sản xuất của hóa chất chính sử dụng trong đề tài liệt kê 
ở phụ lục 2. 
 60 
2.4 Máy móc và thiết bị 
Máy móc, thiết bị chính sử dụng trong đề tài có xuất xứ từ các hãng (Astec, 
Barnstead, Bibby, Bio-Rad, Cole Parmer, Gali, Gilson, Hettich, Hirayama, Jenway, 
Labconco, Luzzara-RE, Memmert, Mettler Toledo, National, Olympus, Revco, 
Sanyo, Satorius, SG Water, Sturart, Thermolyne, Thermosavant và UVP) của Mỹ, 
Anh, Đức, Pháp, Nhật Bản, Ý và Thụy Sỹ. Chi tiết tên, chủng loại, hãng, nước sản 
xuất của máy móc, thiết bị chính sử dụng trong đề tài liệt kê ở phụ lục 3. 
2.5 Phương pháp xử lý số liệu 
Kết quả các nội dung nghiên cứu chọn lọc dòng bông có khả năng tái sinh cao, 
xác định các thông số trong quy trình chuyển gen, phân tích đánh giá và thử tính 
chống chịu thuốc trừ cỏ của cây chuyển gen được tổng hợp số liệu bằng chương trình 
Excel 2010. Phân tích anova và trắc nghiệm phân hạng chương trình MSTATC để 
xác định độ sai khác ở mức xác suất 5%. Các kết quả biểu thị bằng giá trị trung bình 
và đươc phân hạng bằng giá trị sai khác nhỏ nhất (Least Significant Difference-Lsd). 
Phân tích Chi bình phương được áp dụng dữ liệu chống chịu thuốc trừ cỏ quần thể 
T1, T2, F2 và BC1F1 tạo ra từ quá trình lai các dòng B9 và BF17 với bố mẹ chúng 
Coker310 và MCU9. 
 61 
Chương 3 
KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 
3.1 Chuyển gen bar và EPSPS vào cây bông 
3.1.1 Chọn lọc dòng Coker310FR có khả năng tái sinh cao 
Phương pháp chuyển gen dựa trên nuôi cấy mô thực vật có nhiều hạn chế, trong 
đó phát sinh đột biến soma, tính đặc hiệu của kiểu gen và thất bại trong quá trình 
thuần hóa của cây chuyển gen (Mayavan và ctv, 2013) ảnh hưởng đến hiệu quả 
chuyển gen. Các nhà nghiên cứu khác nhau có điều kiện nghiên cứu và có thể sử dụng 
giống cây khác nhau, do đó xác định giống và phát triển quy trình tái sinh in vitro hiệu 
quả là cần thiết (Niapour và ctv, 2013). Có nhiều bước trong quá trình tái sinh cây 
bông, mỗi bước đều có những ảnh hưởng nhất định đến hiệu quả tái sinh. Trong đó, 
giai đoạn cảm ứng mô sẹo-phát sinh phôi và giai đoạn tạo cây hoàn chỉnh có tính chất 
quyết định đến tỷ lệ cây tái sinh hoàn chỉnh. 
Năm thứ nhất (R0), tỷ lệ mô sẹo phát sinh phôi đạt 72% trên môi trường CI4, các 
môi trường có nồng độ 2,4-D cao hơn (0,3mg/L: CI7-CI9) và môi trường có hàm lượng 
kinetin cao (CI5 và CI6) đều cho tỷ lệ phát sinh phôi mức thấp hơn (bảng 3.1). Sử dụng 
cây tái sinh thế hệ trước làm vật liệu tái sinh (R1-R3) đều làm tăng tỷ lệ mô sẹo phát 
sinh phôi soma, đặc biệt là R3 có 95,6% các mẫu phát sinh phôi soma (bảng 3.1). 
