Tóm tắt Luận án Nghiên cứu thu nhận Coenzyme Q10 từ chủng Agrobacterium tumefaciens tái tổ hợp

dxs. 
3.2.2.1. Tạo cấu trúc biểu hiện mang gen dps và dxs độc lập 
Hai gen dps và dxs được cắt ra khỏi vector tách dòng bằng hai cặp enzyme cắt 
hạn chế tương ứng là SacI/BamHI và BamHI/SalI. Hai gen dps và dxs thu được đã 
được gắn vào vector biểu hiện pCAMBIA1301 đã được mở vòng bằng cặp enzyme 
 1 2 M 
Kb 
- 3,0 
- 2,0 
- 1,2 
- 0,5 
- 0,2 
A 3 4 M 
Kb 
- 3,0 
- 2,0 
- 1,2 
- 0,5 
- 0,2 
B 
 2100 bp 
 1077 bp 
7 
cắt hạn chế tương ứng. Sản phẩm nối ghép được biến nạp vào E. coli DH10b để chọn 
dòng. Kết quả biến nạp cho thấy xuất hiện 11 và 2 khuẩn lạc tương ứng với gen dps 
và dxs trên môi trường LB thạch chứa kanamycin (100 µg/ml). DNA plasmid từ các 
dòng đã được sử dụng để sàng lọc sơ bộ cho các nghiên cứu tiếp theo. Đối với gen 
dps, 8 dòng đã được lựa chọn để kiểm tra sự có mặt của gen đích bằng phản ứng PCR 
sử dụng mồi đặc hiệu (hình 3.4A) và xử lý bằng cặp enzyme cắt hạn chế SacI/BamHI 
(hình 3.4B). Kết quả cho thấy cả 8 dòng đều xuất hiện băng DNA khoảng 1,1 kb 
tương ứng với kích thước gen dps (1077bp) (hình 3.4B). 
Hình 3.4. Phổ điện di sản phẩm PCR (A) và cắt enzyme hạn chế (B) của các dòng được lựa 
chọn đối với gen dps. Đường chạy 1-8 tương ứng với 8 dòng được lựa chọn. ĐC là sản phâm 
PCR từ khuôn plasmid pCAMBIA1301 đối chứng không mang gen. Đường chạy (+) là sản 
phẩm PCR từ khuôn gốc. Đường chay (-) là sản phẩm cắt plasmid đối chứng. M là thang DNA 
chuẩn 100bp (Thermo Scienctific, Mỹ). 
Hình 3.5. Phổ điện di sản phẩm PCR (A) và cắt enzyme hạn chế (B) của các dòng được lựa 
chọn đối với gen dxs. Đường chạy 1-2 tương ứng với 2 dòng được lựa chọn. ĐC là sản phâm 
PCR từ khuôn plasmid pCAMBIA1301 đối chứng không mang gen. M là thang DNA chuẩn 
100bp (Thermo Scienctific, Mỹ). 
 1 2 3 4 5 6 7 8 ĐC M 
Kb 
- 3,0 
- 2,0 
- 1,2 
- 0,5 
- 0,2 
 1 2 3 4 5 6 7 8 + - M 
Kb 
- 3,0 
- 2,0 
- 1,2 
- 0,5 
- 0,2 
A B 
 1 2 ĐC M 
Kb 
- 3,0 
- 2,0 
- 1,2 
- 0,5 
 1 2 M 
Kb 
- 3,0 
- 2,0 
- 1,2 
- 0,5 
A B 
2100 bp  
2100 bp  
1077 bp  
8 
Tương tự đối với gen dxs, 2 dòng đã được lựa chọn để kiểm tra sự có mặt của gen 
đích bằng phản ứng PCR sử dụng mồi đặc hiệu (hình 3.5A) và xử lý bằng cặp 
enzyme BamHI/SalI (hình 3.5B). Kết quả cho thấy cả 2 dòng đều xuất hiện băng 
DNA khoảng 2,1 kb tương ứng với kích thước đọan gen đích dxs (2103 bp) (hình 
3.5B). Các kết quả thu được cho thấy rằng gen dps và dxs đã được tách dòng thành 
công trong vector biểu hiện pCAMBIA1301. Các cấu trúc tái tổ hợp được ký hiệu 
pCAM-dps và pCAM-dxs tương ứng. 
