Luận án Tạo thể lai mang gen kháng bệnh mốc sương bằng dung hợp tế bào trần giữa khoai tây dại và khoai tây trồng

atar (E3) Delikat (E1) 
Atlantic (E4) Agave (E1) 
pnt2G (E2) blb2G (E1) 
 47 
khi thời gian ủ dài sẽ gây độc cho tế bào, làm cho tế bào bị vỡ nát (do enzym 
macerozym gây độc cho tế bào) (bảng 4.2). Thí nghiệm đã tiến hành ủ các mẫu lá 
của các dòng/giống khoai tây (đã đƣợc cắt nhỏ và xử lý qua dung dịch gây co 
nguyên sinh) ở các thời gian ủ trong dung dịch enzym khác nhau dao động trong 
khoảng 13 giờ -16 giờ. 
Bảng 4.2. Ảnh hƣởng của thời gian ủ của m lá trong dung dịch enzym 
 đến hiệu suất tế ào trần thu đƣợc 
Tên 
dòng giống 
Thời gian ủ giờ 
 số tế ào trần ml) 
13 giờ 14 giờ 15 giờ 16 giờ 
pnt2G 0,9 x 10
5 
 2,7 x 10
5
 3,0 x 10
5
 3,9 x 10
5
blb2G 1,4 x 10
5
 2,9 x 10
5
 3, 4 x 10
5
 2, 6 x 10
5
trn3G 1,1 x 10
5
 2,9 x 10
5
 4,0x 10
5 3,4 x 10
5
Delikat 1,2 x 10
5
 2,8 x 10
5
 3,6 x 10
5
 2,8 x 10
5 
Quatar 1,2 x 10
5
 2,9 x 10
5
 3,4 x 10
5
 3,3 x 10
5
Rasant 2,4 x 10
5
 4,6 x 10
5
 3,8 x 10
5
 2,8 x 10
5 
Agave 2,1 x 10
5 
4,4 x 10
5
 3,9 x 10
5
 2,5 x 10
5
Atlantic 2,1 x 10
5
 3,5 x 10
5 3, 1 x 10
5
 2,1 x 10
5
Thời gian ủ mô lá trong dung dịch enzym có ảnh hƣởng rõ rệt đến hiệu 
quả tách tế bào trần. Thời gian ủ thích hợp của các mẫu lá trong dung dịch 
enzyme đối với các dòng/giống khoai tây dao động từ 14-16 giờ (bảng 4.2). 
Thời gian ủ mẫu lá thích hợp cho các giống Rasant, Agave, Atlantic là 14 
giờ. Ở thời gian ủ này cho số lƣợng tế bào trần thu đƣợc là cao nhất (từ 3,5 x 105 
đến 4,6 x 105 tế bào trần/ml). Ngoài ra thời gian ủ trong dung dịch enzym cũng 
ảnh hƣởng rõ rệt đến chất lƣợng tế bào trần thu đƣợc. Khi thời gian ủ tăng lên 15-
16 giờ thì lƣợng tế bào trần thu đƣợc giảm dần, tế bào bị vỡ nhiều. 
Với các dòng/giống blb2G, trn3G, Delikat, Quatar thời gian ủ thích hợp 
nhất là 15 giờ, số lƣợng tế bào trần đƣợc giải phóng cao hơn cả (mật độ tế bào 
trần thu đƣợc của các dòng/giống trên khi ủ mẫu lá trong 15 giờ lần lƣợt là 3,4 x 
10
5
; 4,0x10
5 
; 3,6 x 10
5 
; 3,4 x 10
5
 tế bào trần/ml). 
Riêng dòng pnt2G thời gian ủ thích hợp dài nhất là 16 giờ, cho số lƣợng tế 
bào trần cao nhất (3,9 x105 tế bào trần/ml). 
