Luận án Xây dựng chỉ thị phân tử nhận dạng và nghiên cứu nhân giống bảo tồn loài xáo tam phân (Paramignya trimera)

 vitro Xáo tam phân từ đoạn thân. 
Kết quả nghiên cứu cho thấy, môi trường MS có bổ sung 1,5mg/l BAP cho số 
49 
lượng chồi từ đoạn thân đạt 3,1 chồi/mẫu. Môi trường MS bổ sung 0,1mg/l TDZ thì 
mẫu vật nghiên cứu tạo chồi và tạo callus [82]. Tiếp đến năm 2017, tác giả Trần 
Trung Hiếu và cs. đã nghiên cứu nhân nhanh in vitro cây Xáo tam phân . Kết quả 
nghiên cứu chỉ ra rằng đề tài này được thực hiệnnhằm thiết lập một quy trình nhân 
giống in vitro để bảo tồn loài dược liệu này. Các cụm chồi bất định (5 - 8 
chồi/cụm) được tái sinh từ các đoạn thân mang chồi bên (của cây 13 năm tuổi) sau 
3 tháng nuôi cấy trên môi trường WPM (Woody Plant Medium) có chứa STS 
(silver thiosulfate) 3 mg/L và BA 5 - 7 mg/L. STS được sử dụng để ngăn chặn sự 
rụng lá. Các cụm chồi con tăng trưởng chậm và đạt chiều cao từ 1 - 3 cm sau 4 
tháng nuôi cấy. Các cụm chồi này không thành lập rễ sau 2 tháng nuôi cấy trên môi 
trường tạo rễ chứa IBA và/hoặc αNAA 1 - 5 mg/L. Có 51 % cụm chồi (đã được xử 
lý trên môi trường tạo rễ) có khả năng thích nghi và tạo thân và lá mới sau 2 tháng 
nuôi trồng trong vườn ươm. Môi trường WPM có bổ sung STS 3 mg/L, BA 5 mg/L 
và IBA 5 mg/L cho tỷ lệ mô sẹo hình thành nhiều nhất từ các mẫu lá trưởng thành 
sau 3 tháng nuôi cấy. Trong số các loại mô sẹo, mô sẹo chắc màu trắng đục được 
tạo ra tại mặt cắt của mô lá sau 3 tháng nuôi cấy và phát triển thành mô sẹo chắc 
dạng nốt sau 4 tuần [83, 84]. 
1.4.2. Nhân giống Xáo tam phân trong tự nhiên 
1.4.2.1. Kỹ thuật gieo hạt Xáo tam phân trong tự nhiên 
Kỹ thuật gieo hạt Xáo tam phân được tiến hành theo trình tự các bước: Giai 
đoạn Chuẩn bị: Chậu nhỏ (hoặc chậu to nếu sau này không muốn thay chậu nữa) 
hoặc khay ươm nếu gieo số lượng nhiều; Thuốc trừ nấm; Đất trồng: Hỗn hợp đất 
theo tỉ lệ (đất: mùn cưa nhỏ: trấu hun) là (1:3:1). Lưu ý trấu hun nên ngâm xả nhiều 
lần; Tiến hành gieo hạt: Đất trồng sau khi trộn đều, chúng ta cho vào chậu hoặc 
khay ươm; Tưới đẫm đất trồng; Phun thuốc trừ nấm lên mặt đất trồng, tốt nhất phun 
liên tục 2-3 lần để thuốc thấm xuống sâu hơn; Ngâm hạt: Nên ngâm bằng nước ấm 
(nguyên tắc pha nước 2 sôi: 3 lạnh) ngâm 1 đêm cho vỏ hạt nở sau đó tiến hành 
gieo hạt; Gieo hạt: Chôn hạt với độ sâu khoảng 2 - 3 cm xuống đất. Sau đó, phun 
sương cho hạt bám vào chất trồng là được. Sau khi gieo hạt xong nên phun sương 
lên bề mặt vài lần để đất và hạt tiếp xúc với nhau. Chăm sóc sau khi gieo hạt: Nhiệt 
độ: Dao động từ khoảng 20 - 25°C là thích hợp. Độ ẩm của đất trồng: Đảm bảo độ 
ẩm cho đất, không được để đất bị khô, phun 2 lần/ngày. Đặt chậu hoặc khay ươm ở 
50 
nơi có ánh sáng khuyếch tán (che lưới đen); Bón phân: Đối với cây con, hệ rễ vẫn 
chưa đủ mạnh để hấp thụ phân có nồng độ cao, cho nên việc dùng phân bón lá là 
thích hợp nhất chỉ nên tưới phân bón lá bằng 1/2 hoặc 2/3 nồng độ trên bao bì 
hướng dẫn. Sâu bệnh: Giai đoạn cây con phải chú ý quan sát thường xuyên vì rất dễ 
bị sâu ăn lá tấn công, ta nên phun ngừa thuốc trừ nấm, trừ sâu (dạng vi sinh) 1 
tuần/1 lần. Ngoài ra cũng chú ý đất trồng không được để úng tránh cây bị thối. 