Cảm ứng mô sẹo chất lượng tốt là bước đầu tiên ảnh hưởng và mang tính quyết 
định đến việc phát sinh phôi soma cũng như tái sinh cây. Hai chất điều hòa sinh 
trưởng 2,4-D và kinetin được sử dụng đã phổ biến trong các nghiên cứu nuôi cấy tế 
bào ở cây bông (Chaudhary và ctv, 2003; Nguyễn Thị Nhã và ctv, 2014; Trịnh Minh 
Hợp và ctv, 2006; Trolinder và Goodin, 1988). Ngoài ra, nhiều nghiên cứu khác có 
sử dụng IAA và BA cho tái sinh cây bông từ mô sẹo (Wu và ctv, 2004; Zhang và ctv, 
2001), tuy nhiên, IAA được cho là ức chế cảm ứng gen vir (Tizaoui và Kchouk, 2012). 
 62 
Vì vậy, tổ hợp 2,4-D và kinetin được sử dụng trong nghiên cứu này để cảm ứng mô 
sẹo và phát sinh phôi cho các thế hệ cây tái sinh. Kết quả đạt được tương tự với các 
nghiên cứu trên là môi trường có tỷ lệ mô sẹo phát sinh phôi tốt nhất là CI4 (bổ sung 
0,1 mg/L 2,4D và 0,1 mg/L kinetin). 
Bảng 3.1 Ảnh hưởng của môi trường cảm ứng mô sẹo đến tỷ lệ mẫu phát sinh phôi 
của giống Coker310 qua các thế hệ tái sinh 
Nghiệm 
thức 
Chất điều hòa sinh trưởng (mg/L) Tỷ lệ (%) mô sẹo phát sinh phôi 
2,4-D kinetin R0 R1 R2 R3 
CI1 0,05 0,1 0c - - 
CI2 0,05 0,3 0c - - 
CI3 0,05 0,5 0c - - 
CI4 0,10 0,1 72,2a 86,7a 93,3a 95,6 
CI5 0,10 0,3 56,7ab 73,3b 75,6b 
CI6 0,10 0,5 62,2ab 73,3b 71,1bc 
CI7 0,30 0,1 54,4b 62,2bc 64,4c 
CI8 0,30 0,3 55,6ab 66,7bc 68,9bc 
CI9 0,30 0,5 44,4b 53,3c 57,8c 
CV% 14,1 17,3 11,0 
Lsd0,05 10,8 15,5 9,1 
Ghi chú: Trong cùng một cột, những số có chữ theo sau giống nhau khác biệt không có ý nghĩa thống kê 
Trong số các môi trường nảy mầm phôi (bảng 3.2), môi trường GR5 tốt hơn so 
với các môi trường khác, các chỉ tiêu về tỷ lệ cây tái sinh hoàn chỉnh (R0: 36,7%; R1: 
36,7% R2: 46,7% và R3: 46,7%) đạt cao nhất. Kết quả thu được cũng cho thấy, ngoài 
việc nâng cao tỷ lệ mô sẹo phát sinh phôi soma (bảng 3.1) thì tỷ lệ cây tái sinh hoàn 
chỉnh cũng có chiều hướng tăng dần (bảng 3.2). Mặc dù nghiệm thức GR2 cũng cho tỷ 
lệ cây tái sinh ở thế hệ R0 và R1 tương đương tỷ lệ này ở nghiệm thức GR5, tuy nhiên, 
hai thế hệ tiếp theo R2 và R3 thì tỷ lệ này không cải thiện so với R0, R1. Vật liệu thu 
 63 
được sau 3 thế hệ (R3) của nghiệm thức GR5 được đặt tên Coker310FR và dùng cho 
các thí nghiệm chuyển gen vào giống bông Coker310. 