 48 
4.1.2. Dung hợp tế ào trần của các dòng khoai tây dại với các dòng khoai 
tây trồng thu thập đƣợc 
4.1.2.1. Ảnh hưởng của tần số dung hợp và số lần xung đến chất lượng tế bào 
sau dung hợp 
 Thí nghiệm 3: Ảnh hưởng của tần số dung hợp và số lần xung đến chất lượng tế 
bào sau dung hợp 
Tế bào trần của dòng dại Solanum bulbocastanum với giống Delikat ở mật 
độ 2 x 105 tế bào/ml đƣợc dung hợp với các thông số xung điện khác nhau. Chất 
lƣợng tế bào thu đƣợc sau xung điện đƣợc thể hiện qua bảng 4.3. 
Bảng 4.3. Ảnh hƣởng của tần số dung hợp và số lần xung đến chất lƣợng tế ào 
sau dung hợp (Nghiên cứu trên tổ hợp lai giữa Solanum bulbocastanum và Delikat) 
STT CT 
Thời gian tế 
bào phân chia (ngày) 
Thời gian xuất hiện 
microcallus
*
 (ngày) 
Số lƣợng 
macrocallus
** đĩa 
1 CT1 3 21 49,5 
2 CT2 2 18 65,4 
3 CT3 4 28 27,6 
4 CT4 4 24 38,2 
Chú thích: CT1- AC=700 kHz+ 3 lần xung (Rokka et al, 1994), CT2- 800 kHz+ 2 lần xung, CT3- 900 
kHz+2 lần xung, CT4- 1000KHz+1 lần xung; (*) microcallus- tiểu callus; (**) macrocallus- đại callus 
Chất lƣợng tế bào của tổ hợp Solanum bulbocastanum và Delikat sau dung 
hợp đƣợc thể hiện qua hình 4.2. 
Hình 4.2. Chất lƣợng tế bào sau dung hợp ở các tần số và số lần xung khác 
nhau (nghiên cứu trên tổ hợp lai giữa Solanum bulbocastanum và Delikat) 
Chú thích: A-chất lƣợng tế bào sau dung hợp ở tần số 700 kHz+ 3 lần xung, B- chất lƣợng tế bào sau 
dung hợp ở tần số 800 kHz+ 2 lần xung, C- chất lƣợng tế bào sau dung hợp ở tần số 900 kHz+ 2 lần xung, 
D- chất lƣợng tế bào sau dung hợp ở tần số 1000 kHz+ 1 lần xung 
A C 
B D 
 49 
Tần số và số lần xung hợp ảnh hƣởng rõ rệt đến chất lƣợng tế bào sau 
dung hợp (bảng 4.3, hình 4.2). 
Ở tần số 700 kHz và 3 lần xung, tế bào thu đƣợc sau dung hợp hầu nhƣ bị 
vỡ nát, những tế bào sống sót sau 5 ngày nuôi cấy mới có hiện tƣợng phân chia 
và sau 27 ngày microcallus mới hình thành, tỷ lệ hình thành macrocallus từ 
microcallus thấp trung bình chỉ có 9,5 macrocallus/đĩa. 
Tế bào đƣợc dung hợp ở các thông số của CT2 (tần số 800kHz và 2 lần 
xung), tế bào có tỷ lệ nguyên vẹn cao, thời gian xuất hiện hiện phân chia sớm (sau 
2 ngày nuôi cấy), các microcallus hình thành sau 18 ngày nuôi cấy trên môi trƣờng 
lỏng, số macrocallus hình thành/đĩa nhiều nhất (trung bình 65,4 macrocallus/đĩa). 
Khi tăng tần số xung lên 900 kHz và giữ nguyên số lần xung (CT3) thì tỷ 
lệ tế bào vỡ tăng, tế bào phân chia muộn hơn so với CT2 (4 ngày), số 
macrocallus hình thành chỉ đạt 27,6 macrocallus/đĩa. Tƣơng tự, khi dung hợp ở 
tần số 1000 kHz và 1 lần xung sau 3 ngày tế bào mới phân chia và số 
macrocallus/đĩa đạt 38,2 macrocallus. 