1.4.2.2. Kỹ thuật giâm cành Xáo tam phân trong tự nhiên bao gồm 
Chọn cây đầu dòng để nhân giống: Cây đầu dòng sử dụng nhân giống phải 
khỏe mạnh, không mang mầm bệnh và côn trùng nguy hiểm; Kỹ thuật giâm cành 
Xáo tam phân bao gồm: (1) Chuẩn bị cành giâm: Cành được sử dụng để giâm cành 
lấy từ ngọn khoảng 20 - 25 cm ở giai đoạn cây không ra hoa, cành này có sức sống 
mạnh. Cành giâm nên được thu lúc sáng sớm, trong tình trạng trương nước. Có thể 
trữ cành trong các bao plastic lớn, phun nước bên trong và cột miệng bao để tránh 
mất nước. Để bao trong trong điều kiện mát, tránh ánh sáng làm nhiệt độ bên trong 
bao tăng cao. Chiều dài cành giâm khoảng 15 - 20 cm. Tỉa bớt lá dưới đáy cành, giữ 
lại 5 - 7 lá. Cắt bớt 1/2 chiều dài lá để giảm thóat hơi nước. Vạt xéo đáy cành 1 góc 
45°, dùng dao rạch vài đường ở đáy cành để tạo mô sẹo, kích thích sự ra rễ. (2) 
Chuẩn bị hóa chất: Hóa chất được sử dụng để giâm cành là các auxin tổng hợp, bao 
gồm α-NAA và 2,4-D. Nồng độ sử dụng: 4 mg/l α-NAA + 0,5 mg/l 2,4-D để kích 
thích ra rễ cành giâm. Các hóa chất này có thể mua ở các cửa hàng bán hóa chất 
tinh khiết và thường được hướng dẫn cách pha trong cồn. (3) Giá thể giâm cành: 
Giá thể giâm cành có 4 chức năng: Cố định cành giâm, giữ ẩm tốt, thóang khí và 
che tối cho đáy cành. Có thể dùng mụn xơ dừa hoặc trấu để làm giá thể giâm cành. 