Bảng 3.2 Ảnh hưởng của môi trường đến tỷ lệ cây tái sinh hoàn chỉnh của giống 
Coker310 qua các thế hệ 
Nghiệm 
thức 
Thành phần Tỷ lệ (%) cây tái sinh hoàn chỉnh 
Môi 
trường 
Gelrite 
(g/L) 
Glucose 
(g/L) 
R0 R1 R2 R3 
GR1 MSB5 2,5 30 13,3bc - - - 
GR2 MSB5 2,5 20 33,3a 33,3ab 30,0 33,3 
GR3 MSB5 2,5 10 23,3ab 30,0abc 30,0 33,3 
GR4 MSB5 3 30 23,3ab 26,7bc - - 
GR5 MSB5 3 20 36,7a 36,7a 46,7 46,7 
GR6 MSB5 3 10 26,7ab 33,0ab 36,7 36,7 
GR7 ½ MSB5 2,5 30 23,3ab - - - 
GR8 ½ MSB5 2,5 20 26,7ab 26,7bc - - 
GR9 ½ MSB5 2,5 10 26,7ab 16,7c - - 
GR10 ½ MSB5 3 30 10,0c - - - 
GR11 ½ MSB5 3 20 30,0ab 26,7bc - - 
GR12 ½ MSB5 3 10 13,3bc - - - 
CV% 25,7 16,8 - - 
Lsd0,05 15,6 11,6 - - 
Ghi chú: Trong cùng một cột, những số có chữ theo sau giống nhau khác biệt không có ý nghĩa thống kê 
Cải tiến quy trình tái sinh cây bông thông qua phôi soma để giảm thời gian tái 
sinh và hiệu quả hơn cho quá trình chuyển gen. Những khó khăn vẫn tồn tại như biến 
dị soma, khó tái sinh cây và hiện tượng cây tái sinh bất dục gây ra bởi thời gian nuôi 
cấy kéo dài. Đã có báo cáo cho thấy thành phần môi trường nảy mầm phôi ảnh hưởng 
đến tỷ lệ tái sinh cây không bị dị dạng (Wu và ctv, 2004). Trong đó, gây stress thẩm 
thấu là một trong các phương pháp để giảm tỷ lệ cây dị dạng. Thay đổi hàm lượng 
khoáng MS, đường và gelrite là cách tạo stress thẩm thấu được sử dụng cho nảy mầm 
 64 
phôi để giảm tỷ lệ cây tái sinh dị dạng. Kết quả đạt được ở nghiên cứu này cho thấy 
môi trường GR5 có đầy đủ thành phần khoáng MS, lượng đường vừa phải 20 g/L và 
lượng gelrite cao 3 g/L cho tỷ lệ cây dị dạng thấp nhất và cây hoàn chỉnh cao (46,7%). 
3.1.2 Tái cấu trúc vector chuyển gen mang gen chống chịu thuốc trừ cỏ gốc 
Glyphosate và Glufosinate, tạo chủng A. tumefaciens chứa plasmid tái tổ hợp 
Vector pCB301 (hình 2.3) là vector nhị phân có kích thước nhỏ nhất (5,5 kb) 
trong các loại đã công bố và sẵn sàng cho việc chèn các cấu trúc để chuyển vào 
genome thực vật. Vùng biên lặp của T-DNA trên vector pCB301 gần với vùng đa 
điểm cắt (MCS). Nhiều vị trí cắt giới hạn duy nhất trong vùng MCS là BamHI, SmaI, 
PstI, EcoRI, HindIII, rất thuận lợi cho việc chèn cấu trúc gen mục tiêu. Plasmid 
pCB301 được chuyển trực tiếp và dễ dàng sang Agrobacterium bằng kỹ thuật xung 
điện (Cangelosi và ctv, 1991). 
Vector pCAMBIA1300 (Hình 2.4) đã được sử dụng rộng rãi trong chuyển gen 
trên lúa (Komori và ctv, 2007) và nhiều cây trồng khác trong suốt 30 năm qua. Gen 
chọn lọc thực vật của pCAMBIA là phiên bản tăng cường biểu hiện gấp đôi với 
promoter CaMV35S và tín hiệu kết thúc CaMV35S polyA. Vector này chứa vùng 
trình tự cho phép chèn nguyên vẹn cấu trúc biểu hiện gen trong thực vật, bao gồm 
promoter và terminator (www.cambia.org). Promoter CaMV35S đã được sử dụng 
phổ biến, là công cụ hiệu quả trong biểu hiện protein tái tổ hợp, đặc biệt là ở các loại 
cây trồng khó chuyển gen (Palmer và Gleba, 2014). 