Nhƣ vậy dung hợp ở thông số 800 kHz và 2 lần xung là thích hợp nhất cho 
dung hợp xung điện giữa các dòng khoai tây dại nhị bội với các giống khoai tây 
trồng tứ bội. 
4.1.2.2. Ảnh hưởng của mật độ tế bào đến sự hiệu suất dung hợp 
 Thí nghiệm 4: Ảnh hưởng của mật độ tế bào đến sự hiệu suất dung hợp 
Tiến hành thí nghiệm dung hợp xung điện tế bào giữa dòng khoai tây dại 
Solanum bulbocastanum và giống Delikat ở mật độ khác nhau để xác định mật 
độ thích hợp nhất cho tỷ lệ con lai lục bội cao nhất (6x=72), kết quả đƣợc trình 
bày ở bảng 4.4. 
Mật độ ảnh hƣởng rõ rệt đến thời gian bắt đầu phân chia tế bào và tỷ lệ con 
lai lục bội tạo thành. Mật độ tế bào tham gia dung hợp càng cao thì tế bào phân chia 
sớm và tỷ lệ con lai con lai lục bội (6x) càng tăng (bảng 4.4). 
Ở mật độ dung hợp 1 x 105 tế bào/ml sau 3 ngày tế bào mới phân chia, tỷ 
lệ con lai tái sinh có độ bội 2x cao nhất (56,3%) trong khi đó con lai có độ bội 6x 
chỉ đạt 18,7%. 
Khi tăng mật độ dung hợp từ 2 x 105 tế bào/ml đến 5 x 105 tế bào/ml, tế 
bào cảm ứng nhanh và phân chia chỉ sau 2 ngày nuôi cấy. Tỷ lệ con lai 6x lại 
tăng ở hai mật độ dung hợp này (53,2% và 65,6% con lai là con lai 6x khi dung 
hợp ở mật độ 4 x 105 tế bào/ml và 5 x 105 tế bào/ml) 
 50 
Bảng 4.4. Kết quả tái sinh và độ ội của các con lai tái sinh sau dung hợp 
ở các mật độ tế ào dung hợp khác nhau (Nghiên cứu trên tổ hợp lai giữa 
Solanum bulbocastanum và Delikat) 
Mật độ 
xung hợp 
 tế ào 
ml) 
Thời gian 
xuất hiện 
phân chia 
(ngày) 
Số 
macrocallus
* đĩa 
Sau 4 tuần 
Số cây 
tái sinh 
(cây) 
Sau 8 tuần 
Tỷ lệ 
cây 2x 
(%) 
Tỷ lệ 
cây 4x 
(%) 
Tỷ lệ 
cây 6x 
(%) 
1x 10
5
 3 28,5 16 56,3 25,0 18,7 
2 x 10
5
 2 75,7 35 37,1 34,3 28,6 
3 x 10
5
 2 85,6 46 13,9 45,6 40,5 
4x 10
5
 2 68,3 47 14,9 31,9 53,2 
5 x 10
5
 2 62,6 29 10,3 24,1 65,6 
Chú thích: dung hợp với các thông số AC= 800 kHz, DC=120V và 2 lần xung; (*) macrocallus- đại callus 
Nhƣ vậy mật độ xung cho hiệu quả dung hợp tạo con lai 6x cao nhất là từ 
4x 10
5
 tế bào/ml đến 5x 105 tế bào/ml. 