3.2.2.2. Tạo cấu trúc biểu hiện mang đồng thời hai gen dps và dxs 
Để tạo cấu trúc biểu hiện tái tổ hợp chứa đồng thời hai gen dps và dxs, gen dps 
thu được từ vector tách dòng sau khi xử lý bởi cặp enzyme cắt hạn chế SacI và 
BamHI được nối vào vector pCAM-dxs đã được mở vòng bởi SacI/BamHI. Sản phẩm 
nối ghép được biến nạp vào E. coli DH10b và kết quả thu được 10 khuẩn lạc. Kết quả 
PCR từ khuôn plasmid sử dụng cặp mồi DpsF/R cho thấy cả 10 khuẩn lạc đều cho 
sản phẩm có kích thước tương đương với kích thước đoạn gen dps (1077 bp) (hình 
3.6A). Đối chứng sử dụng khuôn pCAM-dxs không thấy xuất hiện sản phẩm, điều đó 
chứng tỏ plasmid từ 10 dòng thu được mang gen dps. Dòng số 9 được lựa chọn để 
kiểm tra plasmid bằng việc cắt với SacI/BamHI, kết quả cho thấy xuất hiện 1 băng 
DNA xấp xỉ 1,2 kb (hình 3.6B). Từ kết quả này có thể khẳng định rằng đã gắn được 
gen dps vào vector tái tổ hợp pCAM-dxs để tạo cấu trúc tái tổ hợp mới chứa đồng 
thời hai gen dps và dxs, được ký hiệu pCAM-dps-dxs. 
Hình 3.6. Phổ điện di sản phẩm PCR từ khuôn plasmid của 10 dòng sử dụng cặp mồi DpsF/R 
(A) và sản phẩm cắt enzyme hạn chế (B). Đường chạy 1-10, sản phẩm PCR từ khuôn plasmid 
của 10 dòng tương ứng; mẫu đối chứng sử dụng khuôn pCAM-dxs (ĐC); RE/9, dòng số 9 được 
xử lý bởi SacI/BamHI thang DNA chuẩn 100 bp (M1) và 1kb (M2). 
 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 ĐC M1 
Kb 
- 3,0 
- 2,0 
- 1,2 
- 0,5 
 RE/9 M2 
Kb 
- 3,0 
- 2,0 
- 1,0 
- 0,5 
1077 bp  
1077 bp  
A B 
9 
3.2.2.3. Tạo chủng A. tumefaciens tái tổ hợp mang cấu trúc pCAM-dps-dxs 
Các cấu trúc tái tổ hợp pCAM-dps, pCAM-dxs, pCAM-dps-dxs được biến nạp 
vào tế bào A. tumefaciens EHA 105 khả biến bằng phương pháp xung điện. Các dòng 
tái tổ hợp được chọn lọc trên môi trường chứa kanamycin (100µg/ml). Tiến hành xác 
định khả năng sinh tổng hợp CoQ10 của các chủng tái tổ hợp pCAM-dps, pCAM-
dxs, pCAM-dps-dxs, và chủng đối chứng pCAM (hình 3.7). Kết quả cho thấy chủng 
tái tổ hợp chứa đơn gen pCAM-dps và pCAM-dxs có khả năng sinh tổng hợp CoQ10 
tăng lên 1,34 và 1,38 lần so với đối chứng. Khi kết hợp cả hai gen dps và dxs tạo 
chủng pCAM-dps-dxs đã làm tăng khả năng tổng hợp CoQ10 của A. tumefaciens lên 
1,80 lần so với đối chứng. Do đó các dòng A. tumefaciens mang cấu trúc pCAM-dps-
dxs được lựa chọn cho nghiên cứu tiếp theo. 