Dụng cụ giâm cành có thể là rổ nhựa, khay hay bồn chứa, bên trong chứa giá thể 
giâm cành. Đặt dụng cụ giâm cành trong nhà giâm cành hoặc đơn giản hơn là trùm 
lại bằng tấm nhựa kín, khoảng trống phía trên càng cao càng tốt, vì nó sẽ tăng khả 
năng giữ ẩm độ và giảm được nhiệt độ bên trong. (4) Giâm cành: Lấy các cành 
giâm đã được chuẩn bị sẵn, nhúng đáy cành giâm vào hóa chất trong thời gian 3 - 4 
giây. Cành sau khi xử lý xong để cho hóa chất thấm vào đáy cành. Khi chất thấm 
khô, cắm cành giâm vào giá thể giâm. (5) Chăm sóc sau khi giâm: Điều kiện ngoại 
cảnh ảnh hưởng nhiều đến tỷ lệ ra rễ, sức sống và tỷ lệ chết của cành giâm. Nhiệt độ 
trong môi trường tốt nhất khoảng 30 ± 2°C. Nhiệt độ cao làm cho lá cành giâm trở 
51 
nên vàng và rụng. Sự xuất hiện của lá còn trên cành ảnh hưởng lớn đến tỷ lệ ra rễ 
của cành giâm. Ẩm độ của nơi giâm cành phải được duy trì ở mức 85 - 90% trong 
suốt thời gian giâm cành. Ánh sáng không quá cao, nên sử dụng ánh sáng khuếch 
tán trong khoảng 1.000 - 2.000 lux. Tốt nhất, là để trong nhà có mái che bằng lá, 
không có ánh sáng trực tiếp chiếu vào. Ba yếu tố ngoại cảnh trên ảnh hưởng đến 
50% sự thành công. Trong suốt quá trình giâm cành, nếu thấy lá trên cành giâm còn 
xanh, không rụng, không vàng thì mức độ thành công sẽ trên 50%. Nên theo dõi ẩm 
độ và nhiệt độ thường xuyên, phải bảo đảm các yếu tố này trong khoảng tối hảo thì 
tỉ lệ thành công mới cao. (6) Chăm sóc cây con: Thời gian ra rễ của cành giâm tùy 
vào sức sống của cành. Nếu chọn cành khỏe mạnh và đồng nhất về kiểu cành thì 
thời gian ra rễ khoảng 45 - 50 ngày và tỷ lệ ra rễ đạt khoảng 60 - 65%. Sử dụng 
cành trung bình thì thời gian ra rễ dài hơn (60 - 85 ngày) và tỷ lệ ra rễ chỉ khoảng 
50%. Cành giâm sau khi ra rễ được trồng trong các bầu plastic có chứa thành phần 
đất, mụn xơ dừa và phân chuồng. Cây con trồng trong bầu được để nơi thóang mát 
và tưới nước thường xuyên. Mỗi ngày tưới 4 lần, sáng 2 lần, chiều 2 lần. Sau 1 tuần 
bắt đầu tưới thêm phân đầu trâu. Ngâm phân đầu trâu vào thùng nước lượng 2 g/lít, 
tưới vào bầu đất mỗi tuần một lần cho đến khi cành giâm ra lá mới. 
1.4.2.3. Kỹ thuật chiết cành Xáo tam phân trong tự nhiên 
Đây là phương pháp mang lại hiệu quả nhân giống cao. Các cành bánh tẻ đủ 
chất lượng về tiêu chuẩn chiết cành sẽ được chọn làm vật liệu chiết cành. Cành 
chọn được tiến hành chiết theo các bước sau: (1) Chọn vị trí khoanh vỏ, khoảng 5 
cm về chiều dài, sau đó tiến hành lau sạch lớp tượng tầng nằm giữa vỏ và lớp gỗ. 
(2) Sử dụng chất kích thích ra rễ để bôi vào xung quanh vết cắt. (3) Sau đó dùng đất 
bùn buộc chặt và bọc nilon tạo bầu cho cành chiết. (4) Sau 1 - 2 tháng sau khi rễ 
hình thành thì cành chiết được cắt ra và đem trồng tạo cây mới hoàn chỉnh. 
52 
CHƯƠNG II. VẬT LIỆU, NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP 
NGHIÊN CỨU 
2.1. Vật liệu nghiên cứu 
2.1.1. Vật liệu cho nghiên cứu vị trí phân loại và quan hệ phát sinh của các mẫu 
thu thập 
Năm (05) nhóm mẫu loài Xáo tam phân có sai khác về mặt hình thái (lá, thân, 
kiểu gai) và mẫu lá của 4 nhóm loài thuộc chi Paramignya (P. armata, P. monophylla 
Wight, P. scandens, P. rectispionisa Craib) đã được định tên, phân bố tại Việt Nam 
được thu thập để nghiên cứu tách chiết, khuếch đại các trình tự DNA bảo thủ phục vụ 
cho việc nhận dạng, so sánh và đánh giá quan hệ phát sinh (Bảng 2.1). 
