Tóm tắt Luận án Đánh giá đa dạng di truyền và phát triển kỹ thuật chẩn đoán virus lúa lùn sọc đen phương Nam ở Việt Nam

u, 49 hình. Luận án gồm 5 phần: Mở đầu 4 trang; Tổng quan tài 
liệu 34 trang; Vật liệu, nội dung và phƣơng pháp nghiên cứu 22 
trang; Kết quả nghiên cứu và thảo luận 71 trang; Kết luận và kiến 
nghị 02 trang. Đã tham khảo 125 tài liệu bao gồm 23 tài liệu tiếng 
Việt và 102 tài liệu tiếng Anh. 
5 
Chƣơng 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU 
1.1. CÁC VIRUS HẠI LÚA 
Virus hại lúa đã có từ lâu và đƣợc xem là bệnh hại nguy hiểm 
hàng đầu ở cây lúa trên thế giới nói chung và Việt Nam nói riêng. 
Tuy nhiên phải đến năm 1895 các nhà khoa học Nhật Bản mới 
nghiên cứu và lần đầu tiên virus gây bệnh lúa vàng lùn (Rice dwarf 
virus-RDV) đƣợc phát hiện. Tiếp theo, virus lúa lùn sọc đen 
(RBSDV) đƣợc phát hiện và rất nhiều virus hại lúa khác đƣợc xác 
định nhƣ virus gây bệnh Tungro (Tungro baccili-form virus-RTBV 
và Tungro spherical virus-RTSV), vàng lá di động (RTYV- Rice 
transitory yellow-ing virus), lá khảm đốm chết (RNMV-Rice necrosis 
mosaic virus), lùn xoắn lá (RRSV-Rice ragged stunt virus), vàng lùn 
(RGSV- Rice grassy stunt virus), trắng lá lúa (RHBV-Rice hoja 
blanca virus) Cho tới nay, đã có 16 loại virus gây hại trên lúa đƣợc 
phát hiện. 
Các virus phát hiện (vàng lùn, lùn xoắn lá, tungro, lùn sọc đen 
phƣơng Nam...) ở Việt Nam đều có tầm quan trọng kinh tế và lan 
truyền qua rầy. Việc chẩn đoán các virus trên lúa thƣờng khó do triệu 
chứng có thể bị nhầm lẫn do sử dụng thuốc trừ cỏ hoặc các nguyên 
nhân sinh lý. Phát hiện virus trên rầy buộc phải sử dụng các kỹ thuật 
chẩn đoán nhƣ E IS hoặc PCR. 
1.2. ĐẶC ĐIỂM CÁC FIJIVIRUS THUỘC HỌ REOVIRIDAE 
Các virus thuộc họ Reoviridae đƣợc đặc trƣng bởi bộ gen RN 
sợi kép (dsRN ), phân đoạn, bao gồm 9 đến 12 phân tử RNA sợi kép 
mạch thẳng. Chi Fijivirus có hệ gen phân đoạn gồm 10 phân tử RNA 
sợi kép, mạch thẳng (S1-S10). Các phân tử RN này có kích thƣớc 
dao động từ 1,4 kb đến 4,5 kb. 
6 
1.3. VIRUS LÚA LÙN SỌC ĐEN PHƢƠNG N M 
Bệnh lúa lùn sọc đen phƣơng nam lần đầu tiên xuất hiện ở tỉnh 
Quảng Đông, Trung Quốc (2001) và đƣợc xem là một biến chủng 
của RBSDV. Cây lúa bị nhiễm SRBSDV sinh trƣởng còi cọc, lá xanh 
đậm, xoăn trắng ở lá, rách mép lá và đặc biệt có những u sáp màu 
trắng hoặc đen chạy dọc các đƣờng gân ở mặt sau lá, bẹ lá hoặc các 
đốt thân. Rầy lƣng trắng và một tỷ lệ nhỏ rầy nâu nhỏ là vector 
truyền SRBSDV. Hệ gen của SRBSDV có chiều dài 29124 bp, gồm 
10 phân đoạn RNA sợi đôi, có kích thƣớc từ 1,8 đến 4,5 kb. Trong 
đó, phân đoạn S7 dài 2176 bp, chứa hai ORF mã hóa hai protein 
(40,5 kDa và 36,4 kDa); phân đoạn S9 dài 1899 bp, chứa hai ORF 
mã hóa hai protein (39,9 kDa và 24,2 kDa); phân đoạn S10 dài 1797 
bp, chứa một ORF mã hóa protein (62.6 kDa) hình thành lớp vỏ 
ngoài của phân tử virus. SRBSDV có sự tƣơng đồng về triệu chứng, 
phổ ký chủ, hình thái học phân tử virus, huyết thanh học với các 
thành viên khác trong chi Fijivius, đặc biệt là RBSDV. Hai kỹ thuật 
chẩn đoán SRBSDV phổ biến nhất là thử nghiệm miễn dịch liên kết 
men (E IS ) và phản ứng trùng hợp chuỗi (RT-PCR). 