Hình 3.7. Khả năng sinh tổng hợp CoQ10 của các chủng A. tumefaciens tái tổ hợp. Chủng tái tổ 
hợp chứa vector tái tổ hợp mang đơn gen pCAM-pds và pCAM-dxs và đồng thời hai gen pCAM-
dps-dxs. Chủng đối chứng mang vector pCAMBIA1301. 
Kết quả khảo sát khả năng sinh tổng hợp CoQ10 của 28 dòng A. tumefaciens 
pCAM-dps-dxs tái tổ hợp cho thấy khả năng sinh tổng hợp CoQ10 là khác nhau (hình 
3.8). Trong số 28 dòng có dòng số 12 có khả năng tổng hợp CoQ10 cao nhất so với 
dòng khác (19 mg/l) gấp 2,16 lần so với chủng gốc mang vector pCAM, vì vậy dòng 
số 12 được lựa chọn cho các nghiên cứu tiếp theo. 
Hình 3.8. Khả năng sinh tổng hợp CoQ10 của các dòng A. tumefaciens tái tổ hợp mang cấu trúc 
pCAM-dps-dxs 
0
5
10
15
20
pCAM pCAM-dps pCAM-dxs pCAM-dps-dxs
C
o
Q
1
0
 (
m
g/
l)
0.0
2.0
4.0
6.0
8.0
10.0
12.0
14.0
16.0
18.0
20.0
1 2 3 8 10 11 12 14 15 20 pCAM
C
oQ
10
 (m
g/
L
)
Các dòng tái tổ hợp
10 
Dòng số 12 được kiểm tra cấu trúc pCAM-dps-dxs bằng cách tiến hành tách 
plasmid, thực hiện phản ứng PCR và xử lý bởi enzyme hạn chế. Kết quả PCR từ 
khuôn plasmid sử dụng cặp mồi DpsF/R và DxsF/R cho thấy đều cho sản phẩm có 
kích thước tương đương với kích thước đoạn gen dps (1077 bp) và dxs (2103bp) 
(hình 3.9B, 3.9A). Để kiểm tra plasmid bằng việc cắt với SacI/BamHI, kết quả cho 
thấy xuất hiện 1 băng DNA xấp xỉ 1,2 kb (hình 3.9C). Từ kết quả này có thể khẳng 
định rằng vector tái tổ hợp pCAM-dps-dxs đã được đưa vào thành công trong A. 
tumefaciens. Dòng số 12 được ký hiệu là A. tumefaciens DPXS12. 
 A B C 
Hình 3.9. Phổ điện di sản phẩm PCR khuếch đại gen dps (A, giếng 1) và dxs (B, giếng 2), sản phẩm cắt 
enzyme hạn chế SacI/BamHI (C, giếng 3) từ DNA plasmid của A. tumefaciens DPSX12. M, thang DNA 
chuẩn 100 bp (Thermo Scientific) 
3.3. KHẢO SÁT CÁC YẾU TỐ ẢNH HƢỞNG ĐẾN SINH TỔNG HỢP 
COQ10 TỪ A. TUMEFACIENS TÁI TỔ HỢP 
3.3.1. Ảnh hƣởng của các điều kiện môi trƣờng đến khả năng sinh tổng 
hợp CoQ10 
Khi tiến hành thí nghiệm nghiên cứu ảnh hưởng của nguồn cacbon tới khả năng 
sinh tổng hợp CoQ10 từ A. tumefaciens trên môi trường với các loại đường khác 
nhau. Kết quả thể hiện trên hình 3.10A và 3.10B cho thấy, trong môi trường có chứa 
nguồn cacbon là sucrose cho sinh tổng hợp CoQ10 cao nhất (16 mg/l) và nồng độ 
đường sucrose 5% cho sinh tổng hợp CoQ10 cao nhất. 
Cũng tương tự như thế khi tiến hành thí nghiệm nghiên cứu ảnh hưởng của nguồn 
nitơ tới khả năng sinh tổng hợp CoQ10 từ A. tumefaciens. Kết quả thể hiện trên hình 
3.10C và 3.10D cho thấy, trong môi trường có chứa nguồn nitơ là cao ngô (CSL) cho 
sinh tổng hợp CoQ10 cao nhất (26,68 mg/L) và nồng độ cao ngô 1% cho sinh tổng 
hợp CoQ10 cao nhất. 