4.1.2.3. Ảnh hưởng của kiểu gen khác nhau đến khả năng tái sinh tế bào sau 
dung hợp 
Thí nghiệm 5: Ảnh hưởng của kiểu gen khác nhau đến khả năng tái sinh tế bào 
sau dung hợp 
Tế bào trần của các dòng khoai tây dại và các giống khoai tây trồng đƣợc 
tách, pha loãng tạo mật độ 4 x 105 tế bào trần/ml trong dung dịch dung hợp và 
trộn theo tỷ lệ 1:1. Sử dụng máy xung điện máy xung điện CFA 500 (Krüss 
GmbH, Hamburg) với các thông số nhƣ kết luận ở thí nghiệm 3. Sau dung hợp tế 
bào đƣợc nuôi cấy trên môi trƣờng VKM II (Thieme et al., 1997). Các microcalli 
đƣợc hình thành sau 2-3 tuần nuôi cấy. Cấy chuyển các microcalli màu xanh, 
tƣơi với đƣờng kính khoảng 2-3 mm sang môi trƣờng tái sinh macrocallus (Cul-
medium). Các macrocallus này sẽ hình thành các chồi đầu tiên sau 8-12 tuần nuôi 
cấy tùy thuộc vào tổ hợp dòng khoai tây nghiên cứu. Kết quả nghiên cứu đƣợc 
trình bày ở bảng 4.5. 
Toàn bộ các tổ hợp dung hợp phân chia tế bào xảy ra sau 2-3 ngày nuôi cấy. 
Khả năng tạo macrocallus và tái sinh chồi phụ thuộc vào tổ hợp dung hợp hay phụ 
thuộc vào bản chất di truyền của dòng cây nghiên cứu. Tổng cộng đã tạo đƣợc 07 tổ 
hợp lai giữa các dòng khoai tây dại với các giống khoai tây trồng (bảng 4.5, hình 4.3). 
Hình 4.3 cho thấy sự phân chia hình thành callus của các tổ hợp lai khác nhau 
sau dung hợp phụ thuộc vào bản chất di truyền. Các tổ hợp lai giữa giống khoai 
tây trồng Atlantic với các dòng khoai tây dại khác nhau cho kết quả khác nhau. 
 51 
Bảng 4.5. Kết quả dung hợp giữa các dòng khoai tây dại nhị ội 
với các giống khoai tây trồng tứ ội ằng phƣơng pháp xung điện 
STT Tên tổ hợp lai 
Số lƣợng callus 
tái sinh 
Số lƣợng chồi 
tái sinh 
Tỷ lệ tái sinh 
(%) 
1 trn3G + Agave 120 39 32,5 
2 trn3G + Rasant 97 25 25,8 
3 blb2G + Delikat 250 31 12,4 
4 trn3G + Delikat 250 64 25,6 
5 Pnt2G + Atlantic 193 23 11,9 
6 blb2G + Atlantic 307 4 1,3 
7 trn3G + Atlantic 395 2 0,5 
Hình 4.3. Các macrocallus tái sinh sau khi dung hợp 
 nu i cấy trên m i Cul-medium sau 3 tuần nu i cấy 
Chú thích: 1. Tổ hợp blb2G + Atlantic; 2- Tổ hợp pnt2G +Atlantic; 3- Tổ hợp trn3G+Atlantic 
4.1.3. Nu i cấy và tái sinh các tổ hợp lai sau dung hợp 
4.1.3.1. Ảnh hưởng của điều kiện môi trường nuôi cấy đến kết quả tái sinh sau 
khi dung hợp 
Thí nghiệm 6: Ảnh hưởng của điều kiện môi trường nuôi cấy đến kết quả tái sinh 
sau khi dung hợp 
Tế bào trần của các dòng khoai tây dại nhị bội và các giống khoai tây 
trồng tứ bội đƣợc dung hợp bằng xung điện theo quy trình đã đƣợc tối ƣu hóa ở 
giai đoạn trƣớc. Tế bào trần sau khi dung hợp đƣợc nuôi cấy trên môi trƣờng 
VKM II (Thieme et al., 1997) ở các nền khác nhau (lỏng; bán lỏng và rắn). Kết 
quả đƣợc thể hiện trên bảng 4.6 và hình 4.4. 