1.4. VIRUS LÚA LÙN SỌC ĐEN PHƢƠNG N M Ở VIỆT NAM 
SRBSDV lần đầu tiên xuất hiện vào tháng 8 2009, tại Nghệ An, 
sau đó lan ra tại 20 tỉnh miền Bắc và Bắc Trung Bộ với diện tích bị 
hại tới 42.000 ha. Do tính chất nghiêm trọng của SRBSDV, ngoài 
việc xác định tác nhân gây bệnh, nhiều nghiên cứu về bản chất hệ 
gen và đa dạng di truyền của SRBSDV ở Việt Nam đƣợc nghiên cứu 
trong thời gian qua. Năm 2010 và 2011, bệnh có xu hƣớng mở rộng 
ra nhiều địa bàn trồng lúa khác nhau và có tới 34 tỉnh có diện tích 
trồng lúa bị bệnh. 
7 
Chƣơng 2. VẬT LIỆU, NỘI DUNG VÀ PHƢƠNG PHÁP 
NGHIÊN CỨU 
2.1. VẬT LIỆU 
2.1.1. Vật liệu thực vật 
13 mẫu lúa nhiễm bệnh lúa lùn sọc đen đặc trƣng đƣợc xác định 
bằng RT-PCR và ELISA và các mẫu lúa nghi nhiễm bệnh thu thập 
vào vụ xuân và vụ mùa các năm 2009-2012 tại các tỉnh: Thái Bình, 
Nam Định, Ninh Bình, Sơn a, ào Cai, Nghệ An, Quảng Trị, Huế 
do phòng Bệnh học phân tử - Viện di truyền Nông nghiệp cung cấp. 
Các mẫu rầy khỏe, rầy nhiễm SRBSDV; các cây lúa nhiễm 
SRBSDV, RRSV lây nhiễm nhân tạo đƣợc cung cấp bởi Trung tâm 
bệnh cây nhiệt đới, Học viện Nông nghiệp Việt Nam. 
Bảng 2.1. Mẫu lúa nhiễm SRBSDV dùng trong nghiên cứu 
STT Tên mẫu Giống lúa Thời vụ 
Địa điểm 
thu mẫu 
1 SonLa-1 Xén cù Vụ xuân 2010 Sơn a 
2 SonLa-2 Xén cù Vụ xuân 2010 Sơn a 
3 LaoCai -1 Nhị ƣu 838 Vụ xuân 2009 Lào Cai 
4 NinhBinh-1 BT7 Vụ mùa 2009 Ninh Bình 
5 NinhBinh-2 BT7 Vụ mùa 2010 Ninh Bình 
6 ThaiBinh-1 BT7 Vụ mùa 2009 Thái Bình 
7 ThaiBinh-2 BT7 Vụ mùa 2010 Thái Bình 
8 NamDinh-1 BT7 Vụ mùa 2009 Nam Định 
9 NgheAn-1 Xi 23 Vụ mùa 2009 Nghệ An 
10 QuangTri-1 Nhị ƣu 986 Vụ xuân 2010 Quảng Trị 
11 QuangTri-2 Xi 23 Vụ xuân 2010 Quảng Trị 
12 Hue-1 Nhị ƣu 986 Vụ xuân 2010 Huế 
13 Hue-2 Nhị ƣu 986 Vụ xuân 2010 Huế 
2.1.2. Chủng vi sinh vật 
Chủng vi khuẩn E. coli DH5α mua của hãng Invitrogen, E.coli 
8 
Rosetta (DE3) mua của hãng Novogen. 