Kb 
3,0 - 
2,0 - 
1,0 - 
Kb 
- 3,0 
- 2,0 
- 1,0 
- 0,5 
3,0 - 
2,0 - 
- 
0,5 - 
1077 bp  
1077 bp 
2100bp 
 M 1 M 2 3 M 
11 
3.3.2. Ảnh hƣởng của pH đầu môi trƣờng 
Kết quả hình 3.11A cho thấy, với pH đầu là 8,0 hàm lượng CoQ10 thu được là 
cao nhất đạt 68,8 mg/L, vì vậy pH đầu là 8,0 được lựa chọn cho các nghiên cứu tiếp 
theo. 
3.3.3. Ảnh hƣởng của tỷ lệ giống 
Kết quả hình 3.11B cho thấy, hàm lượng CoQ10 thu được cao nhất đạt khi OD = 
0,8 đạt 108 mg/l cao gấp 1,6 lần so với OD = 0,05. Vì vậy tỷ lệ cấp giống với OD = 
0,8 được lựa chọn cho các nghiên cứu tiếp theo. 
3.3.4. Ảnh hƣởng của nhiệt độ nuôi cấy 
Kết quả hình 3.11C cho thấy, nhiệt độ tối ưu cho sinh tổng hợp CoQ10 của A. 
tumefaciens DPXS12 là 28
o
C. Vì vậy cứu nhiệt độ 28oC được lựa chọn cho các 
nghiên cứu tiếp theo. 
3.3.5. Ảnh hƣởng của thời gian 
Từ kết quả hình 3.11D cho thấy, thời gian lên men càng tăng thì hàm lượng 
CoQ10 được sinh tổng hợp cũng tăng. Tuy nhiên hàm lượng CoQ10 thu được từ 96 
giờ đến 144 giờ tăng không đáng kể, sau 144 giờ hàm lượng CoQ10 chỉ tăng 1,03% 
0
2
4
6
8
10
12
14
16
18
C
o
Q
1
0
 (
m
g
/L
) 
Nguồn cacbon (đƣờng) 
0
2
4
6
8
10
12
14
16
18
20
0.0% 2.5% 5.0% 7.5% 10%
C
o
Q
1
0
 (
m
g
/L
) 
Nồng độ sucrose (w/v) 
0
5
10
15
20
25
30
C
o
Q
1
0
 (
m
g/
L)
Nguồn nitơ 
0
10
20
30
40
50
60
0.5% 1% 2% 3% 4% 5%
C
o
Q
1
0
 (
m
g
/L
) 
Nồng độ CSL (w/v) 
A 
B 
Hình 3.10. Ảnh hưởng của nguồn cacbon (A), nồng độ sucrose (B), nguồn nitơ (C), nồng độ 
CSL(D) đến lên men sinh tổng hợp CoQ10 từ A. tumefaciens tái tổ hợp. 
C 
D 
12 
(tăng 2,57 mg/L) so với 96 giờ lên men. Từ kết quả thu được thời gian 96 giờ được 
lựa chọn để thu nhận CoQ10 trong quá trình lên men. 
Hình 3.11. Ảnh hưởng của pH đầu môi trường (A), OD giống (B), nhiệt độ nuôi cấy (C), thời gian 
(D) đến lên men sinh tổng hợp CoQ10 từ A. tumefaciens tái tổ hợp. 
3.4. TỐI ƢU HÓA ĐIỀU KIỆN LÊN MEN SINH TỔNG HỢP COQ10 TỪ A. 
TUMEFACIENS 
3.4.3. Tối ƣu hóa quá trình sinh tổng hợp CoQ10 từ A. tumefaciens tái tổ hợp 
Dựa trên cơ sở đã khảo sát ảnh hưởng của các yếu tố đến quá trình lên men sinh 
tổng hợp CoQ10 từ A. tumefaciens tái tổ hợp, tiến hành xác định ảnh hưởng đồng thời 
của nồng độ đường sucrose (X1), nồng độ cao ngô (X2), nhiệt độ (X3) . Kết quả được 
thể hiện trên bảng 3.3. 