Ảnh hƣởng của điều kiện môi trƣờng khác nhau đến sự phân chia của tế 
bào trần là rất rõ rệt (bảng 4.6). Trên môi trƣờng lỏng, tế bào trần của các các tổ 
hợp lai bắt đầu phân chia sau 2-3 ngày nuôi cấy và tạo microcallus sau khoảng 2 
1 2 3 
 52 
tuần nuôi cấy. Trong khi đó các tế bào trần trên môi trƣờng bán lỏng (nhỏ giọt 
agar) có thời gian xuất hiện phân chia lâu hơn (sau từ 4-7 ngày). Trên môi trƣờng 
rắn, các tế bào hầu nhƣ không có khả năng phân chia hoặc chỉ có rất ít tổ hợp có 
xuất hiện phân chia tế bào (blb + Delikat; trn + Delikat; blb + Atlantic) nhƣng sau 
thời gian lâu hơn rất nhiều (trên 9 ngày). Điều này rất đúng với lý thuyết là môi 
trƣờng nuôi cấy tế bào trần phải đảm bảo đƣợc sự cân bằng áp suất thẩm thấu giữa 
môi trƣờng và nội bào, nồng độ Ca2+ trong môi trƣờng nuôi cấy tế bào trần thƣờng 
cao hơn 2-4 lần so với môi trƣờng bình thƣờng cho tới khi tái sinh đƣợc vách tế 
bào đƣợc hình thành và hình thành microcallus. Nhƣ vậy chỉ có môi trƣờng lỏng 
mới đảm bảo đƣợc các điều kiện trên. 
Bảng 4.6. Sự phân chia của các tổ hợp lai sau khi dung hợp trên các điều kiện 
m i trƣờng khác nhau* 
Tổ hợp lai 
Thời gian xuất hiện tế ào 
phân chia (ngày) 
Thời gian xuất hiện 
microcallus (ngày) 
Lỏng Bán lỏng Rắn Lỏng Bán lỏng Rắn 
trn3G + Agave 3 4 - 12 21 - 
trn3G + Rasant 3 3 - 14 21 - 
blb2G + Delikat 2 5 15 11 26 - 
trn3G + Delikat 3 6 9 12 25 - 
pnt2G + Atlantic 2 6 - 10 22 - 
blb2G + Atlantic 3 5 11 12 23 - 
trn3G + Atlantic 3 4 - 14 24 - 
Chú thích: (
*
)
 10 đĩa petri/tổ hợp dung hợp đƣợc theo dõi sự phân chia tế bào nuôi cấy trên môi 
trƣờng VKM II trong điều kiện tối, nhiệt độ 20-220C; (-) tế bào không phân chia. 
Hình 4.4. Sự phân chia của tổ hợp lai trn3G + Delikat trên các điều kiện môi 
trƣờng khác nhau sau 4 ngày nuôi cấy 
Chú thích: 1- VKM II lỏng; 2- VKM II bán lỏng; 3- VKM II rắn 
1 3 2 
 53 
Điều kiện môi trƣờng cũng có ảnh hƣởng rõ rệt đến khả năng phân chia 
tạo microcallus của các tế bào trần sau dung hợp. Trên môi trƣờng lỏng, hầu 
nhƣ các tế bào phân chia tạo hạt microcallus sau khoảng 10-14 ngày với chất lƣợng 
microcallus trắng sáng, kích thƣớc hạt to nhƣ hạt tấm. Khả năng hình thành 
microcallus trên môi trƣờng bán lỏng chậm hơn (sau khoảng 20 ngày) và chất lƣợng 
microcallus kém hơn (xuất hiện nhiều microcllus màu nâu sáng, hạt nhỏ). Trên 
môi trƣờng rắn các tế bào không có khả năng phân chia hình thành microcallus. 
4.1.3.2. Ảnh hưởng của loại môi trường nuôi cấy đến sự phân chia của các tổ 
hợp lai sau dung hợp 
Thí nghiệm 7: Ảnh hưởng của loại môi trường nuôi cấy đến sự phân chia của 
các tổ hợp lai sau dung hợp 
Tế bào trần của các tổ hợp lai sau khi dung hợp đƣợc nuôi cấy trên các 
loại môi trƣờng lỏng khác nhau: môi trƣờng VKM II (Thieme et al., 1997), 
Medium A* (Ehsanpour et al., 2001), KM8P* (Paula Conde et al., 2006) đƣợc 
trình bày ở bảng 4.7. 