2.1.3. Vector và oligonucleotide 
Vector pET28a/P10 do phòng Bệnh học phân tử, Viện di truyền 
Nông nghiệp cung cấp; pET32a mua của hãng Novogen; pGEM-T 
mạch thẳng có đầu T mua của hãng Promega. 
Các oligonucleotide sử dụng trong nghiên cứu đặt mua từ hãng 
Invitrogen và Sigma. 
2.2. NỘI DUNG NGHIÊN CỨU 
- Đánh giá đa dạng di truyền SRBSDV ở Việt Nam. 
- Phát triển kỹ thuật chẩn đoán SRBSDV ở Việt Nam bằng RT-PCR. 
- Phát triển kỹ thuật chẩn đoán SRBSDV ở Việt Nam bằng ELISA. 
2.3. PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 
- Tách chiết, định lƣợng DNA/RNA 
- Định lƣợng protein bằng bằng phƣơng pháp Bradford. 
- Thiết kế mồi dựa trên trình tự đƣợc công bố trên GenBank 
(EU784841.1, EU784843.1, EU784840). 
- Nhân bản DNA/RNA bằng PCR và RT-PCR. 
- Nhân dòng và giải trình tự DNA. 
- Phát triển kỹ thuật chẩn đoán SRBSDV bằng RT-PCR. 
- Xác định vùng gen mã hóa polypeptide giàu tính kháng nguyên 
bằng phần mềm Immune Epitope Database Analysis Resource. 
- Thiết kế vector biểu hiện gen đích trong tế bào vi khuẩn. 
- Tạo kháng thể đa dòng kháng SRBSDV theo phƣơng pháp 
Amero (1994) và Regenmortel (1993). 
- Phƣơng pháp kháng nguyên kháng thể: Kỹ thuật Western blot 
của Sambrook & Rusel (2001); kỹ thuật Dot-blot của Wang 
(2012); kỹ thuật PTA-ELISA của Mowat & Dawson (1987). 
9 
Chƣơng 3. KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN 
3.1. NGHIÊN CỨU Đ DẠNG DI TRUYỀN SRBSDV Ở VIỆT NAM 
Mục tiêu của phần nghiên cứu này là đánh giá đặc điểm phân tử 
và đa dạng di truyền SRBSDV của Việt Nam dựa trên trình tự 3 phân 
đoạn S7, S9 và S10 của các mẫu virus thu thập từ các vùng sinh thái 
trồng lúa Việt Nam. 
Hình 3.2. Tinh sạch phân đoạn S10, S9 và S7 
Ghi chú: Giếng M: thang chuẩn DNA 1 kb; giếng 1: hệ gen SRBSDV; giếng 
2: phân đoạn S10; giếng 3: phân đoạn S9; giếng 4: phân đoạn S7. 
Hệ gen của 13 mẫu SRBSDV đại diện cho các vùng sinh thái 
trồng lúa đƣợc tách chiết và điện di trên gel agarose. Các băng RN 
tƣơng ứng với các phân đoạn S7, S9 và S10 đƣợc tinh sạch từ gel 
agarose. Kết quả điện di cho thấy sản phẩm tinh sạch có kích thƣớc 
tƣơng ứng với kích thƣớc lý thuyết của các phân đoạn (Hình 3.2). 
Phân đoạn S7, S9, S10 đƣợc dòng hóa vào vector nhân dòng 
pGEM-T, giải trình tự và phân tích đa dạng di truyền bằng phần mềm 
MEGA5. 