Phương trình hồi quy biểu diễn hàm lượng CoQ10 mô tả ảnh hưởng của các yếu 
tố độc lập và các mối tương tác giữa chúng được biểu diễn như sau: 
Hàm lượng CoQ10= - 634,73 + 36,11.X1 + 32,92.X2 + 344,62.X3 + 4,2.X1X2 - 
0,32.X1X3 + 3,66.X2X3 – 2,78.X1
2 – 75,27.X2
2
 – 81,98.X3
2 
0
10
20
30
40
50
60
70
80
6.0 6.5 7.0 7.5 8.0
C
o
Q
1
0
 (
m
g
/L
) 
pH 
0
20
40
60
80
100
120
0.05 0.1 0.2 0.4 0.8 1.2 1.6 2.0
C
o
Q
1
0
 (
m
g
/L
) 
OD giống 
0
20
40
60
80
100
120
140
20 25 28 30 37
C
o
Q
1
0
 (
m
g
/L
) 
Nhiệt độ (độ C) 
0
20
40
60
80
100
120
140
0 24 48 72 96 120 144
C
o
Q
1
0
 (
m
g/
l)
Thời gian (giờ) 
B 
D 
A 
C 
13 
Bảng 3.1. Ma trận thực nghiệm Box-Behnken ba yếu tố và hàm lượng CoQ10 thu được 
TN Nồng độ 
sucrose (%) 
Nồng độ cao 
ngô (%) 
Nhiệt độ 
(
o
C) 
Hàm lượng CoQ10 
(mg/l) 
1 2,5 0,5 28 82,885 
2 2,5 1,5 28 78,048 
3 7,5 0,5 28 90,872 
4 7,5 1,5 28 107,285 
5 5,0 0,5 24 93,571 
6 5,0 1,5 24 85,433 
7 5,0 0,5 32 93,571 
8 5,0 1,5 32 109,518 
9 2,5 1,0 24 78,912 
10 7,5 1,0 24 101,791 
11 2,5 1,0 32 95,831 
12 7,5 1,0 32 105,901 
13 5,0 1,0 28 127,177 
14 5,0 1,0 28 124,478 
15 5,0 1,0 28 126,506 
 16 5.0 1.0 28 126,58 
17 5.0 1.0 28 125,35 
Từ kết quả trên dựa vào phương pháp tối ưu hóa tìm được điều kiện lên men tối ưu 
nhất: nồng độ sucrose 5 %, nồng độ bột cao ngô 1 % và nhiệt độ 28oC. Khi đó, hàm 
lượng CoQ10 đạt được 127,18 mg/l. 
3.5. NGHIÊN CỨU QUY TRÌNH TÁCH CHIẾT COENZYME Q10 TỪ CHỦNG 
A. TUMEFACIENS TÁI TỔ HỢP 
3.5.1. Đánh giá các phƣơng pháp phá vỡ tế bào 
Hiệu quả phá vỡ tế bào sẽ ảnh hưởng rất lớn đến hiệu suất tách chiết CoQ10. 
Trong nghiên cứu này màng tế bào A. tumefaciens được phá vỡ bằng bốn phương 
pháp khác nhau bao gồm siêu âm, xử lý bằng axit HCl theo mô tả của Tian, xử lý 
bằng ethanol theo mô tả của Ranadive và xử lý bằng enzyme theo mô tả của Zahiria 
kết hợp với các bước tách chiết. Kết quả được biểu diễn trên hình 3.12. 
Kết quả cho thấy phương pháp xử lý tế bào bằng ethanol cho hiệu quả thu nhận 
CoQ10 cao hơn so với các phương pháp khác được sử dụng. Tương tự như những vi 
khuẩn Gram âm khác, A. tumefaciens có chứa một lớp màng trong và màng ngoài 
mỏng do đó dưới tác động của ethanol sẽ làm các tương tác kỵ nước trên màng bị yếu 
đi dẫn đến cấu trúc màng tế bào bị phá vỡ và giải phóng các thành phần nằm trên 
màng hoặc trong màng ra môi trường. Vì vậy, phương pháp xử lý tế bào bằng ethanol 
đã được lựa chọn để tiếp tục nghiên cứu tối ưu và sử dụng trong các nghiên cứu tiếp 
theo. 