Bảng 2.1. Bảng mẫu sử dụng tách chiết DNA, phân tích quan hệ phát sinh 
TT Mẫu Thời gian thu mẫu Địa điểm thu mẫu 
1 P. trimera 1 16/8/2018 Ninh Vân, Khánh Hòa, Việt Nam 
2 P. trimera 2 17/8/2018 Ninh Vân, Khánh Hòa, Việt Nam 
3 P. trimera 3 20/8/2018 Ninh Hòa, Khánh Hòa, Việt Nam 
4 P. trimera 4 16/8/2018 Ninh Hòa, Khánh Hòa, Việt Nam 
5 P. trimera 5 20/8/2018 Diên Khánh, Khánh Hòa, Việt Nam 
6 P. armata 22/4/2019 Ninh Vân, Khánh Hòa, Việt Nam 
7 P. scandens 23/4/2019 Cát tiên, Lâm Đồng, Việt Nam 
8 P. monophylla 26/4/2019 Cát tiên, Lâm Đồng, Việt Nam 
9 P. rectispionisa 3/5/2019 Cát tiên, Lâm Đồng, Việt Nam 
2.1.2. Vật liệu cho nghiên cứu nhân nhanh in vitro mẫu Xáo tam phân 
Vật liệu được sử dụng cho nghiên cứu tạo mô sẹo là lá mầm từ hạt của loài 
Xáo tam phân thu thập tại Khánh Hòa. 
Vật liệu được sử dụng cho nghiên cứu nhân nhanh in vitro là đoạn thân mang 
mắt ngủ và hạt Xáo tam phân thu thập tại công ty TNHH Bá Ninh, xã Ninh Vân, 
Khánh Hòa. 
53 
2.1.3. Các chỉ thị phân tử DNA 
Trong nghiên cứu này 50 chỉ thị SSR được sử dụng và mô tả bởi Froelicher 
và cs. (2008), Corazza-Nunes và cs. (2002), Barkley và cs. (2006) được đặt tổng 
hợp từ hãng Bioneer [84-86]. 
Bảng 2.2. Trình tự mồi SSR sử dụng 
Số 
mồi 
Tên mồi Trình tự mồi (5′ - 3′) 
Kích thước 
dự kiến 
(bp) 
1. Ci01A07 
F: GATGATGTCACCCTTGTTGTTG 
R: TTATGTCTCCTTTCCCTTTTGT 
183 - 185 
2. Ci01C07 
F: GTCACTCACTCTCGCTCTTG 
R: TTGCTAGCTGCTTTAACTTT 
241 – 278 
3. Ci01C09 
F: GACAGAATGGGAGAGGAGA 
R: TTGTCCCTTCCCTTTGTA 
266 - 270 
4. Ci01D11 
F: GCAAAACAAGCAGACTACAAAT 
R: AGGACAGATGACCCAGATGACA 
198 - 208 
5. Ci01D12 
F: ATTTATTTTCTTTCCCTTGTCTTA 
R: TTTTCTTCTTCATCTCTTTACTGC 
101 - 103 
6. Ci01G11 
F: ACTGTTGCTGCTGCTGCTGCT 
R: TCGCTTTCTTATTTCACACTCACC 
106 - 109 
7. Ci01H05 
F: AAAACAACCAAAAGGACAAGATT 
R: TTCAAACTAAACAAACCAACTCG 
93 - 103 
8. Ci02A04 
F: CCGCTTTGTTCCATT 
R: AGCGGTATCGTAATTCTC 
160 - 168 
9. Ci02B07 
F: CAGCTCAACATGAAAGG 
R: TTGGAGAACAGGATGG 
164 - 172 
10. Ci02B10 
F: TTTCACAGCCATCACA 
R: AACACCAAGAAGGAAGAG 
186 - 200 
11. Ci02F03 
F: TATCGACAACTCTTTCTCAT 
R: TAAAGCGCATGGATACT 
159 - 171 
12. Ci02F07 