Kết quả giải trình tự cho thấy thấy tất cả các phân đoạn S7, S9 
và S10 của 13 mẫu SRBSDV phân lập tại Việt Nam đều có kích 
thƣớc giống nhau, lần lƣợt là 2176 bp, 1849 bp và 1798 bp. Mức độ 
tƣơng đồng nucleotide của các mẫu virus Việt Nam với nhau dao 
động từ 97,6-100% và với các chủng Trung Quốc dao động từ 97,3 - 
99,8%. Kết quả so sánh trình tự axit amin trên các khung đọc mở cho 
10 
thấy chủng SRBSDV Việt Nam có quan hệ di truyền gần gũi hơn với 
SRBSDV Quảng Đông (Hình 3.10, Hình 3.11, Hình 3.13). 
Hình 3.10. So sánh trình tự amino acid của protein P9.1 
Hình 3.11. So sánh trình tự amino acid của protein P9.2 
Hình 3.13. So sánh trình tự amino acid của protein P10 
11 
Cây phả hệ dựa trên trình tự nucleotide của SRBSDV cho thấy 
các mẫu Việt Nam và Trung Quốc xuất hiện xen kẽ trên cây phả hệ, 
chứng tỏ chúng là một quần thể virus gây hại trong một vùng địa lý ở 
cùng một thời điểm, chƣa hình thành chủng mới. 
 Hình 3.9. Xây dựng cây phả hệ của SRBSDV dựa trên trình tự 
phân đoạn S7 
Ghi chú: Các số trên mỗi nốt là giá trị boostrap tính theo %). Mẫu Việt 
Nam được chỉ rõ bằng chấm đen. Thanh bar là số thay thế nucleotide. 
Hình 3.12. Xây dựng cây phả hệ của SRBSDV dựa trên trình tự 
phân đoạn S9 
Ghi chú: Các số trên mỗi nốt là giá trị boostrap tính theo % (1000 lần lặp). 
Mẫu Việt Nam được chỉ rõ bằng chấm đen. 
 NinhBinh-2
 JQ692578.1-VN
 JN388912.1-TQ
 ThaiBinh-2
 NamDinh
 Hue-1
 EU784841.1-QuangDong-TQ
 FN563995.1-HaiNam-TQ
 HQ731498.1-ThuaThienHue
 HM998850.1-TQ
 Hue-2
 HM585273.1-TQ
 JQ034354.1-TQ
 SonLa-1
 SonLa-2
 NgheAn
 NinhBinh-1
 LaoCai
 ThaiBinh-1
 QuangTri-1
 QuangTri-2100
100
80
40
80
100
80
50
100
60
20
2
 HQ731500-VN
 QuangTri-1
 EU523359-HaiNam-TQ
 LaoCai
 ThaiBinh-2
 HM585271-TQ
 JQ692580.1-ThuaThienHue
 NinhBinh-2
 ThaiBinh-1
 SonLa-2
 HM998852-TQ
 JQ773428-TQ
 QuangTri-2
 Hue-1
 Hue-2
 SonLa-1
 NgheAn
 JQ034356-TQ
 EU784843-QuangDong-TQ
 NamDinh
 NinhBinh-1
100
100
100
100
100
77
55
66
33
33
44
77
44
22
22
33
11
22
12 
Hình 3.14. Xây dựng cây phả hệ của SRBSDV dựa trên trình tự 
phân đoạn S10 
Ghi chú: Các số trên mỗi nốt là giá trị boostrap tính theo %). Mẫu Việt 
Nam được chỉ rõ bằng chấm đen. Thanh bar là số thay thế nucleotide 
3.2. NGHIÊN CỨU PHÁT TRIỂN KỸ THUẬT CHẨN ĐOÁN SRBSDV 
BẰNG RT-PCR 
Quy trình chẩn đoán đặc hiệu SRBSDV của Việt Nam bằng kỹ 
thuật RT-PCR đƣợc tối ƣu các yếu tố ảnh hƣởng nhƣ: vị trí lấy mẫu, 
phƣơng pháp chiết RNA, trình tự mồi, loại phản ứng RT-PCR, điều 
kiện phản ứng RT-PCR. 