14 
Hình 3.12.Các phương pháp xử lý phá vỡ tế bào 
3.5.2. Xác định điều kiện xử lý tế bào bằng ethanol 
3.5.2.1. Xác định tỷ lệ ethanol/sinh khối 
Kết quả cho thấy hàm lượng CoQ10 được chiết xuất tăng lên khi tỷ lệ 
ethanol/sinh khối tăng (hình 3.13A). Khi so sánh hàm lượng CoQ10 thu được với các 
tỷ lệ chiết khác nhau cho thấy tỷ lệ 10:1 cao hơn 1,32 lần (tương đương 24,3%) so 
với tỷ lệ 5:1, trong khi đó hàm lượng CoQ10 thu được ở tỷ lệ 15:1 chỉ cao hơn so với 
tỷ lệ 10:1 là 1,08 lần. Từ kết quả thu được tỷ lệ ethanol/sinh khối (10 ml/g) sẽ được 
sử dụng để tách chiết CoQ10 trong các nghiên cứu tiếp theo. 
3.5.2.2. Xác định thời gian đồng hóa 
Kết quả hình 3.13B cho thấy hàm lượng CoQ10 thu được tăng lên khi thời gian 
đồng hóa tăng và đạt cao nhất ở thời gian 3 phút. Tuy nhiên khi thời gian đồng hóa 
tăng tiếp thì hiệu quả thu hồi CoQ10 lại giảm. Sự giảm này có thể là do tác động của 
sóng siêu âm trong thời gian dài đã làm phá hủy cấu trúc của CoQ10. 
3.5.2.3. Xác định nhiệt độ xử lý 
Kết quả hình 3.13C cho thấy khi nhiệt độ ủ tăng lên thì hàm lượng CoQ10 thu 
được cũng tăng (1,15 và 1,17 lần ở 37 oC và 60oC tương ứng so với điều kiện 25oC. 
Từ kết quả nhận được, chúng tôi thấy rằng nhiệt độ 37oC là phù hợp để thực hiện xử 
lý tế bào bằng ethanol. 
Từ các kết quả thu được trong nghiên cứu này, quy trình tách chiết CoQ10 từ 
sinh khối A. tumefaciens đã được xác lập và mô tả tóm tắt như sau: trộn sinh khối vi 
khuẩn với ethanol 100% theo tỷ lệ 10:1 (v/w), đồng hóa bằng siêu âm 3 phút, ủ ở 
nhiệt độ 37oC trong 3 giờ, ly tâm loại bỏ xác tế bào, chiết với hexane theo tỷ lệ 1:1, 
cô đặc chân không ở 45oC. 
0.00
0.10
0.20
0.30
0.40
0.50
0.60
Siêu âm HCl EtOH Enzyme
C
O
Q
1
0
 (
m
g
/g
) 
Phƣơng pháp xử lý tế bào 
15 
Hình 3.13. Ảnh hưởng của tỷ lệ ethanol/sinh khối (A), thời gian đồng hóa (B), nhiệt độ xử lý (C) 
đến hàm lượng CoQ10 tách chiết từ A. tumefaciens tái tổ hợp. 
3.5.3. Nghiên cứu tinh sạch Coenzyme Q10 
3.5.3.1. Đánh giá so sánh độ sạch của dịch chiết Coenzyme Q10 
CoQ10 thu được theo quy trình trên được phân tích và định lượng trên hệ thống 
HPLC với các điều kiện sắc ký như sau: Pha động A: Metanol 100%. Pha động B: 
Ethanol 100%. Cột C18 kích thước 250 mm x 4 mm nhồi hạt với kích thước 5μm. 