F: GCAGCGTTTGTTTTCT 
R: TGCTGGTTTTCAGATACTT 
162 - 192 
54 
Số 
mồi 
Tên mồi Trình tự mồi (5′ - 3′) 
Kích thước 
dự kiến 
(bp) 
13. Ci06A05b 
F: TCTCTGGTTGGTTTTTGTGA 
R: ATGATGAAAAGCAAGGGG 
174 - 228 
14. Ci07B09 
F: AAACTGGAGTGCTAAATCT 
R: AAAGAAGTTAAAGAAAAAATG 
191 - 194 
15. Ci07C07 
F: TATCCAGTTTGTAAATGAG 
R: TGATATTTGATTAGTTTGG 
220 - 234 
16. Ci07C09 
F: GACCCTGCCTCCAAAGTATC 
R: GTGGCTGTTGAGGGGTTG 
240 - 256 
17. Ci07D10 
F: CGAGACAGACACAACAAAAA 
R: AGAGGGTAATCCAAAAGACT 
146 - 158 
18. Ci07E06 
F: AATAAACGCCCACCTGAGAC 
R: CAGTTGTTAAAAGGGAAGAATGAA 
216 - 240 
19. Ci07G07 
F: TCAACAAAACCATTACAT 
R: AGTCTTTCACGTTAATCAC 
123 - 127 
20. Ci08A10 
F: GAGACTTTACTTGAATGAA 
R: ATCTCGTGTTGAAAATAA 
154 - 162 
21. Ci08C05 
F: TCCACAGATTGCCCATTA 
R: CCCTAAAAACCAAGTGACA 
148 - 182 
22. mCrCIR01B02 
F: TCAACTTCTCTGGTCTCTC 
R: TTAGCAATATCAACATCAT 
200 - 212 
23. mCrCIR01B10 
F: AAAAATTGCCCTCTTCTCCT 
R: TGGTGGTTTTGTTGGTTCTAT 
160 - 166 
24. mCrCIR01D06a 
F: GATCAAAACATTATTCCAA 
R: TTTTTCATCAACAAGACTG 
224 - 246 
25. mCrCIR01E02 
F: TGAATGGTACGGGAAATGC 
R: CAGGGTCGGTGGAGAGGAT 
154 - 166 
26. mCrCIR01F04a 
F: AAGCATTTAGGGAGGGTCACT 
R: TGCTGCTGCTGTTGTTGTTCT 
184 - 222 
27. mCrCIR01F08a 
F: ATGAGCTAAAGAGAAGAGG 
R: GGACTCAACACAACACAA 
118 - 148 
55 
Số 
mồi 
Tên mồi Trình tự mồi (5′ - 3′) 
Kích thước 
dự kiến 
(bp) 
28. mCrCIR06A02 
F: TGAATCCTCTATGGCTAT 
R: TAAGATAAAAACAGCACA 
219 - 235 
29. mCrCIR06A03 
F: GGGTTGCGACGATGAGC 
R: TCTCGGTTTGGCAGTTCG 
232 - 240 
30. mCrCIR06A08 
F: TTTTTGTTATGGTGTTCGTTGTT 
R: TGGTATTATTTTGTCATTCATTTG 
124 - 148 
31. mCrCIR06A12 
F: CCCAACAAACTCAAACTTC 
R: TTTTTATTTCGGTCTCCTT 
84 - 104 
32. mCrCIR06B04 
F: TTTGTCATCCCTACCTCC 
R: CTTTCGGTTTCATTTCAT 
119 - 120 
33. P73 
F1-CCATTGCTTACGAAGTTG 
R2-TTGACTTGCAGCAATCAG 
364 - 384 
34. P94 
F-GATTGAATCTTCTGTAGCTC 
R-ATCATCATCTAGTGTCACTG 
430 - 537 
35. P620 
F-GACTGGATTAGAGTTCTCTG 
R-ATGGATGTGTTATCTCACTC 
410 - 422 
36. P1223 
F-ATCTGTGTAAGGACTGAA 
R-CCTCTATTAATGTGCCTG 
333 - 399 
37. P1826 
F-GGACACTGTGACGGCTAA 
R-AGCTACCAAGACACCACC 
388 - 467 
38. CAC23 F:ATCACAATTACTAGCAGCGCC 
R: TTGCCATTGTAGCATGTTGG 
237 - 270 