Bảng 4.7. Sự phân chia của các tổ hợp lai trên các m i trƣờng nu i cấy khác nhau 
Tổ hợp lai 
Thời gian xuất hiện 
tế ào phân chia 
(ngày) 
Thời gian xuất hiện 
microcallus 
 (ngày) 
Số lƣợng 
microcallus trung 
 ình đĩa petri 
VKMII A* KM8P* VKMII A* KM8P* VKMII A* KM8P* 
trn3G + Agave 3 5 6 12 - - 22,7 - - 
trn3G + Rasant 3 4 5 14 21 - 13,3 4,4 - 
blb2G + Delikat 2 7 5 11 - - 29,6 - - 
trn3G + Delikat 3 9 4 12 21 - 35,7 - 5,8 
Pnt2G + Atlantic 2 6 6 10 - 22 48,3 - 1,3 
blb2G + Atlantic 3 9 4 12 - - 5,1 - - 
trn3G + Atlantic 3 7 8 14 21 - 9,4 5,9 - 
Chú thích: 10 đĩa petri/tổ hợp dung hợp đƣợc theo dõi sự phân chia tế bào nuôi cấy trên môi 
trƣờng lỏng trong điều kiện tối, nhiệt độ 20-220C; (-) tế bào không phân chia. 
Trên môi trƣờng A* và KM8P*, thời gian bắt đầu phân chia của tế bào 
trần của các dòng khoai tây nghiên cứu là 4-9 ngày. Tốc độ phân chia tế bào thấp 
và không đồng đều. Hầu nhƣ các tế bào trần không hình thành đƣợc microcallus 
và chết sau 2 tuần nuôi cấy. Chỉ có rất ít tổ hợp lai có hình thành microcallus trên 
môi trƣờng A* và KM8P* nhƣng sau thời gian rất lâu (bảng 4.7). 
 54 
Các tế bào trần nuôi cấy trên môi trƣờng VKMII bắt đầu phân chia chỉ sau 
2-3 ngày nuôi cấy tùy thuộc vào dòng khoai tây nuôi cấy. Sau 3 ngày nuôi cấy, 
toàn bộ các dòng đều phân chia và tạo microcallus sau 2 tuần nuôi cấy. Các tổ 
hợp lai khác nhau cũng có sự phân chia và sự hình thành microcallus khác nhau 
trên môi trƣờng VKMII. Nhƣ vậy: môi trƣờng VKMII là môi trƣờng thích hợp 
để nuôi cấy tạo microcallus của tế bào trần sau khi dung hợp. 
4.1.3.3. Ảnh hưởng của môi trường tái sinh khác nhau đến sự tái sinh chồi 
của các tổ hợp lai 
Thí nghiệm 8: Ảnh hưởng của môi trường tái sinh khác nhau đến sự tái sinh chồi 
của các tổ hợp lai 
Các tổ hợp lai sau khi dung hợp phân chia tạo microcallus trên môi trƣờng 
lỏng VKMII đƣợc cấy chuyển sang môi trƣờng Cul-medium (theo Thieme et al., 
2008) để tạo các macrocallus. Các macrocallus đƣợc cấy chuyển sang môi trƣờng 
tái sinh tạo chồi. Thí nghiệm theo dõi 10 đĩa petri/tổ hợp lai, mỗi đĩa petri cấy 10 
macrocallus (đƣờng kính từ 2-4mm). Mỗi callus chỉ lấy 1 chồi đầu tiên và lấy số 
lƣợng chồi trung bình/đĩa. Kết quả đƣợc thể hiện ở bảng 4.8, hình 4.5. 