Phản ứng RT-PCR tối ƣu cho quy trình xét nghiệm SRBSDV có 
thành phần bao gồm 8,6 µl ddH2O, 0,6 µl mỗi loại mồi (Fw: 
CACCCCACATCGCGTCATCT, Rv: CCCATTTGAGCAGGAAC 
TTCAC), 0,5 µl RN khuôn, 1,5 µl đệm 10X, 1,5 µl dNTP 2 mM, 
0,2 µl Taq DNA polymerase 5 U/µl; 0,75 µl Reverse transcriptase 4 
U/µl, 0,75 µl Ribolock Rnase và chu trình nhiệt là: 42oC - 10 phút, 
94
o
C - 5 phút, (94
o
C - 30 giây, 56
o
C - 20 giây, 72
o
C - 1,5 phút) x 35 
chu kỳ, 72oC - 7 phút, bảo quản ở 4oC. 
 ThaiBinh-2
 GQ472845-TQ
 SonLa-1
 LaoCai
 NinhBinh-1
 NinhBinh-2
 HM585270-TQ
 JQ692581.1-ThuaThienHue
 EU784840-QuangDong-TQ
 JQ034357-TQ
 NamDinh
 HQ731501-VN
 EU523360-HaiNam-TQ
 NgheAn
 SonLa-2
 HQ394212-TQ
 ThaiBinh-1
 QuangTri-1
 Hue-1
 QuangTri-2
 Hue-2
100
100
71
100
100
100
100
57
85
100
28
42
57
5
13 
Tiến hành thử nghiệm quy trình đã tối ƣu đƣợc đối với 192 mẫu 
lúa gồm 102 mẫu khô và 90 mẫu tƣơi (Bảng 3.6). 
Bảng 3.6. Thử nghiệm quy trình chẩn đoán SRBSDV bằng RT-PCR 
Loại mẫu 
Dạng bảo 
quản Tình trạng 
nhiễm 
SRBSDV 
Kết quả chẩn đoán 
Tƣơi Khô 
Mồi 
Actin 
Mồi đặc 
hiệu 
Tỉ lệ phát 
hiện bệnh 
Lúa sạch bệnh 10 0 Không 10/10 0/10 0 % 
Lúa nhiễm RRSV 0 5 Không 5/5 0/5 0 % 
Lúa thu thập từ vùng 
dịch, đã giải trình tự gen 
0 13 Nhiễm 13/13 13/13 100 % 
Lúa lây nhiễm nhân tạo 
biểu hiện bệnh 
64 0 Nhiễm 64/64 64/64 100 % 
Lúa lây nhiễm nhân tạo 
chƣa biểu hiện bệnh 
10 0 Nghi nhiễm 10/10 2/10 20 % 
Lúa thu thập từ các 
vùng dịch 
6 84 Nghi nhiễm 90/90 79/90 88 % 
Kết quả thử nghiệm cho thấy quy trình đƣợc xây dựng phát hiện 
chính xác 100% sự có mặt của SRBSDV trong mẫu bệnh, bao gồm 
cả mẫu tƣơi và mẫu khô, có thể phát hiện sự có mặt của SRBSDV ở 
giai đoạn cây chƣa biểu hiện bệnh. 
3.3. PHÁT TRIỂN KỸ THUẬT CHẨN ĐOÁN SRBSDV BẰNG ELISA 
Mục tiêu của nội dung nghiên cứu này là tạo kháng thể đặc hiệu 
virus và phát triển kỹ thuật chẩn đoán SRBSDV Việt Nam bằng kỹ 
thuật E IS . Các định hƣớng tạo kháng thể đa dòng nhƣ: (1) sử 
dụng hạt virus tinh chiết từ cây nhiễm bệnh hoặc (2) sử dụng protein 
vỏ (dạng đầy đủ hoặc một đoạn peptide) tái tổ hợp. 
3.3.1. Tạo kháng thể đa dòng kháng SRBSDV bằng hạt virus 
tinh chiết 
Hạt virus đƣợc tinh chiết từ mẫu lúa lây nhiễm nhân tạo 
SRBSDV để gây đáp ứng miễn dịch trên thỏ. Kháng thể IgG tinh 
sạch đƣợc kiểm tra bằng PTA-ELISA. Kết quả thu đƣợc cho thấy 
14 
kháng thể IgG tinh sạch có hiệu giá là 1/200 (Hình 3.30) và phát hiện 
chính xác sự có mặt của SRBSDV trong mẫu cây bệnh (Hình 3.31). 