39. NTCP9 F: CTT CCA AGC TAA CGA TGC 
R: CTG TCC TAT CCA TTA GAC AAT G 
40. AC01 
TTTGACATCAACATAAAACAAGAAA 
TTTTAAAATCCCTGACCAGA 
135 - 167 
41. AG14 
AAAGGGAAAGCCCTAATCTCA 
CTTCCTCTTGCGGAGTGTTC 
119 - 163 
42. ATC09 
TTCCTTATGTAATTGCTCTTTG 
TGTGAGTGTTTGTGCGTGTG 
169 - 202 
56 
Số 
mồi 
Tên mồi Trình tự mồi (5′ - 3′) 
Kích thước 
dự kiến 
(bp) 
43. CAG01 
AACACTCGCACCAAATCCTC 
TAAATGGCAACCCCAGCTTTG 
114 - 132 
44. CAT01 
GCTTTCGATCCCTCCACATA 
GATCCCTACAATCCTTGGTCC 
122 - 164 
45. CCT01 
TCAACACCTCGAACAGAAGG 
CCCACATGCTAGCACAAAGA 
134 - 164 
46. CT02 
ACGGTGCGTTTTGAGGTAAG 
TGACTGTTGGATTTGGGATG 
102 - 144 
47. CT19 
CGCCAAGCTTACCACTCACTAC 
GCCACGATTTGTAGGGGATAG 
117 - 171 
48. CT21 
CGAACTCATTAAAAGCCGAAAC 
CAACAACCACCACTCTCACG 
139 - 163 
49. CTT01 
TCAGACATTGAGTTGCTCG 
TAACCACTTAGGCTTCGGCA 
124 - 159 
50. GT03 
GCCTTCTTGATTTACCGGAC 
TGCTCCGAACTTCATCATTG 
149 - 197 
Bảng 2.3. Trình tự mồi ITS, matK và rbcL 
Tên cặp 
mồi 
Trình tự (5' - 3') 
Kích 
thước 
dự kiến 
(bp) 
Nhiệt 
độ 
gắn 
mồi 
Nguồn 
ITS (F) AGGAGAAGTCGTAACAAGGTTTCC 
850 bp 53 
Sun et 
al., 1994 
[87] ITS (R) GATATGCTTAAACTCAGCGGGTC 
matK (F) TAATTTACRATCAATTCATTCAATATTTCC 
850 bp 56 
Kyndt et 
al., 2005 
[88] matK (R) GARGAYCCRCTRTRATAATGAGAAAGATTT 
rbcL (F) ATGTCACCA CAAACAGAGACTAA 
500 bp 57 
CBOL, 
2009 
[89] 
rbcL (R) TTCGGCACAAAATACGAAACGATCTCTC 
57 
2.2. Nội dung nghiên cứu 
- Điều tra, thu thập và xây dựng bản đồ phân bố quần thể Xáo tam phân 
- Đánh giá đa dạng di truyền của quần thể Xáo tam phân và một số loài 
thuộc chi Paramignya bằng chỉ thị SSR 
- Nghiên cứu xây dựng chỉ thị phân tử DNA barcodes dùng trong nhận dạng 
loài Xáo tam phân 
- Xây dựng quy trình nhân giống in vitro phục vụ bảo tồn loài Xáo tam phân 
2.3. Phương pháp nghiên cứu 
2.3.1. Phương pháp điều tra, thu thập mẫu và xây dựng bản đồ phân bố 
Viêc ̣điều tra, thu mẫu tiến hành theo phương pháp nghiên cứu thực vật của 
Klein và Klein (1970), và Nguyễn Nghĩa Thìn (2007) [90, 91]. Khảo sát các khu 
vực tại Khánh Hòa và Lâm Đồng đã phát hiện quần thể ban đầu và những khu vực 
lân cận nhằm xác định thêm các khu phân bố khác của loài nghiên cứu. 