Bảng 4.8. Ảnh hƣởng của m i trƣờng tái sinh khác nhau đến khả năng tạo chồi 
của các tổ hợp lai 
Tổ hợp lai 
Số lƣợng chồi tái sinh chất lƣợng chồi 
M i trƣờng RJM M i trƣờng MSO M i trƣờng K8P 
trn3G + Agave 3,3/++ 0,8/+ 2,5/+ 
trn3G + Rasant 5,5/++ 1,6/+ 1,3/+ 
blb2G + Delikat 6,5/++ 0/- 2,4/+ 
trn3G + Delikat 8,8/++ 0/- 0,8/- 
pnt2G + Atlantic 6,4/++ 1,65/+ 0/- 
blb2G + Atlantic 1,7/+ 0/- 0/- 
trn3G + Atlantic 2,3/- 0/- 0/- 
(-): Chồi yếu, màu trắng; +: Chồi phát triển trung bình, màu vàng nhạt; ++: chồi tốt, mập, xanh 
Môi trƣờng khác nhau có ảnh hƣởng rõ rệt đến khả năng tái sinh tạo chồi 
của các tổ hợp lai. Nhìn chung, trên môi trƣờng MSO và K8P, các callus của các 
tổ hợp lai tái sinh kém, số chồi trung bình /đĩa chỉ đạt từ 0-2,5 chồi/đĩa. Nhiều đĩa 
không có khả năng tái sinh chồi. Trên môi trƣờng RJM, hầu nhƣ các tổ hợp lai 
đều có khả năng tái sinh tạo chồi với số chồi trung bình/đĩa dao động từ 1,3-9,1 
chồi/đĩa. Khả năng tạo chồi của các tổ hợp lai khác nhau cũng khác nhau rõ rệt. 
Các tổ hợp lai trn3G + Delikat, pnt3G +Atlantic có khả năng tái sinh cao với số 
 55 
chồi trung bình/đĩa lần lƣợt là 8,8 và 6,4. Các chồi này phát triển tốt, màu xanh. 
Tổ hợp lai blb2G +Atlantic; trn3G +Atlantic có khả năng tái sinh kém, chất 
lƣợng chồi kém, màu trắng xốp (bảng 4.8). 
Hình 4.5 Khả năng tái sinh chồi của tổ hợp lai trn + Rasant sau 12 tuần 
 trên m i trƣờng khác nhau 
 1- Môi trƣờng RJM; 2- Môi trƣờng MSO; 3- Môi trƣờng K8P. 
Tổng hợp các kết quả nuôi cấy và tái sinh các tổ hợp lai sau dung hợp thì 
thấy đã tái sinh đƣợc tổng số 1612 callus và tạo đƣợc 188 chồi trong đó tỷ lệ tái 
sinh chồi của các tổ hợp lai khác nhau rõ rệt (bảng 4.9). 
Bảng 4.9. Kết quả nu i cấy tái sinh chồi của các tổ hợp lai sau dung hợp 
Tên tổ hợp lai 
Số lƣợng callus 
tái sinh 
Số lƣợng chồi 
tái sinh 
Tỷ lệ tái sinh 
(%) 
trn3G + Agave 120 39 32,5 
trn3G + Rasant 97 25 25,8 
blb2G + Delikat 250 31 12,4 
trn3G + Delikat 250 64 25,6 
pnt2G +Atlantic 193 23 11,9 
blb2G + Atlantic 307 4 1,3 
trn3G + Atlantic 395 2 0,5 
Tổng số 1612 188 
4.1.4. Xác định các con lai soma ằng các phƣơng pháp đo độ ội Flow 
cytometry và ằng chỉ thị phân tử SSR 
4.1.4.1. Xác định các con lai soma bằng phương pháp đếm độ bội thể (Flow 
cytometry) 
Thí nghiệm 9: Xác định các con lai soma bằng phương pháp đếm độ bội thể 
(Flow cytometry) 
Từ kết quả dung hợp tế bào trần đã tạo đƣợc 07 tổ hợp lai giữa các dòng 
khoai tây dại nhị bội và các giống khoai tây trồng tứ bội. Các tổ hợp lai đƣợc 
1 2 3 
 56 
nuôi cấy tái sinh để tạo microcallus, macrocallus và tái sinh chồi. Sử dụng 
phƣơng pháp phân tích độ bội thể Flow cyometry để đo độ bội của các con lai. 