Hình 3.30. Xác định hiệu giá kháng thể IgG bằng PTA- ELISA 
Ghi chú: Mẫu kháng thể IgG tinh sạch được pha loãng theo tỉ lệ:1/100, 
1/200, 1/500, 1/1000, mẫu dịch chiết cây bệnh (cột màu xanh) và cây khỏe 
(cột màu đỏ). Đồ thị thể hiện ODA405 trung bình 3 lần xét nghiệm. 
Hình 3.31. Xét nghiệm SRBSDV trong mẫu lúa bệnh 
Ghi chú: Mẫu dich chiết cây được pha loãng theo tỷ lệ 1/5; 1/10 và 1/20. 
Kháng thể IgG tinh sạch được pha loãng theo tỉ lệ:1/200, mẫu dịch chiết 
cây bệnh (cột màu xanh) và cây khỏe (cột màu đỏ). Đồ thị thể hiện giá trị 
ODA405 trung bình của 3 lần xét nghiệm. 
3.3.2. Nghiên cứu tạo kháng thể kháng SRBSDV bằng protein 
vỏ tái tổ hợp P10 của SRBSDV 
Chúng tôi tiếp tục nghiên cứu tạo kháng thể đặc hiệu của 
SRBSDV bằng protein vỏ tái tổ hợp sử dụng vector pET28a/P10. 
Protein tái tổ hợp đƣợc biểu hiện trong vi khuẩn E. coli Rossetta 
và tinh sạch bằng cột sắc kí ái lực Ni2+ agarose (Hình 3.33). Protein 
15 
tái tổ hợp tinh sạch đƣợc sử dụng để gây đáp ứng miễn dịch trên 
chuột. Kháng thể IgG đƣợc tinh sạch từ kháng huyết thanh (đã kiểm 
tra đáp ứng miễn dịch) bằng cột sắc ký ái lực Protein A-sepharose 
(Hình 3.35). 
Hình 3.33. Tinh sạch protein P10 bằng cột sắc ký ái lực Ni-NTA 
Ghi chú: (A) Dịch chiết tế bào và các phân đoạn tinh sạch protein được 
điện di trên gel SDS-PAGE 12%. (B). Protein P10 được phát hiện bằng 
kháng thể anti-His-tag pha loãng 1: 5000. MK: thang chuẩn protein; giếng 
1: Dịch chiết tế bào; giếng 2: dịch không gắn cột; giếng 3,4: phân đoạn rửa 
cột; giếng 5-8: các phân đoạn đẩy cột bằng imidazol 250 mM. 
Hình 3.35. Kiểm tra kháng thể IgG tinh sạch 
Ghi chú: (A) Kháng thể tinh sạch qua cột Protein A-Sepharose được điện di 
trên gel SDS-PAGE 12%. Giếng Mk: Thang chuẩn protein; giếng 1: phân 
đoạn rửa giải. (B) Khả năng phát hiện protein P10 của kháng thể IgG tinh 
sạch pha loãng 1: 2000; Giếng Mk: Thang chuẩn Protein; Giếng 1: Protein 
P10 tinh sạch; Giếng 2: Dịch chiết vi khuẩn mang pET28a (Đối chứng âm); 
Giếng 3: Dịch chiết vi khuẩn mang pET28a/P10. 
16 
Hiệu giá của kháng thể đƣợc xác định kĩ thuật Dot-blot. Kết 
quả thu đƣợc cho thấy kháng thể IgG sau đƣợc tinh sạch phát hiện 
đƣợc protein P10 tái tổ hợp ở nồng độ pha loãng 1:6000 (Hình 3.36A 
cột 2) và SRBSDV trong mẫu dịch chiết lúa và ngô bệnh ở nồng độ 
pha loãng 1:5000 (Hình 3.36B). 