Mỗi nhóm cá thể (quần thể) các mẫu thuộc chi Paramignya đại diện cho các 
quần thể phân bố tự nhiên ở các vùng Ninh Vân, Ninh Hòa, Diên Khánh (tỉnh 
Khánh Hòa) và Di Linh, Cát Tiên, Đơn Dương (tỉnh Lâm Đồng), các mẫu được thu 
trực tiếp tại nơi sống của chúng từ tháng 11 năm 2017 đến hết tháng 10 năm 2019. 
Vị trí địa lý của các địa điểm lấy mẫu được ghi lại trong Bảng 3.3. Các khu vực 
được chọn để lấy mẫu cách xa nhau với khoảng cách ít nhất là 5 km. Các cách tiếp 
cận thu thập được được xác định dựa trên các khóa phân loại truyền thống. Các lá 
tươi được chụp ảnh tại nơi thu hái và bảo quản trong túi kín bằng silica-gel ở điều 
kiện bình thường trong vòng 2 ngày cho đến khi tách chiết DNA. 
Dựa vào điều kiện nơi phân bố đã phát hiện quần thể ban đầu, xác định các 
khu vực có cùng đai độ cao và kiểu rừng trong vòng bán kính 50 km. Với các khu 
vực xác định được, tiến hành lập các tuyến điều tra trên bản đồ (trên bản đồ phóng 
lớn thành bản đồ địa hình tỷ lệ 1:5.000) đi qua các đai độ cao cách nhau 30 m và 
bao phủ toàn bộ khu vực điều tra đã xác định. 
Khảo sát được thực hiện theo tuyến đã thiết kế với độ rộng quan sát của 
tuyến là 20 m nhằm đánh dấu để thu thập ̣mẫu vật, ghi nhận thêm đặc tính sinh 
trưởng, phát triển và đặc điểm cũng như mùa ra hoa, quả của đối tượng nghiên 
cứu. Tại những khu vực phát hiện có sự phân bố của loài nghiên cứu, tiến hành 
ghi nhận các đặc điểm về điều kiện sinh cảnh thông qua mô tả, hình ảnh và dữ liệu 
58 
tọa độ từ thiết bị định vị GPS Map 60 CSX. Đánh dấu vị trí khu vực phát hiện có 
sự phân bố của loài nghiên cứu trên bản đồ tuyến. Bản đồ được lập trong phần 
mềm ArcGIS 10.30, sử dụng các công cụ phân nhóm và hiển thị mầu tích hợp sẵn 
trong phần mềm. 
2.3.2. Phương pháp mô tả hình thái 
Các mẫu Xáo tam phân Khánh Hòa được xác định tên khoa học bằng phương 
pháp so sánh hình thái, đối chiếu với khóa phân loại trong các bộ thực vật chí 
(Phạm Hoàng Hộ, 1999; Nguyễn Nghĩa Thìn, 2007). Việc định tên loài được so 
sánh với hình ảnh mẫu vật có sẵn tại GBIF (Global Biodiversity Information 
Facility), cơ sở dữ liệu danh sách các thực vật (The Plant List) và cuốn “Cây cỏ 
Việt Nam” của Phạm Hoàng Hộ [5, 91]. 
2.3.3. Tách chiết và tinh sạch DNA tổng số 
DNA tổng số được tách chiết theo phương pháp của Doyle (1990) có cải tiến. 
Mẫu mô sau khi nghiền sẽ được phá thành tế bào trong dung dịch đệm chiết CTAB 
(1,4 M NaCl; 0,1 M Tris-HCl pH 8; 20 mM EDTA pH 8; 2% CTAB) trong 2h ở 65°C. 