Nhiệt độ cột 35oC, tốc độ dòng 0,5 ml/phút, thể tích tiêm 10 μl, detector UV – Vis tại 
bước sóng 275 nm. Kết quả được thể hiện trên hình 3.14A, 3.14B 
 Hình 3.14. Phổ sắc ký HPLC của CoQ10 chuẩn (A) và dịch chiết từ A. tumefaciens tái tổ hợp (B) 
Kết quả cho thấy với bước sóng hấp thụ cực đại của CoQ10 (275 nm), chỉ thấy 
xuất hiện một số đỉnh phụ rất nhỏ so với đỉnh chính CoQ10 trên phổ sắc ký HPLC. 
So sánh với phổ CoQ10 chuẩn của hãng Sigma có thể thấy rằng dịch chiết CoQ10 là 
tương đối sạch khi so sánh ở bước sóng 275 nm. 
Tuy nhiên, trong dịch chiết còn có thể có chứa các hợp chất khác không hấp 
thụ cực đại tại bước sóng 275 nm. Do đó để đánh giá độ sạch, dịch chiết được phân 
tích bằng phương pháp quét phổ với bước sóng từ 200 – 800 nm và so sánh với 
CoQ10 chuẩn. Kết quả cho thấy phổ hấp phụ của dịch chiết CoQ10 và CoQ10 chuẩn 
đều xuất hiện một đỉnh hấp thụ cực đại ở bước sóng 275 nm, đây chính là đỉnh 
CoQ10. Khi so sánh phổ hấp thụ này so với dịch CoQ10 chuẩn chúng tôi thấy hoàn 
toàn tương tự. Tuy nhiên, ngoài đỉnh chính (bước sóng 247 – 309) thì cường độ hấp 
0
0.1
0.2
0.3
0.4
0.5
0.6
0.7
0.8
5:1 10:1 15:1
C
o
Q
1
0
 (
m
g
/g
) 
Tỷ lệ ethanol/sinh khối 
(ml/g) 
0
0.2
0.4
0.6
0.8
1
1 2 3 5 10 15
C
o
Q
1
0
 (
m
g
/g
) 
Thời gian (phút) 
0
0.2
0.4
0.6
0.8
1
25 37 60
C
o
Q
1
0
 (
m
g
/g
) 
Nhiệt độ (oC) 
A 
B 
C 
A 
B 
16 
thụ dịch chiết CoQ10 cao hơn so với CoQ10 chuẩn (hình 3.15), điều đó chứng tỏ 
trong dịch chiết vẫn còn lẫn tạp chất. Phân tích tổng thể phổ hấp thụ (ngoại trừ đỉnh 
CoQ10) cho thấy cường độ hấp thụ của mẫu CoQ10 tách chiết cao hơn 2,59 lần so 
với CoQ10 chuẩn. 
Hình 3.15. So sánh độ sạch của dịch chiết CoQ10 và CoQ10 chuẩn. (L1) dịch chiết CoQ10 từ sinh 
khối vi khuẩn, (S) dịch CoQ10 chuẩn 
3.5.3.2. Nghiên cứu tinh sạch Coenzyme Q10 theo phương pháp chiết bằng 
dung môi 
Trong nghiên cứu này, hệ dung môi để chiết tinh sạch CoQ10 là ethanol:hexane 
theo tỷ lệ 1:1 về thể tích. Dịch chiết CoQ10 với các lần chiết khác nhau: 1, 2, 3 được 
phân tích bằng phương pháp quét phổ với bước sóng từ 200 – 800 nm. Kết quả so 
sánh phổ hấp thụ dịch chiết thu được tương ứng với số lần chiết cho thấy cường độ 
phổ hấp thụ của dịch chiết với 3 lần chiết thấp hơn khoảng 3,25 lần so với 1 lần chiết 
và 1,62 lần so với 2 lần chiết (hình 3.16A). Điều đó chứng tỏ dịch chiết CoQ10 với 3 
lần chiết sạch hơn so với 1 và 2 lần chiết. 