Hình 3.36. Xác định hiệu giá kháng thể tinh sạch bằng Dot-blot 
Ghi chú: (A) Xác định hiệu giá của kháng thể sau tinh sạch được đánh giá 
bằng protein P10 bằng phương pháp Dot-blot; kháng huyết thanh (cột 1) và 
kháng thể sau tinh sạch (cột 2) được pha loãng tỉ lệ 1:1000, 1:2000, 1:3000, 
1:4000, 1:5000 và 1:6000. (B) Độ đặc hiệu của kháng thể tinh sạch được 
đánh giá bằng dịch chiết cây lúa và ngô pha loãng theo tỉ lệ 1:50, 1:100 và 
1:200; mẫu kháng thể tinh sạch được pha loãng tỉ lệ 1:1000 và 1:5000; (+): 
dịch chiết cây nhiễm SRBSDV; (-): dịch chiết cây sạch bệnh. 
Độ đặc hiệu của kháng thể tinh sạch đƣợc tiếp tục xác định bằng 
kĩ thuật ELISA sử dụng mẫu lúa nhiễm SRBSDV và RRSV. Kết quả 
cho thấy kháng thể ở nồng độ pha loãng 1:5000 có khả năng nhận 
biết đặc hiệu SRBSDV trong mẫu lúa nhiễm bệnh lùn sọc đen (Hình 
3.37), ngoài ra, kháng thể sau tinh sạch cũng có khả năng phát hiện 
sớm sự có mặt của SRBSDV trong trong mẫu xét nghiệm có tỉ lệ rầy 
nhiễm SRBSDV cao hơn 50% (bằng phƣơng pháp lây nhiễm nhân 
tạo) (Hình 3.38). 
A B
1: 50
1: 100
1: 200
17 
Hình 3.37. Đánh giá độ đặc hiệu của kháng thể bằng ELISA 
Ghi chú: Mẫu kháng thể IgG tinh sạch được pha loãng tỉ lệ 1/5000 và được 
kiểm tra bằng ELISA với mẫu dịch chiết cây khỏe (cột màu xanh dương), 
cây nhiễm SRBSDV (cột màu đỏ) và cây nhiễm RRSV (cột màu xanh lá) pha 
loãng tỉ lệ 1/10, 1/20, 1/30, 1/40, 1/50 và 1/60. Đồ thị thể hiện giá trị ODA492 
trung bình của 3 lần xét nghiệm. 
Hình 3.38. Đánh giá khả năng phát hiện SRBSDV trong mẫu rầy 
nhiễm SRBSDV bằng ELISA 
Ghi chú: Mẫu kháng thể IgG tinh sạch được pha loãng tỉ lệ 1/5000 và được 
kiểm tra bằng ELISA với mẫu rầy được trộn theo tỉ lệ [số rầy bệnh (B)]:[số 
rầy khỏe (K)] là 0B:5K, 1B:4K, 2B:3K, 3B:2K, 4B: 1K và 5B:0K. Đồ thị thể 
hiện giá trị ODA492 trung bình của 3 lần xét nghiệm. (ĐC) đối chứng âm. 
3.3.3. Nghiên cứu tạo kháng thể đa dòng SRBSDV bằng 
polypeptide giàu tính kháng nguyên 
Mục tiêu của nghiên cứu này là tạo ra kháng thể kháng P10 từ 
polypeptide giàu tính kháng nguyên nhằm tăng tính đặc hiệu cho xét 
18 
nghiệm ELISA 
Đoạn polypeptide giàu tính kháng nguyên trên protein vỏ P10 
đƣợc lựa chọn bằng các phần mềm tin sinh. 
Kết quả phân tích tính ƣa nƣớc, khả năng nằm trên bề mặt và cấu 
trúc không gian của các vùng polypeptide trên P10 bằng phần mềm 
IEDB cho thấy 2 vùng polypeptide ở vị trí 259-425 và vị trí 365-557 
đƣợc dự đoán là giàu tính kháng nguyên (Hình 3.39 và 3.40) và đảm 
bảo tính bảo thủ trên tất cả các mẫu SRBSDV đã phân lập ở Việt 
Nam. 
A 
B 
Hình 3.39. Dự đoán tính kháng nguyên trên protein P10 
Ghi chú: Biểu đồ dự đoán tính ưa nước (A) và khả năng nằm trên bề mặt 
phân tử (B) của các vùng polypeptide trên P10. Vùng màu vàng: vùng 
polypeptide ưa nước và nằm trên bề mặt phân tử; vùng màu xanh: vùng 
polypeptide kỵ nước và không nằm trên phân tử. Threshold: giá trị ngưỡng. 