Kết quả đƣợc thể hiện trên bảng 4.10, hình 4 .6. 
Bảng 4.10. Kết quả tái sinh và phân tích độ ội thể của các tổ hợp lai 
sau dung hợp 
STT Tên tổ hợp lai 
Số lƣợng callus 
tái sinh 
Số lƣợng chồi tái 
sinh 
Số dòng lục 
 ội 2n= 6x 
1 trn3G + Agave 120 39 15 
2 trn3G + Rasant 97 25 12 
3 blb2G +Delikat 250 31 15 
4 trn3G + Delikat 250 64 28 
5 pnt2G +Atlantic 193 23 9 
6 blb2G + Atlantic 307 4 3 
7 trn3G + Atlantic 395 2 0 
Tổng 1612 188 82 
Hình 4.6. Hình ảnh độ ội thể của dòng khoai tây ố m và con lai 
Chú thích: A- Giống khoai tây trồng (4x), B- Dòng khoai tây dại (2x), 
C- con lai soma lục bội (6x) 
Từ 188 chồi tái sinh sau dung hợp chỉ có 82 cây có độ bội thể 2n=6x 
(chiếm tỷ lệ 43,6 %). Tỷ lệ cây lục bội (2n=6x) phụ thuộc vào các tổ hợp dung 
hợp khác nhau. Trong 7 tổ hợp dung hợp thì tổ hợp lai Delikat (+) trn3G cho tỷ 
lệ cây tái sinh có độ bội thể 6x là cao nhất trong khi đó tổ hợp lai giữa Atlantic 
(+) trn 3G không cho kết quả tạo con lai lục bội (bảng 4.10). 
Sử dụng máy flow cytometry đã xác định đƣợc 82/102 dòng là thể lục bội. 
Mục tiêu của nghiên cứu cần tách đƣợc các thể lai dị nhân lục bội (con lai soma). 
A B 
C 
 57 
4.1.4.2. Xác định các con lai soma bằng chỉ thị phân tử SSR 
Thí nghiệm 10: Xác định các con lai soma bằng chỉ thị phân tử SSR 
Mục tiêu của nghiên cứu cần chọn lọc đƣợc các thể lai có kiểu gen dị hợp 
nhân (con lai soma giữa khoai tây dại và khoai tây trồng). Các con lai ngẫu nhiên 
đƣợc xác định bằng chỉ thị phân tử SSR (Dinu and Thieme 2001), sử dụng cặp mồi 
theo Song et al. (2005). Hình 4.7 và 4.8 minh họa cho kết quả điện di cho phân 
tích 2 chỉ thị SSR là chỉ thị STIIKA và chỉ thị STM2022 nhằm xác định kiểu gen 
dị hợp nhân của các dòng lục bội của tổ hợp lai giữa trn3G+ Rasant. Trong số 25 
dòng con lai tái sinh ngẫu nhiên của tổ hợp lai dòng dại trn3G và giống Rasant 
đƣợc phân tích có 6 con lai lục bội có kiểu gen dị hợp nhân. 
Hình 4.7. Minh họa kết quả điện di cho phân tích chỉ thị phân tử STIIKA 
để xác định kiểu gen dị hợp nhân của tổ hợp lai trn 3G + cv.Rasant 
Chú thích: giếng 1- trn3G; giếng 2- Rasant; giếng 3-27 là 25 dòng lai ngẫu nhiên tái sinh của tổ hợp lai 
giữa trn3G + Rasant trong đó có 6 con lai lục bội dị hợp nhân gồm: giếng 6- con lai 1/6, giếng 12- con lai 
3/4, giếng 20- con lai 3/5, giếng 21- con lai 3/ 7, giếng 22- 3/9, giếng 24- 3/12. 
Hình 4.8 Minh họa kết quả điện di cho phân tích chỉ t