Hình 3.16. Phổ hấp thụ dịch chiết CoQ10 theo số lần chiết khác nhau (A). So sánh độ sạch của dịch 
tinh sạch CoQ10 và CoQ10 chuẩn. L1 dịch chiết CoQ10 từ sinh khối vi khuẩn sau 1 lần chiết, L3, 
dịch chiết CoQ10 sau 3 lần chiết, S dịch CoQ10 chuẩn (B) 
0.0
0.5
1.0
1.5
2.0
2.5
3.0
200 250 300 350 400 450 500 550 600 650 700 750 800
C
ư
ờ
n
g
 đ
ộ
 h
ấ
p
 t
h
ụ
Bước sóng (nm) 
L1 S
0.0
0.5
1.0
1.5
2.0
2.5
3.0
200 250 300 350 400 450 500 550 600 650 700 750 800
C
ư
ờ
n
g
 đ
ộ
 h
ấ
p
 t
h
ụ
Bước sóng (nm) 
L1 L2 L3
0.0
0.5
1.0
1.5
2.0
2.5
3.0
200 250 300 350 400 450 500 550 600 650 700 750 800
C
ư
ờ
n
g
 đ
ộ
 h
ấ
p
 t
h
ụ
Bước sóng (nm) 
L1 L3 S
A 
B 
17 
Tiến hành phân tích phổ hấp thụ của dịch tinh sạch và so sánh với phổ hấp thụ 
CoQ10 chuẩn. Kết quả phổ hấp thụ ở bước sóng 309 – 800 nm của dịch chiết sau 3 
lần chiết có sự giảm rõ rệt và gần tương đương như cường độ hấp thụ của dịch 
CoQ10 chuẩn. Trong giải bước sóng 309 – 800 nm, cường độ hấp thụ giảm từ 5,46 
lần (đối với dịch chiết 1 lần chiết) xuống còn 1,93 lần (đối với dịch chiết 3 lần chiết) 
so với dịch CoQ10 chuẩn. Phân tích tổng thể, cường độ hấp thụ giảm từ 2,59 xuống 
1,91 đối với dịch chiết 3 lần chiết lần so với CoQ10 chuẩn. Từ kết quả thu được cho 
thấy phương pháp chiết bằng 3 lần chiết đã thu được dịch chiết CoQ10 sạch hơn đặc 
biệt là loại bỏ được các tạp chất hấp thụ ở bước sóng từ 309 – 800 nm. Phương pháp 
này tương đối đơn giản và sử dụng hệ dung môi rẻ không độc hại nên có thể được áp 
dụng ở quy mô lớn để tách chiết và tinh sạch CoQ10. 
3.5.3.3. Nghiên cứu tinh sạch Coenzyme Q10 theo phương pháp sắc ký lọc 
gel qua cột silica 
Trong nghiên cứu này, dịch chiết CoQ10 sau 3 lần chiết được tiếp tục tinh sạch 
sử dụng sắc ký cột silica gel. Kết quả cho thấy cường độ phổ hấp thụ của dịch CoQ10 
sau khi tinh sạch bằng sắc ký cột silica giảm đi ở cả hai vùng bước sóng 200-248 nm 
và 309-800 nm. Cường độ hấp thụ trong dải bước sóng 200-248 nm giảm khoảng 
13% sau khi tinh sạch; trong khi đó cường độ hấp thụ trong dải bước sóng 109 – 
800nm giảm 58%. Phân tích tổng thể cho thấy cường độ hấp thụ giảm đi khoảng 24 
% trong mẫu tinh sạch bằng silica gel (hình 3.17). 
Hình 3.17. So sánh độ sạch của dịch tinh sạch CoQ10 và CoQ10 chuẩn. L3, dịch chiết CoQ10 từ 
sinh khối vi khuẩn sau 3 lần chiết; E1, dịch CoQ10 sau khi tinh sạch bằng sắc ký cột silica gel; S, 
dịch CoQ10 chuẩn 
0.0
0.5
1.0
1.5
2.0
2.5
3.0
200 250 300 350 400 450 500 550 600 650 700 750 800
C
ư
ờ
n
g
 đ
ộ
 h
ấ
p
 t
h
ụ
Bước sóng