19 
Hình 3.40. Dự đoán vùng polypeptide có cấu trúc không gian có 
khả năng tạo epitope 
Ghi chú: Các vùng polypeptide có cấu trúc không gian có khả năng tạo 
epitope nằm ở vị trí 1-166 (A), 235-415 (B), 446-557 (C) trên P10. 
2 đoạn nucleotide mã hóa chuỗi axit amin ở vị trí 259-425 và 
365-557 (đặt tên là P10.1 và P10.2) đƣợc phân lập bằng kỹ thuật 
PCR (Hình 3.41, giếng 1 và 3). Sản phẩm PCR sau đó đƣợc nhân 
dòng vào vector pGEM-T. 
Hình 3.41. Nhân bản đoạn gen P10.1 và P10.2 bằng PCR 
Ghi chú: Giếng Mk: Thang chuẩn DNA 1 kb; giếng 1 và 2: PCR với cặp 
mồi S10-P1-Fw/ S10-P1-Rv ; giếng 3 và 4: PCR với cặp mồi S10-P2-Fw/ 
S10-P2-Rv; giếng 1 và 3: khuôn là pGEM/S10; giếng 2 và 4: Đối chứng âm 
(khuôn là H2O) 
Tiếp theo, đoạn gen P10.1 và P10.2 đƣợc cắt và ghép nối vào 
vector biểu hiện pET32a. Vector tái tổ hợp đƣợc kiểm tra bằng PCR 
và cắt bằng enzyme giới hạn. Kết quả thu đƣợc trên hình 3.45 cho 
thấy đoạn gen P10.1 và P10.2 đã đƣợc ghép nối thành công vào 
vector biểu hiện pET32a. Các vector pET32a/P10.1 và pET32a/P10.2 
20 
sau đó đƣợc giải trình tự bằng mồi T7. 
Hình 3.45. Kiểm tra pET32a/P10.1 và pET32a/P10.2 bằng PCR 
và cắt giới hạn 
Ghi chú: (A) PCR pET32a/P10.1; giếng 1 và 2: PCR với cặp mồi S10-P1-
Fw/S10-P1-Rv; giếng 3 và 4: PCR với cặp mồi T7-Fw/T7-Rv; giếng 1 và 3: 
đối chứng âm (khuôn là H2O); giếng 2 và 4: khuôn là plasmid. (B) PCR 
pET32a/P10.2; giếng 1 và 2: PCR với cặp mồi S10-P2-Fw/S10-P2-Rv; 
giếng 3 và 4: PCR với cặp mồi T7-Fw/T7-Rv; giếng 1 và 3: khuôn là 
plasmid; giếng 2 và 4:đối chứng âm (khuôn là H2O).(C) Cắt giới hạn 
plasmid bằng EcoRI/XhoI; giếng 1 và 3: sản phẩm cắt giới hạn; giếng 2 và 
4: plasmid nguyên bản; giếng 1 và 2: pET32a/P10.1; giếng 3 và 4: 
pET32a/ 10.2. iếng : Thang DN chuẩn 1 kb. 
Hình 3.46. Biểu hiện protein tái tổ hợp P10.1 và P10.2 trong tế 
bào E. coli 
Ghi chú: (A) Kết quả điện di dịch chiết tế bào trên SDS-PAGE 12%. (B) 
Polypeptide P10.1 và P10.2 phát hiện bằng kháng thể anti-His-tag (pha 
loãng 1: 5000). Giếng M: thang chuẩn protein; giếng 1: dịch chiết tế bào 
mang pET32a trống; giếng 2: thể tan của dịch chiết tế bào mang 
pET32a/P10.1; giếng 3: thể cặn của dịch chiết tế bào mang pET32a/P10.1; 
giếng 4: thể tan của dịch chiết tế bào mang pET32a/P10.2; giếng 5: thể cặn 
của dịch chiết tế bào mang pET32a/P10.2. 
21 
Polypeptide tái tổ