Dung dịch sau đó được ly tâm loại cặn tế bào và chiết với chloroform:isoamyl alcohol 
(24:1). Dung dịch chiết được xử lý với RNase và tủa DNA sử dụng 2 lần thể tích 
EtOH 100%; 0,3 M CH3COONa trong 3h ở -20°C. Kết tủa DNA được rửa bằng 
EtOH 70%, làm khô và hòa tan trong nước khử ion vô trùng. Sau đó, DNA được tinh 
sạch bằng cách sử dụng Kit tinh sạch DNA của Thermo Scientific GeneJET (# 
K0722). Chất lượng DNA được kiểm tra bằng phương pháp điện di trong agarose 
1% và định lượng bằng Nanodrop (Eppendorf, USA). DNA tổng số đã tinh sạch 
được giữ ở -20ºC cho các nghiên cứu tiếp theo [92]. 
2.3.4. PCR nhân các vùng microsatellite bằng các chỉ thị SSR 
Sản phẩm PCR với 50 cặp mồi SSR đặc trưng cho họ cam (Rutaceae) (bảng 
2.2). Nhiệt độ và thời gian gắn mồi của các cặp mồi được hiệu chỉnh bằng thực 
nghiệm để thu được các băng đặc hiệu và ổn định. Sản phẩm PCR sau đó được chạy 
điện di trên gel agarose nồng độ 0,8%. Phản ứng được thực hiện trên máy PCR 
model 9700 (GeneAmp PCR System 9700, Mỹ). Kích thước của các allen được 
khuếch đại trong phản ứng PCR với cặp mồi SSR được xác định dựa vào thang 
chuẩn DNA. 
59 
2.3.5. PCR nhân các vùng chỉ thị phân tử 
DNA tổng số sau tách chiết được sử dụng làm khuôn cho PCR với các cặp 
mồi ITS, matK và rbcL (Bảng 2.2). Thành phần phản ứng PCR được tiến hành với 
thể tích 20 µL gồm: 1X DreamTaq Buffer; 1 mM dNTPs; 2,5 μM mỗi mồi; 0,75 
unit DreamTaq DNA polymerase; 50 ng DNA tổng số. PCR được thực hiện với chu 
trình nhiệt như sau: 94˚C/ 4 phút; (94˚C/ 30 giây; 53 - 57˚C/ 30 giây; 72˚C/ 45 giây 
x 30 chu kì, 72˚C/ 7 phút, sau đó giữ ở 15˚C. Nhiệt độ và thời gian gắn mồi được 
hiệu chỉnh bằng thực nghiệm để thu được sản phẩm PCR đặc hiệu. Sản phẩm PCR 
được điện di kiểm tra trên gel agarose 0,8%. Phản ứng được thực hiện trên máy 
PCR model 9700 (GeneAmp PCR System 9700, Mỹ). 
Các chỉ thị phân tử ITS, matK, rbcL sau khi nhân PCR bằng các cặp mồi 
tương ứng (Bảng 2.2; 2.3) được kiểm tra bằng cách chạy điện di trên gel agarose 
0,8% với thang chuẩn DNA 1 Kb (Thermo Scientific™). Các sản phẩm PCR sau đó 
được tinh sạch bằng cách sử dụng bộ Kit QIAquick PCR (Qiagen, Cat. No. 28104) 
theo mô tả của nhà sản xuất. 
2.3.6. Giải trình tự và đăng ký trình tự 
Sản phẩm PCR tinh sạch được gửi đi giải trình tự trực tiếp theo cả hai chiều 
bởi công ty Macrogen, Hàn Quốc. Trình tự DNA sau khi giải trình tự được hiệu 
chỉnh và loại bỏ các tín hiệu nhiễu với sự trợ giúp của phần mềm ChromasPro2.1.6 
(Technelysium, 2013) được so sánh với các trình tự đã có trên Genbank (sử dụng 
công cụ Megablast của NCBI http:www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST). Các trình tự 
phân tích được căn (align) bằng phần mềm Bioedit v7.0.5.2 [93]. Các vùng nhiễu 
không có khả năng sắp xếp bị loại bỏ trước khi phân tích. Các mẫu bị nhiễu với các 
đỉnh không rõ nét được tiến hành PCR và đọc lại cho tới khi thu được tín hiệu rõ 
nét. Các trình tự gen (ITS, matK, rbcL) các loài thuộc chi Paramignya được công 
bố trên ngân hàng Genbank bằng công cụ BankIt của NCBI được sử dụng