Đề tài sử dụng 2 vector này cho nội dung tạo vector mang gen mục tiêu EPSPS 
và bar để chuyển vào cây bông. Plasmid được hoàn thành ở E. coli rồi chuyển sang 
A. tumefaciens. 
 Tái cấu trúc vector chuyển gen mang gen bar chống chịu thuốc trừ cỏ gốc 
Glufosinate 
Tái cấu trúc vector chuyển gen bar, có gen chọn lọc nptII kháng kanamycin 
* Thu nhận gen bar từ vector pPTN289 và gắn gen bar vào vector pCB301 
Cấu trúc PNOS-bar-TNOS trong vector pPTN289 có vị trí nhận biết của PstI 
và HindIII ở đầu 5’ và EcoRI ở đầu 3’, tuy nhiên, vùng đa điểm cắt của vector 
 65 
pCB301_Kan lại chứa tới 2 vị trí cắt của PstI, 2 vị trí cắt của HindIII và 1 vị trí cắt 
của EcoRI nằm chính giữa. Do đó, trong trường hợp này quá trình cấu trúc lại vector 
chuyển gen tái tổ hợp chỉ có thể sử dụng EcoRI để cắt nối tại đầu 3’, còn tại đầu 5’ 
phải xử lý tạo các đầu bằng cho quá trình nối ghép các cấu trúc. Cụ thể, vector 
pPTN289 được cắt lần đầu bằng HindIII tạo đầu dính 5’, sau đó xử lý thành đầu bằng 
nhờ hoạt tính 3’-5’ exonuclease của Klenow Fragment và cuối cùng cấu trúc PNOS-
bar-TNOS được cắt rời khỏi vector pPTN289 bằng EcoRI tạo đầu dính ở đầu 3’, đoạn 
cấu trúc PNOS-bar-TNOS thu được có kích thước dự kiến 1,3 kb. 
Hình 3.1 Sản phẩm tinh sạch đoạn gen 
PNOS-bar-TNOS và vector pCB301 
sau xử lý với enzyme giới hạn 
Giếng 1: pCB301/SmaI+EcoRI; 
Giếng 2: PNOS-bar-TNOS 
/HindIII+Klenow fragment+EcoRI; 
M:Thang DNA chuẩn 
Vector pCB301_Kan được cắt mở vòng (giếng 1, hình 3.1), sau đó, đoạn cấu 
trúc PNOS-bar-TNOS sẽ được chèn vào vector pCB301 bằng enzyme T4 ligase 
* Kiểm tra plasmid tái tổ hợp bằng phản ứng colony-PCR và phản ứng cắt 
Kết quả PCR ở hình 3.2 cho thấy, các giếng 1, 2, 5 và 6 xuất hiện 1 băng duy 
nhất có kích thước gần 500 bp phù hợp với kích thước của gen bar (440 bp). Plasmid 
có kết quả dương tính trong phản ứng PCR được kiểm tra bằng xử lý với cặp enzyme 
giới hạn PstI và EcoRI (hình 3.3). Cả ba giếng 1, 2 và 3 đều xuất hiện 1 băng có kích 
thước gần 6.000 bp (tương đương với kích thước 5.500 bp của vector pCB301), đồng 
thời xuất hiện thêm băng có kích thước thấp hơn 1.500 bp phù hợp với kích thước 
của cấu trúc PNOS-bar-TNOS (1.300 bp). Như vậy, plasmid đã tinh sạch là plasmid 
tái tổ hợp có chứa đoạn gen bar. 
 66 
Hình 3.2 Sản phẩm PCR gen bar từ 
plasmid tái tổ hợp pCB301:bar 
M: Thang DNA chuẩn; 
Giếng 1 đến 7: plasmid pCB301:bar 
Hình 3.3 Sản phẩm cắt kiểm tra 
plasmid tái tổ hợp pCB30:bar 
M: thang DNA chuẩn; 
Giếng 1,2 và 3: pCB301:bar/EcoRI+PstI 
Tái cấu trúc vector chuyển gen mang gen bar, có gen chỉ thị chọn lọc hpt kháng 
hygromycin 
* Thu nhận gen bar từ vector pPTN289 và gắn vào vector pCAMBIA1300 
Cấu trúc PNOS-bar-TNOS trong vector pPTN289 có vị trí nhận biết của PstI ở 
đầu 5’ và EcoRI ở đầu 3’. Như vậy, vector pPTN289 trước tiên được xử lý bằng PstI 
tạo đầu dính 5’, sau đó cấu trúc PNOS-bar-TNOS được cắt rời khỏi vector pPTN289 
bằng EcoRI tạo đầu dính 3’, vùng cấu trúc PNOS-bar-TNOS thu được có kích thước 
gần 1,3 kb (hình 3.4, giếng 1). 
Song song với quá trình trên, vector pCAMBIA1300 được tiến hành xử lý 
enzyme tại vị trí đa điểm cắt bằng PstI và EcoRI (kích thước gần 9 kb - hình 3.4, giếng 
2) để tạo đầu dính thích hợp khi tiến hành ghép nối vector pCAMBIA1300 với PNOS-
bar-TNOS được tách ra từ vector pPTN289. 
 67 
Hình 3.4 Sản phẩm tinh sạch cassette 
PNOS-bar-TNOS và vector 
pCAMBIA1300 sau xử lý với enzyme 
giới hạn 
M: thang DNA chuẩn; 
Giếng 1: PNOS-bar-TNOS /PstI+EcoRI; 
Giếng 2: pCAMBIA1300/PstI+EcoRI 
Trên hình 3.4, giếng số 1 là sản phẩm cắt tinh sạch của cấu trúc PNOS-bar-
TNOS có kích thước khoảng 1.300 bp; giếng số 2 là vector pCAMBIA1300 mở vòng, 
kích thước khoảng gần 9.000 bp. Như vậy, kết quả này cho thấy, sản phẩm xử lý bằng 
enzyme cắt giới hạn phù hợp với dự tính. Cấu trúc PNOS-bar-TNOS được ghép nối 
với pCAMBIA1300 mở vòng bằng T4 ligase, sau đó biến nạp vào tế bào khả biến E. 
coli chủng DH5α theo phương pháp sốc nhiệt và cấy trải trên môi trường chọn lọc 
LB có bổ sung 50 mg/ml kanamycin, nuôi qua đêm ở 37 oC thu khuẩn lạc. 
* Kiểm tra plasmid tái tổ hợp bằng phản ứng colony-PCR và phản ứng cắt giới hạn 
Hình 3.5 Sản phẩm PCR gen bar từ 
plasmid tái tổ hợp pCAMBIA:bar 
Giếng 1, 2, 3, 4 và 5: plasmid 
pCAMBIA:bar 
M: thang DNA chuẩn 
Hình 3.6 Sản phẩm cắt kiểm tra 
plasmid tái tổ hợp pCAMBIA:bar 
pCAMBIA:bar/EcoRI+PstI 
M: thang chuẩn; 
Giếng 1 và 2: pCAMBIA:bar/EcoRI+PstI 
 68 
Để xác định chắc chắn dòng tế bào mang plasmid tái tổ hợp mong muốn, tiến 
hành PCR các plasmid tách từ các khuẩn lạc trên sử dụng cặp primer đặc hiệu Bar_F/ 
bar_R đối với pCAMBIA-bar (hình 3.5). Các plasmid đều xuất hiện một băng vạch 
duy nhất có kích thước phù hợp với gen bar (440 bp), cho thấy đã tái tổ hợp thành 
công vector pCAMBIA1300:bar 
Plasmid có kết quả dương tính trong phản ứng PCR được kiểm tra bằng xử lý 
với cặp enzyme giới hạn EcoRI và PstI (hình 3.6). Ở